JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה להקמת עכברים הומניזציה עם מערכת החיסון האנושית ותאי הכבד. השני עכברים לקויה מחדש השיגה באמצעות הזרקה התוך הטחול של האדם hepatocytes ו CD34+ תאי גזע המטרופאיות רגישים לנגיף הכשל החיסוני האנושי-1 זיהום ונזק הכבד לכידה כפי שנצפתה ב . חולים נגועים באיידס

Abstract

למרות תוחלת החיים המוגבר של חולים נגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי-1 (HIV-1), מחלת הכבד התפתחה כגורם נפוץ של התחלואה שלהם. הכבד immunopathology הנגרמת על ידי HIV-1 נשאר חמקמק. מודלים בעלי חיים קטנים של השתלה עם המעי האנושי ומערכת החיסון האנושית יכולים ללכוד את הביולוגיה האנושית של הפתוגנזה של המחלה. בזאת, פרוטוקול מתואר כדי להקים מודל הומניסטי כפול העכבר באמצעות האדם hepatocytes ו CD34+ המטפאות גזע/מחולל קדמון תאים (HSPCs) השתלת, כדי ללמוד הכבד immunopathology כפי שנצפתה בחולים נגועים באיידס. כדי להשיג החוקה הכפולה, זכר TK-חעוגה (נוד. Cg-prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg (Alb-TK) 7-2/ShiJic) עכברים הם intraperitoneally וזרק עם ganciclovir (gcv) מינונים כדי לחסל את תאי הכבד טרנסגניים העכבר, עם treosulfan עבור מיזוג nonmyeloablative, שניהם להקל על מערכת החיסון האנושית של המערכת החיסונית (שלו). רמות אלבומין האנושי (ALB) מוערכות עבור מינון הכבד, והנוכחות של תאי החיסון האנושיים בדם שאותרו על ידי הזרימה cy, try מאשרת את הקמתה של המערכת החיסונית האנושית. המודל פיתח באמצעות פרוטוקול המתואר כאן דומה רכיבים מרובים של נזק לכבד מזיהום HIV-1. הקמתה יכולה להוכיח להיות חיוני למחקרים של דלקת וירוס הפטיטיס ושיתוף הערכה של תרופות אנטי ויראליות ואנטי.

Introduction

מאז הופעתו של טיפול תרופתי, יש כבר ירידה משמעותית במקרי מוות הקשורים HIV-1 monoinfection. עם זאת, מחלת כבד התפתחה כגורם נפוץ של תחלואה בחולים נגועים ב-HIV1,2. זיהומים הפטיטיס של וירוסי צהבת עם hiv-1 זיהום נפוצים יותר, חשבונאות עבור 10%-30% של אנשים נגועים באיידס בארצות הברית3,4,5.

המארח-ספציפיות של HIV-1 ווירוסים צהבת מגביל את השירות של מודלים בעלי חיים קטנים כדי ללמוד מחלות זיהומיות אדם ספציפי או לחקור היבטים מרובים של הפתוגנזה הקשורים בכבד HIV-1. עכברים לקויה המאפשרים את החרט של תאים אנושיים ו/או רקמות (כינה מודלים של עכברים הומניזציה) הם מודלים בעלי חיים מקובלים עבור מחקרים קדם-קליניים6,7,8. מאז המבוא של עכברים הומניזציה בתחילת שנות האלפיים, מחקרים פרה-קליניים מרובים של רעילות הכבד האנושי, פתוגנים אנושיים, כולל HIV-1 ו-HIV הקשורים הפרעות נוירוקוגניטיביות, וירוס אפשטיין בר, צהבת, ועוד מחלות זיהומיות, נחקרו אלה עכברים6,9,10,11. מודלים של עכבר מרובים עבור CD34+ hspcs ו/או השתלת hepatocyte האדם כבר זמן רב פותחו ושופרו לאורך זמן כדי ללמוד את הפתוגנזה המחלה של הפטיטיס B וירוס (hbv)-הקשורים מחלת הכבד12, מיכל בן 13 , 14. מספר דגמים עבור hspc ו hepatocyte האדם (הפטיטיס) השתלת מבוססים על זנים, המכונה חעוגה (נוד. Cg-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, nsg (הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, balb/C-Rag2- γc-/- (Rag2tm 1.1 flv Il2rgtm 1.1 flv/j)12, ו-פה-/- הנהון rag1-/- il2rγnull העכבר16. עם זאת, לכל דגם יש יתרונות ומגבלות משלו; לדוגמה, AFC8 עכברים כפולים הומניזציה עבור HEPs ותאי גזע האדם (HSCs) ב Balb/C-Rag2- γc-/- רקע מאפשר את החרט המוצלח של תאים חיסוניים ו HSCs, אבל יש העדר של אנטיגן ספציפי T-ו-B-cell תגובה במודל12זה. החששות העיקריים במרכיבי עכברים הומניזציה כפולה כוללים בתאום מחדש, חוסר מודלים מתאימים לתמוך ברקמות שונות, תנאים לא תואמים, דחייה החיסונית, או השתל-מול-מארחים מחלה (gvhd), וטכני קשיים, כגון מניפולציות מסוכן עם ילודים ושיעורי תמותה גבוהים בשל חריגות מטבולית13.

