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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Methode, um humanisierte Mäuse mit menschlichem Immunsystem und Leberzellen zu etablieren. Dual rekonstituierte immundefizienten Mäuse, die durch intrasplenische Injektion von humanen Hepatozyten und CD34+ hämatopoetischen Stammzellen erreicht werden, sind anfällig für eine Infektion mit dem Humanimmundefizienzvirus-1 und rekapitulieren Leberschäden, wie in HIV-infizierte Patienten.

Zusammenfassung

Trotz der erhöhten Lebenserwartung von Patienten, die mit dem humanen Immundefizienzvirus-1 (HIV-1) infiziert sind, hat sich die Lebererkrankung als häufige Ursache ihrer Morbidität herausgestellt. Die durch HIV-1 verursachte Leberimmunpathologie bleibt schwer fassbar. Kleine Xenograft-Tiermodelle mit menschlichen Hepatozyten und dem menschlichen Immunsystem können die menschliche Biologie der Pathogenese der Krankheit rekapitulieren. Hierin wird ein Protokoll beschrieben, um ein duales humanisiertes Mausmodell durch menschliche Hepatozyten und CD34+ hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen (HSPCs) zu etablieren, um die Leberimmunpathologie zu untersuchen, wie sie bei HIV-infizierten Patienten beobachtet wurde. Um eine doppelte Rekonstitution zu erreichen, ist das männliche TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) Mäuse werden intraperitoneal mit Ganciclovir (GCV) Dosen injiziert, um transgene Leberzellen der Maus zu eliminieren, und mit Treosulfan für nichtmyeloablative Konditionierung, die beide die Entwicklung des humanen Hepatozyten (HEP) und der Entwicklung des menschlichen Immunsystems (HIS). Humanalbumin (ALB) Ebenen werden für Lebertransplantation ausgewertet, und das Vorhandensein von menschlichen Immunzellen im Blut durch Durchflusszytometrie erkannt bestätigt die Etablierung des menschlichen Immunsystems. Das Modell, das mit dem hier beschriebenen Protokoll entwickelt wurde, ähnelt mehreren Komponenten von Leberschäden durch HIV-1-Infektion. Seine Einrichtung könnte sich als wesentlich für Studien zur Hepatitis-Virus-Koinfektion und für die Bewertung antiviraler und antiretroviraler Medikamente erweisen.

Einleitung

Seit dem Aufkommen der antiretroviralen Therapie ist die Zahl der Todesfälle im Zusammenhang mit der HIV-1-Monoinfektion erheblich zurückgegangen. Lebererkrankungen haben sich jedoch als häufige Ursache für Morbidität bei HIV-infizierten Patienten1,2herauskristallisiert. Koinfektionen von Hepatitis-Viren mit HIV-1-Infektion sind häufiger und machen 10% - 30% der HIV-Infizierten in den Vereinigten Staaten3,4,5aus.

Die Wirtssspezifität von HIV-1- und Hepatitis-Viren begrenzt den Nutzen von Kleintiermodellen, um menschenspezifische Infektionskrankheiten zu untersuchen oder mehrere Aspekte der HIV-1-assoziierten Leberpathogenese zu untersuchen. Immundefizienten Mäuse, die die Engraftierung menschlicher Zellen und/oder Gewebe (als humanisierte Mausmodelle bezeichnet) ermöglichen, sind akzeptable Tiermodelle für präklinische Studien6,7,8. Seit der Einführung humanisierter Mäuse in den frühen 2000er Jahren wurden mehrere präklinische Studien zur cholestatischen menschlichen Lebertoxizität, humanspezifischen Krankheitserregern, einschließlich HIV-1- und HIV-assoziierter neurokognitiver Störungen, Epstein-Barr-Virus, Hepatitis und Infektionskrankheiten, wurden bei diesen Mäusen untersucht6,9,10,11. Mehrere Mausmodelle für CD34+ HSPCs und/oder menschliche Hepatozytentransplantationen wurden seit langem entwickelt und haben sich im Laufe der Zeit verbessert, um die Krankheit pathogenese des Hepatitis-B-Virus (HBV)-assoziierten Lebererkrankung12, 13 , 14. Mehrere Modelle für HSPC und Humanhepatozyten (HEP) Transplantation basieren auf Stämmen, bekannt als NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- éc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, und fah-/- NOD rag1-/- il2r-null-Maus16. Jedes Modell hat jedoch seine eigenen Vorteile und Einschränkungen; Zum Beispiel ermöglicht AFC8 dual humanized mice for HEPs and human stem cells (HSCs) auf einem Balb/C-Rag2-/- 'c-/- Hintergrund die erfolgreiche Entransplantation von Immunzellen und HSCs, aber es fehlt eine antigenspezifische T- und B-Zelle Antwort in diesem Modell12. Die Hauptprobleme bei der Rekonstituierung doppelt humanisierter Mäuse sind die suboptimale Engraftmentierung, das Fehlen geeigneter Modelle zur Unterstützung verschiedener Gewebe, nicht übereinstimmende Bedingungen, Immunabstoßung oder Transplantat-versus-Wirtskrankheit (GVHD) und technische Schwierigkeiten, wie riskante Manipulationen bei Neugeborenen und hohe Sterblichkeitsraten aufgrund metabolischer Anomalien13.