למרות עכברים הומניזציה שימשו למחקר HIV במשך שנים רבות17,18,19, השימוש של עכברים הומניזציה ללמוד נזק לכבד שנגרם על ידי HIV-1 כבר מוגבל20. בעבר דיווחו על הקמתה של הומניזציה כפולה TK-חעוגה מודל העכבר ויישומו במחלת הכבד הקשורים ל-HIV8. מודל זה מראה את החרט החסון של הכבד ואת התאים החיסוניים ולכידה הפתוגנזה זיהום HIV. דיון זה מציג פרוטוקול מפורט, כולל הצעדים הקריטיים ביותר בהשתלה של הפטוציטים אנושיים. תיאור של HSPCs נדרש העפיל מוצלחת של HEPs והקמת מערכת חיסונית תפקודית ב-TK-חעוגה עכברים מוצגים גם. השימוש בעכברים אלה כדי ללמוד immunopathogenesis הכבד הקשורים לאיידס מפורט. TK-חעוגה עכברים זכרים נושאים את הכבד הספציפי הרפס וירוס סוג 1 תימידין קינאז (HSV-TK) טרנסגנטית משמשים. כדוריות הכבד של העכבר ביטוי זה יכול בקלות להיות בלתי מבוקר לאחר חשיפה קצרה למינון רעיל של GCV. תאים המושתלים בכבד האדם נשמרים באופן בלתי נשכח בתוך הכבד של העכבר ללא תרופות אקסוגני21. העכברים הם גם ממוזג עם מינונים nonmyeloablative של treosulfan ליצור נישה במח העצם העכבר עבור תאים אנושיים8. חעוגה לקויה-הזרקת טי-טי-טי. העכברים מנוטרים לאחר מכן באופן סדיר עבור מחדש דם והכבד החוקה על ידי immunophenotyping קלדה ומדידות של סרום ברמות אנושיות-אלבומין, בהתאמה. עכברים עם חוקה מוצלחת של יותר מ 15% עבור תאי החיסון האנושיים ו-HEPs הם intraperitoneally וזרק עם HIV-1. ההשפעה של HIV על הכבד ניתן להעריך מוקדם ככל 4-5 שבועות לאחר ההדבקה. חשוב לציין כי בגלל HIV-1 נעשה שימוש, כל אמצעי הזהירות הדרושים יש לנקוט בעת טיפול בווירוס והזרקת אותו לתוך עכברים.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.

הערה: קבל אישור IACUC המקומי לפני ביצוע ניסויים על בעלי חיים.

1. עיבוד דם חבל הטבור ובידוד האדם העברי

  1. בצע את כל השלבים של הפרוטוקול תחת תנאים סטריליים בארונות זרימה למינארי.
  2. קח דם חבל הטבור (CB) שנאסף בצינורות heparinized ולעשות את הנפח עד 35 mL על ידי הוספת מלוחים באגירה פוספט (PBS). שכבה את המדגם על גבי בינונית הפרדת לימפוציטים (LSM) כפי שמודגם באיור 1 ו צנטריפוגה את LSM עם CB שכבתית ב 400 x g עבור 35 דקות ב 4 ° c ללא בלמים.
    הערה: מדלל את הדם בזהירות ובעדינות כדי להימנע מערבוב בממשק.
  3. הסר את LSM העליון ואת שכבת הפלזמה בזהירות להעביר את הממשק הלבן מעיל באפי לצינור חדש באמצעות העברה פיפטה.
  4. השהה מחדש את מעיל באפי ב-30-40 מ ל של מאגר קר-קרח (PBS + 0.5% בסרום של חומצה ביורית [BSA] + 2 ממ מ של חומצת החומץ [EDTA]). באמצעות פיפטה, לשלב 20 μL של השעיית התא עם 20 μL של 0.4% טרימטר כחול ופיפטה 10 μL של התערובת לתוך הפתח החיצוני של אחד משני התאים של שקופית ספירה ולהוסיף את השקופית בונה התא האוטומטי כדי לספור את התאים.
    הערה: השתמש מאגר קר קרח בכל השלבים, כפי שהוא מסייע לשמור על התאים קיימא.
  5. צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c ומכה את הסופרנטנט בזהירות. לאחר מכן, הוסף 300 μL של מאגר קר-קרח.
  6. הוסף 100 μL של האדם חסימת קולטן Fc מגיב ו 100 μL של עכבר חד שבטיים אנטי אדם CD34 נוגדן מיקרו חרוזים עבור עד 1 x 108 תאים (לראות את הטבלה של חומרים). דגירה עבור 30 דקות ב 4 ° צ', להוסיף 10 מ ל של מאגר קר קרח כדי לשטוף את התאים, ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c.
    הערה: קנה מידה זה לפי מספר הטלפון אם קיימים יותר מ-1 x 108 תאים.
  7. הסר בזהירות את הסופרנטאנט, השהה מחדש את הגלולה ב-500 μL של המאגר, והמשך בשלב ההפרדה המגנטי כדי להעשיר את HSPCs.
  8. מקם עמודת LS בחירה חיובית (ראה את טבלת החומרים) בשדה המיון של תא מגנטי המופעל והעבר אותו באמצעות 3 מ ל של מאגר.
  9. טען את המדגם לעמודת LS שיכולה להיות מיקרוחרוזים הקשורים לCD34 האנושית + בדגימות ולאפשר לו לזרום תחת השפעת הכבידה לתוך צינור הגבייה.
  10. שטוף את העמודה 3x עם מאגר ולאסוף את האלט באותה שפופרת אוסף של CD34- חלק של תאים.
  11. לצלול את העמודה עם 5 מ ל של מאגר כדי להפוך את CD34+ תאים לתוך צינור אוסף חדש. חזור על ההליך כדי להשיג טוהר של > 90%.
  12. לספור את התאים CD34+ באמצעות טרימיה צבע כחול ב הומוציטוטומטר. לאחר ספירה, צנטריפוגה את CD34+ תאים ב 300 x g עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant.
  13. השהה מחדש את CD34+ תאים ב 25 ΜL של PBS לזריקה לשמש מיד השתלת או cryopreserve התאים בריכוז של 1-2 מיליון/mL בהקפאה בינונית (רוזוול פארק הזיכרון בינוני המכון [RPMI 1640 בינוני] + 50% העובר סרום שור (FBS) + 10% diמתיל סולפוקסיד [DMSO]) לשימוש נוסף בהשתלה.
    הערה: תמיד לספור תאים קיימא לפני השימוש בהם השתלת.
  14. כדי לבדוק את הטוהר של CD34+ elute לקחת 50 μl של ההשעיה ו-דגירה אותו עם 10 μl של מצו אנטי אדם נוגדן CD34 עבור 30 דקות ב 4 ° c. לאחר הדגירה של נוגדן, לשטוף את התאים המוכתמת עם PBS, להשעות אותם מחדש ב-100 μL של PBS, ולאחר מכן, להמשיך לבצע את cy, הזרימה. הוסף שפופרת נוספת של תאים ללא נוגדן כדי לעצב את השער של הזרימה cytometer.
  15. לאחר הרכישה, נתח את הנתונים על-ידי בחירת אזור הריבית בחלקה של פיזור (FSC) ופיזור בצד (העברה לפני הקרקע), ואחריו באמצעות מעבר עבור תאים בודדים בחלקות FSC-area ו-FSC-height. שער CD34-תאים חיוביים בתאים בודדים בערוץ PE ומגרש באזור המרכז לחיוב.