Obwohl humanisierte Mäuse seit vielen Jahren für die HIV-Forschung verwendet werden17,18,19, die Verwendung von humanisierten Mäusen zur Untersuchung von Leberschäden durch HIV-1 ist begrenzt20. Wir berichteten zuvor über die Etablierung eines dualen humanisierten TK-NOG-Mausmodells und dessen Anwendung bei der HIV-assoziierten Lebererkrankung8. Dieses Modell zeigt die robuste Transplantation von Leber- und Immunzellen und rekapituliert die PATHOGENese der HIV-Infektion. Diese Diskussion enthält ein detailliertes Protokoll, das die wichtigsten Schritte bei der Transplantation menschlicher Hepatozyten enthält. Eine Beschreibung der HSPCs, die für eine erfolgreiche Engraftmentierung von HEPs und die Etablierung eines funktionellen Immunsystems bei TK-NOG-Mäusen erforderlich sind, wird ebenfalls vorgestellt. Die Verwendung dieser Mäuse zur Untersuchung der HIV-assoziierten Leberimmunopathogenese ist detailliert. TK-NOG-Männchenmäuse, die ein leberspezifisches Herpes-Simplex-Virus Typ 1 Thymidinkinase (HSV-TK) Transgen tragen, werden verwendet. Mausleberzellen, die dieses Transgen exprossieren, können nach einer kurzen Exposition gegenüber einer ungiftigen Dosis gCV leicht abgetrieben werden. Transplantierte menschliche Leberzellen werden in der Mausleber ohne exogene Medikamente stabil gepflegt21. Die Mäuse sind auch mit nichtmyeloablativen Dosen von Treosulfan, um eine Nische im Mausknochenmark für menschliche Zellen zu schaffen8. Immundefizienten TK-NOG-Mäuse werden intrasplenisch mit HEPs und multipotenten HSPCs injiziert. Die Mäuse werden dann regelmäßig auf Blut- und Leberrekonstitution durch Blutimmunphenotypisierung und Messungen des Serum-Human-Albumin-Spiegels überwacht. Mäuse mit einer erfolgreichen Rekonstitution von mehr als 15% für menschliche Immunzellen und HEPs werden intraperitoneal mit HIV-1 injiziert. Die Wirkung von HIV auf die Leber kann bereits nach 4 - 5 Wochen nach der Infektion beurteilt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass, da HIV-1 verwendet wird, alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden müssen, während das Virus behandelt und in Mäuse injiziert werden.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am University of Nebraska Medical Center genehmigt.

HINWEIS: Die Zulassung des örtlichen IACUC erhalten Sie, bevor Sie Tierversuche durchführen.

1. Verarbeitung von Nabelschnurblut und Isolierung menschlicher HSPCs

  1. Führen Sie alle Schritte des Protokolls unter sterilen Bedingungen in laminaren Durchflussschränken aus.
  2. Nehmen Sie Nabelschnurblut (CB) in heparinisierten Röhrchen und machen Sie das Volumen bis zu 35 ml durch Zugabe von phosphatgepufferter Saline (PBS). Schichtung der Probe auf dem Lymphozytentrennmedium (LSM), wie in Abbildung 1 dargestellt, und Zentrifugieren Sie das LSM mit dem geschichteten CB bei 400 x g für 35 min bei 4 °C ohne Bremsen.
    HINWEIS: Verdünnen Sie das Blut sorgfältig und vorsichtig, um eine Vermischung an der Schnittstelle zu vermeiden.
  3. Entfernen Sie die obere LSM- und Plasmaschicht sorgfältig und übertragen Sie die weiße Buffy-Beschichtungsschnittstelle mit einer Transferpipette in ein neues Rohr.
  4. Setzen Sie das buffy Mantel in 30 - 40 ml eiskalten Puffer (PBS + 0,5% Rinderserumalbumin [BSA] + 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA]) aus. Kombinieren Sie mit einer Pipette 20 l der Zellsuspension mit 20 l 0,4% Trypanblau und Pipette 10 l des Gemischs in die äußere Öffnung einer der beiden Kammern eines Zählschlittens und setzen Sie den Schlitten in einen automatisierten Zellzähler ein, um die Zellen zu zählen.
    HINWEIS: Verwenden Sie eiskalten Puffer in allen Schritten, da es hilft, die Zellen lebensfähig zu halten.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g 10 min bei 4 °C und aspirieren Sie den Überstand sorgfältig an. Fügen Sie dann 300 L eiskalten Puffer hinzu.
  6. Fügen Sie 100 l menschliches Fc-Rezeptor-Blockierungsreagenz und 100 l monoklonale Maus anti-human CD34 Antikörper-konjugierte Mikroperlen für bis zu 1 x 108 Zellen hinzu (siehe Tabelle der Materialien). 30 min bei 4 °C inkubieren, 10 ml eiskalten Puffer zum Waschen der Zellen hinzufügen und bei 300 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
    HINWEIS: Skalieren Sie diese nach der Zellenzahl, wenn mehr als 1 x 108 Zellen vorhanden sind.
  7. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, setzen Sie das Pellet in 500 l Puffer wieder auf und fahren Sie mit dem magnetischen Trennschritt fort, um HSPCs anzureichern.
  8. Platzieren Sie eine positive Auswahl-LS-Spalte (siehe Materialtabelle) in das magnetisch aktivierte Zellsortierfeld und übergeben Sie sie mit 3 ml Puffer.
  9. Laden Sie die Probe in die LS-Säule, die Mikroperlen, die an menschliche CD34+ gebunden sind, in Proben einfangen und unter dem Einfluss der Schwerkraft in das Sammelrohr fließen lassen kann.
  10. Waschen Sie die Säule 3x mit Puffer und sammeln Sie die Elute im selben Sammelrohr des CD34- Zellanteil.
  11. Tauchen Sie die Spalte mit 5 ml Puffer ein, um die CD34+ Zellen in ein neues Sammelrohr zu verwandeln. Wiederholen Sie den Vorgang, um eine Reinheit von >90% zu erreichen.
  12. Zählen Sie die eluierten CD34+ Zellen mit Trypan-Blaufarbstoff in einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie nach dem Zählen die CD34+ Zellen bei 300 x g für 5 min und entsorgen Sie den Überstand.
  13. Unterbrechen Sie die CD34+ Zellen in 25 l PBS für eine Injektion, die sofort bei der Transplantation verwendet werden soll, oder kryokonservieren Sie die Zellen in einer Konzentration von 1-2 Mio. ml im Gefriermedium (Roswell Park Memorial Institute medium [RPMI 1640 medium] + 50% fetal Rinderserum (FBS) + 10% Dimethylsulfoxid [DMSO]) zur weiteren Anwendung bei der Transplantation.
    HINWEIS: Erzählen Sie immer lebensfähige Zellen, bevor Sie sie bei der Transplantation verwenden.
  14. Um die Reinheit des CD34+ elute zu überprüfen, nehmen Sie 50 l der Suspension und inkubieren Sie sie mit 10 l PE-konjugierten Anti-Human-CD34-Antikörpern für 30 min bei 4 °C. Waschen Sie die gefärbten Zellen nach der Antikörperinkubation mit PBS, setzen Sie sie in 100 L PBS wieder ab und führen Sie dann die Durchflusszytometrie durch. Fügen Sie ein zusätzliches Rohr von Zellen ohne Antikörper hinzu, um das Tor im Durchflusszytometer zu entwerfen.
  15. Analysieren Sie die Daten nach der Erfassung, indem Sie den Interessenbereich für ein Forward Scatter (FSC) und ein Side Scatter (SSC)-Diagramm auswählen, gefolgt von gating für einzelne Zellen auf FSC-Flächen und FSC-Höhendiagrammen. Gate CD34-positive Zellen auf einzelnen Zellen im PE-Kanal und SSC-Flächendiagramm.

2. Vorbereitung menschlicher Hepatozyten zur Transplantation

  1. Entfernen Sie die kryokonservierten Hepatozyten aus dem flüssigen Stickstoff, tauchen Sie die Durchstechflasche schnell in das Wasserbad und tauen Sie ca. 90 - 120 s auf.
  2. Entfernen Sie die Durchstechflasche und gießen Sie die aufgetauten Hepatozyten in das 50 ml konische Rohr des erwärmten Auftaumediums.
  3. Die Zellen aufhängen, indem Sie das 50 ml Rohr für ein paar Sekunden von Hand schaukeln.
    HINWEIS: Wirbeln Sie das Rohr nicht.
  4. Pellet die Zellen bei 100 x g für 8 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Pelletzellen in PBS mit 0,1% BSA und bündeln Sie sie entweder mit frischen oder aufgetauten HSPCs (Verhältnis 10:1) in PBS in einem Endvolumen von 80 l/Maus.

3. Tierhandhabung, Screening, Genotypisierung und