2. הכנת הפטציטים אנושיים להשתלה

  1. הסר את הקריוציטים שמורות מן החנקן הנוזלי, במהירות להטביע את הבקבוקון באמבט מים, ולהפשיר כ 90-120 s.
  2. הסירו את כובע המבחנה ויוצקים את ההיפציטים המופשות לתוך השפופרת החרותית ה50 mL של המדיום החומם.
  3. להשעות את התאים על ידי הנדנדה את הצינור 50 mL ביד כמה שניות.
    הערה: . אל תעשה מערבולת בצינור
  4. גלולה את התאים ב 100 x g עבור 8 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים מפלטד ב-PBS עם 0.1% BSA ובריכה אותם עם החדש או המוסדר HSPCs (יחס 10:1) ב-PBS בנפח הסופי של 80 μL/עכבר.

3. טיפול בבעלי חיים, הקרנה, הגנוהקלדה, טיפול באמצעות השתלת האדם HSPC והפטציט

  1. טיפול בבעלי חיים
    1. כתוצאה של כשל חיסוני חמור, גזע, בית, ולטפל TK-חעוגה עכברים תחת תנאים אספטי.
    2. תמיד ללבוש חלוק מעבדה, כפפות, כיסויי נעליים, ומסכת פנים כדי למנוע זיהום עם מיקרואורגניזמים הפתוגניים פוטנציאלי.
    3. השתמש כפפות סטרילי וכלים לניתוח ולהתמודד עם בעלי החיים באופן כאוסטי לאורך הניתוח.
  2. בחירה בעכבר TK-חעוגה עבור הניסוי
    1. שמרו על מושבת הזנים TK-חעוגה באמצעות רבייה של עכברים מסוג TK-חעוגה עם גברים שאינם מסוג TK-חעוגה, ובחרו צאצאים מבוססי-מגנטית.
      הערה: ביצוע הגנואיות (ראה שלב 3.3) כדי לקבוע את הנוכחות או העדר של הטרנסגנים אצל גברים ועכברים היילוד והנשיים בזמן הגמילה.
    2. גברים לבחור ב 6-8 שבועות של גיל עבור השתלת עקב רגישות גבוהה שלהם GCV-בתיווך המחסור של HSV-TK-המבטא הפטוציטים21.
    3. האוזן לתייג את העכברים בזמן הגמילה או ניתוח כדי להקל על הזיהוי. שימו לב למצב המשקל והבריאות של החיות.
  3. ג'נויוקליד לנוכחות של ה-HSV-TK טרנסגנטית באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותיים בזמן אמת
    1. ביצוע הגנוזה בזמן הגמילה (בדרך כלל ב 3-4 שבועות של גיל). עבור הגנוזה, חותכים פיסת האוזן של העכבר בארון למינארי בטיחות ביולוגית כדי לשמור על עקרות לחלץ דנ א גנומית באמצעות ערכת DNA הבידוד של גנומית.
    2. להגביר את ה-DNA גנומית שחולצו מתוך האוזן פיסת התגובה 20 μL למסך עבור HSV-TK transgene תחת שליטה של מיזם אלבומין האנושי על ידי הוספת 1 μL של פריימר קדימה 5 '-CCATGCACGTCTGG-3 ', 1 μL של פריימר הפוכה 5 '-TAAGTTGC4-3 ', 0.5 μL של משפחה בדיקה 5 ′-משפחה-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3 ', ו 10 μL של מיקס בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מכשיר22.
    3. הגדר את הגדרות ה-PCR בזמן אמת כדלקמן: 60 ° c עבור 30 s (השלב preread), 95 ° צ' עבור 10 דקות (להחזיק בשלב), 40 מחזורים של 95 ° צ' עבור 15 s ו-60 ° c עבור 1 דקות (ה-PCR שלב), ו-60 ° c עבור 30 (שלב).
      הערה: מחזור של הסף (Ct) מתחת 22 נחשב חיובי עבור HSV-TK transgene.
  4. טיפול באמצעות ganciclovir ו treosulfan
    1. שימוש 27 G מחט, להזריק את ה-TK-חעוגה עכברים עם זריקות GCV הצפק (6 מ"ג/ק"ג) 2x ביום ביום 7 וביום 5 ב 100 μL של תמיסת מלח לפני הניתוח כדי לרוקן את התאים הטרנסגניים של העכברים (כפי שמוצג באסטרטגיה ניסיוני באיור 2)23 .
    2. בימים 3, 2, ו 1 לפני הניתוח, עכברים התנאי עם מינונים הצפק nonmyeloablative של treosulfan (1.5 g/ק ג/יום) ב 100 μL של תמיסת מלח, באמצעות המחט 27 G.
    3. יום אחד לפני הניתוח, לצייר 2 עד שלוש טיפות (~ 100 μL) של דם מתוך וריד הלסת התחתונה על ידי החירור זה עם 5 מ"מ ליטר, ולבודד את הסרום על ידי תפרידו (1,500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c) בשביל אלטין עמינח (ALT) שיטת להעריך את הדגל נזק כבד
  5. הכנה לניתוח
    1. השימוש קוצץ לגלח את הפרווה של העכבר מסביב לאתר החתך (משמאל לקיר הצפק) לפני הניתוח.
    2. כוונן את זרימת החמצן ל-1 L/min וזרימת isofלאנה ל-3%-5% בחדר אינדוקציה באמצעות מכונת הרדמה לעכבר. מניחים עכבר אחד בכל פעם בתא אינדוקציה להרדמה.
    3. לצרף את קצה אחד של צינור הארכה סטרילי (עם קיבולת מחזיק של 550 μL של השעיה; לראות את הטבלה של חומרים מפרטים) כדי המחט 30 גרם והקצה השני ל 1 מזרק mL.
    4. למלא את המזרק עם ההשעיה (80 μL/עכבר) של HEPs במאגר ו-HSPCs (ראה סעיף 2), להתאים את המזרק בחריץ של מתקן הצינורות החוזרים על עצמו, ולהתאים את המינפק כדי לחלק 10 μL בכל העיתונות.
    5. לאחר העכברים מורדם (בדרך כלל לאחר 3-4 דקות), להחליף את זרימת isof, כדי לחרוט את האף ולהפחית את קצב הזרימה isofלאנה 2%-3%.
  6. השתלת הטחול של האדם האנושי והפטציטים בעכברים
    1. בצע את כל צעדי הניתוח בתוך ארון זרימה למינארי בתנאים סטריליים.
    2. מניחים כוית סטרילי נקי על פני השטח העבודה לשפשף את הצד השמאלי של הגוף של כל עכבר עם 10% povidone-יוד ואחריו 70% אלכוהול איזופרופיל, לפני ביצוע חתך.
    3. לעשות חתך קטן (~ 1-1.5 ס מ אורך ו 5 מ"מ עמוק) בעור, שריר, ו צפק בשמאל הקיר הצפק עם מספריים סוג של Vanna להיכנס חלל הצפק בערך 5 מ"מ מתחת לקצה התחתון של כלוב הצלעות.
    4. אתר את הטחול, למשוך אותו מעט עם מלקחיים לאזור ההפעלה עבור גישה קלה, ולהכניס את המחט 30 G לתוך הקוטב התחתון של הטחול.
    5. לפתוח את הבוכנה של הפיפטה מחילוק ולחלק 10 μL של נפח בכל פעם, עם מגבלה של 60-80 μL לכל הטחול. למשוך את המחט לאט ולחתוך את הטחול עם ליגגדירוג קליפים באמצעות אפליקציה לחיבור.
    6. לדחוף את הטחול בחזרה לחלל הגוף עם כותנה מכשיר מוכשירי מוטורים עם PBS סטרילי.
    7. סגרו את שכבת השריר של קיר הבטן בעזרת תפר נספג שנקטע בצורת תפר (לא רציפה). לבצע סגירת העור עם דפוס תפר מקוטע באמצעות תפרים שאינם נספגים.
    8. השימוש רפידות מים חמים מחזורי כדי להגן על עכברים מפני היפותרמיה לאחר הניתוח.
    9. הסרת תפרים שאינם נספגים 10-14 ימים לאחר הניתוח.
  7. טיפול פוסט-פעיל
    1. כאשר בעלי החיים המושתלים, להזריק בופריאנטין כאבים (0.1 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally, 2x ביום ברציפות 3 ימים.
    2. צפו בחיות לפחות 1 x ביום עד שהם חוזרים לתנאים פיזיים נורמליים.
      הערה: בדוק כל משקל הגוף של בעל חיים, מאז כמה עכברים עלולים לאבד משקל הניתוח. עכברים בדרך כלל להחזיר את המשקל המקורי שלהם 1 עד 2 שבועות.

4. בתאום ואלידציה של הכבד האנושי על ידי אליסה והמערכת החיסונית של האדם על ידי זרם Cy, לנסות

הערה: הערכת מחדש את החוקה של הכבד האנושי ואת המערכת החיסונית חודשית, החל 1 חודש השתלת מערכת החיסון הקשורות לאנזימים הקשורים לאנזים (אליסה) ולזרימה cy, בהתאמה.

  1. איסוף דגימות דם מווריד הלסת התחתונה באמצעות אזמלי בצינורות EDTA, ו צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. לבודד סרום לבדוק רמות אלבומין האנושי כדי להעריך את היעילות של העכבר על הכבד המושתלים האדם hepatocytes, באמצעות אלבומין האדם אליסה להגדיר (לראות את הטבלה של חומרים) על ידי ביצוע היצרן של וראות.
    הערה: אין להשליך את הגלולה ולהשתמש בתאי מפלטד עבור הניתוח cy, הזרמת הגוף כדי להעריך את המערכת החיסונית האנושית מחדש.
  2. להשעות מחדש את הגלולה תא ללא סרום ב 35 μL של מאגר FACS (PBS + 2% FBS) ומוכתם עם 5 μL של העכבר ספציפי CD45 (ריכוז 0.5 mg/mL), 5 μL כל אחד של נוגדנים ספציפי לאדם CD45 (0.1 mg/mL), CD3 (0.2 mg/mL), CD8 (0.1 mg/mL), CD19 (0.5 mg/mL) , ו 20 μL של CD4 (0.25 מ"ג/mL) ו CD14 (0.25 mg/mL) כל אחד עבור 30 דקות ב 4 ° c, כדי לבדוק את הפיתוח של מערכת חיסונית תפקודית מ CD34+ hspcs.
    הערה: שקול להוסיף צינור אחד נוסף של תאים לא מוכתמים כדי לקבוע את החסימה של התאים המוכתמת.
  3. לאחר הדגירה, להעביר את ההשעיה המוכתמת (~ 100 μL) בתוך פוליסטירן עגול התחתון הזרימה cy, הצינור להשתמש 2 מ ל של 1x מאגר הליזה (לראות את הטבלה של חומרים) על ידי דילול חלק 1 של מאגר הליזה 10x עם 9 חלקים של מים מזוקקים ו הדגירה 10- 15 דקות כדי לצפות בתאי דם אדומים.
    הערה: לצפות בעכירות כדי להעריך את הפירוק של תא הדם האדום. לאחר המדגם הופך להיות ברור, הליזה הושלמה.
  4. לאחר הליזה, להוסיף 3 מ ל של מאגר FACS בצינור, צנטריפוגה ב 300 x g ב 4 ° צ' עבור 5 דקות כדי לקבל גלולה. חזור על הכביסה על ידי הוספת 3 מ ל של מאגר FACS כדי הגלולה ואת הצנטריפוגה ב 300 x g ב 4 ° c עבור 5 דקות.
  5. תקן את התאים בתוצרת טרייה 1% פאראפורמלדהיד (בתוך הרחוב) ולרכוש תאים ויטראז על cytometer מנותח עם תוכנת זרימה.
  6. לניתוח, בחר באפשרות לימפוציטים על גבי מגרש FSC/המרכז למעקב, ולאחר מכן הפעלת תא בודד על FSC-אזור/FSC-גובה.
  7. נוסף על כך, שער לCD45 ספציפי לאדם (hCD45) על האוכלוסיה בעלת תא יחיד וכולל CD45 העכבר הספציפי (mCD45) לאי הכללה של תאים ממוצא מוראי. אסטרטגיה של האוכלוסייה המוכתמת המבוססת על החסימה של תאים לא מוכתמים.
  8. Gate hCD45+ תאים כדי לקבוע את תדירות CD3+ T תאים ו CD19+ B תאים. תאי שער T כדי לקבוע תת-ערכות של CD4 ו-CD8. כדי להעריך את המונולוציטים, השער ב-hCD45 כדי לקבוע CD14+ מונוציטים.

5. HIV זיהום של TK-חעוגה עכברים השפעתו על הכבד האנושי מערכת החיסון

  1. לטפל בווירוס HIV-1 ואת כל העכברים נגועים במתקן ביולוגי ברמת בטיחות מיועד 2.
    זהירות: אוטוקלב ולהיפטר כל פסולת HIV נגוע בשקיות בידוד כפול. מטעמי בטיחות, ללבוש כפפות עמיד לחתוך תוך מתן עכברים נגועים באיידס.
  2. ללבוש ציוד הגנה אישית (PPE), כולל כיסוי חד פעמי כל שמלת, הנעל מכסה, מסכת פנים, וכפפות כפולות בכל עת תוך כדי עבודה עם הווירוס.
  3. עכברים לבחור עם החוקה של יותר מ 15% של האדם CD45+ תאים (נבדק בשלב 4.7) ועם נוכחות של אלבומין האנושי בסרום לזיהום HIV-1 (נבדק בשלב 4.1).
  4. הכנס את העכברים עם 1 x 103 אל 1 x 104 תרבות רקמה מינונים זיהומיות 50 (tcid50) HIV-1ADA בנפח של 100-200 μl לכל עכבר, intraperitoneally.
  5. המתת חסד העכברים נגועים 5 שבועות לאחר הפגיעה באמצעות isofלאנה (עם האדים הריכוז של ה> 5%).
  6. לאחר המתת החסד של העכברים, לאסוף דם צינורות EDTA על ידי ניקוב לב לבידוד של סרום, כדי לראות את ההשפעה של HIV-1 על הכבד על ידי הערכת רמות אלבומין ספציפי לאדם על ידי אליסה (ראה שלב 4.1) ותאי דם כדי לבדוק שינויים החיסון האנושי תאים באמצעות הזרמת cy, (ראה שלבים 4.2-4.8).
    הערה: להעריך את העומס נגיפי היקפי 5 שבועות לאחר ההדבקה על bioanalyzer כדי לאשר אם העכברים נגועים.
  7. לאחר שציירו דם, בלו את הכבד. מעכברי הורדמים
  8. עבור כריתה הכבד, לחשוף את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך של 1.5-2 ס"מ ארוך ו 0.5 ס"מ עמוק בעור, השרירים, ו צפק, מן xyphoid. לעשות חתך בניצב לעמוד השדרה בין הכבד לסרעפת. הרימו את הכבד והסירו את כל הקרומים הללו לבטן ולמעיים.
  9. לאסוף ולתקן את הכבד ב 4% פאראפורמלדהיד לילה ופעל פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטיים כדי להעריך את ההשפעה של HIV על CK18+ hepatocytes באמצעות האדם ספציפי CK18 נוגדן8.

תוצאות

הקמתה של מודל עכבר כפול הומניזציה עם הכבד האנושי ותאים חיסוניים ניתן לפקח בקלות בכל שלב עם אליסה פשוטה מאוד וזרימה cy, בהתאמה. Cy, הזרמת הזרימה מבוצעת באופן קבוע כדי להעריך את ההתפתחות של מערכת חיסונית תפקודית לראות את ההשפעה של זיהום HIV על התאים החיסוניים. ב עכברים הומניזצי...

Discussion

הכבד הוא נפרץ וניזוק בחולים נגועים באיידס24. ניסיוני מודלים בעלי חיים קטנים לחקר מחלות הכבד האנושי בנוכחות HIV-1 הוא מוגבל מאוד, למרות הזמינות של כמה מודלים בעלי חיים המושתלים עם CD34+ hspcs ו hepatocytes7,12, . עשרים וחמש בניסויים מחו?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי למענק הבריאות R24OD018546 (כדי L.Y.P. ו S.G.). המחברים רוצים להודות Weizhe Li, Ph.D., לעזרה בהליכים כירורגי, אמנדה סניף וודס, בולשיט, יאן צ'נג עבור אימונוהיסטולוגיה, UNMC זרימה cytometry מתקן מחקר חברי המנהל פיליפ הקסלי, Ph.D., ויקטוריה ב. סמית, בולשיט, וסמנתה וול, בולשיט, UNMC מתקדמים הליבה המיקרוסקופיה חברי מתקנים ג'ניס א. טיילור, בולשיט, וג ר. טלסקה, בולשיט, על התמיכה הטכנית. המחברים מכירים בד"ר. מורו איטו והירושי סואמאז מ-CIEA למתן העכברים TK-חעוגה ו ד ר יואכים באומגארט למתן טראוסולפן. המחברים מודים לד ר אדריאן קואסטרים, UNMC, על תרומת המאמר שלה לכתב היד.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
27 G1/2" needlesBD biosciences305109
30 G1/2" needlesBD biosciences305106
5 mL polystyrene  round-bottom tube 12 mm x 75 mm styleCorning352054
BD 1 mL Tuberculin Syringe Without NeedleBD biosciences309659
BD FACS array bioanalyzer BD BiosciencesFor purity check of eluted CD34+ cells 
BD FACS array softwareBD BiosciencesSoftware to analysis acquired CD34+ cell on FACS array
BD FACS lysing solutionBD Biosciences349202To lyse red blood cells
BD LSR IIBD BiosciencesInstrument for acquisiton of flow cytometry samples
BD Vacutainer Plastic Blood Collection TubeBD biosciencesBD 367874To collect Cord blood
Bovine Serum Albumin Sigma-aldrichA9576
BuprenorphineControlled substance and pain-killer
CD14-PEBD Biosciences555398Specific to human
CD19-BV605BD Biosciences562653Specific to human
CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyi Biotec130-046-702For isoation of   CD34+ HSPC
CD34-PE, humanMiltenyi Biotec130-081-002Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells 
CD3-AF700BD Biosciences557943Specific to human
CD45-PerCPCy5.5BD Biosciences564105Specific to human
CD4-APCBD Biosciences555349Specific to human
CD8-BV421BD Biosciences562428Specific to human
Cell counting slidesBio-rad1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue KitThermofisher scientificCS11204for extraction of genomic DNA from ear piece
Cobas Amplicor system v1.5 Roche Molecular Diagnosticsbioanalyzer to measure viral load
Cotton-tipped applicators  McKesson24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18)DAKOM7010Specific to human
DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-aldrichD2650-5X5ML
Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path SterileBD biosciences30914Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion
FACS Diva version 6BD Biosciencesflow cytometer software required for  acqusition of sample
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10438026
FLOWJO analysis software
v10.2		FLOWJO, LLCflow cytometry analysis software
GanciclovirAPP Pharmaceuticals, Inc.315110Prescripition drug
Greiner MiniCollect EDTA TubesGreiner bio-one450475
Hepatocytes thawing medium Triangle Research Labs MCHT50
Horizon Open Ligating Clip AppliersTeleflex537061To hold the ligating clips
Hospira Sterile Water for InjectionACE surgical supply co. Inc.001-1187For dilution of Buprenorphine (pain-killer)
Human Albumin ELISA Quantitation SetBethyl laboratoriesE80-129For assesing human albumin levels in mouse serum
Human hepatocyteTriangle Research Labs HUCP1 Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified 
Iris Scissors, StraightTed Pella, Inc.13295
LancetMEDIpointGoldenrod 5 mm
LS columns Miltenyi Biotec130-042-401Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)
Lymphocyte Separation Medium (LSM)MP Biomedicals50494For isoation of   lymphocytes from peripheral blood
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303holds Qudro MACS seperator and LS columns
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring ScissorsRoboz Surgical Instrument Co.RS-5605Used to make an incision on skin to expose spleen
Micro Dissecting ForcepsRoboz Surgical Instrument Co.RS-5157 to hold and pull out spleen from peritoneal cavity
mouse CD45-FITCBD Biosciences553080mouse-specific
PBS (Phosphate Buffered Saline)HycloneSH30256.02
Qudro MACS separator Miltenyi Biotec130-090-976holds four LS columns
RPMI 1640 mediumGibco11875093
StepOne Plus Real Time PCR Applied BiosystemsInstrument used  to  genotype
Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1mlDYMAX CORPT15469Used to  dispense  HSPC and HEP supension in controlled manner
Suturevet PGA synthetic absorbale sutureHenry Schein Animal Health41178Suturing of skin and peritoneum
TaqMan Gene Expression Master MixThermofisher scientific4369016
TC20 automated cell counterBio-rad1450102
TK-NOG mice Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)
TreosulfanMedac GmbHProvided by  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan BlueBio-rad1450022
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm LTed Pella, Inc.1346Used to make an incision on skin to expose spleen
Weck hemoclip traditional titanium ligating clipsEsutures523700To ligate the spleen post-injection

References

  1. Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
  2. Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
  3. Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
  4. Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
  5. Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, 47-58 (2012).
  6. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  7. Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
  8. Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
  9. Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
  10. Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
  11. Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
  12. Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
  13. Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
  14. Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
  15. Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
  16. Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
  17. Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. . Humanized Mice for HIV Research. , (2014).
  18. Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
  19. Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
  20. Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
  21. Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
  22. Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
  23. Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
  24. Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
  25. Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).
  26. Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
  27. Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
  28. Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
  29. Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
  30. Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
  31. Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151hepatocytes1 HIV 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved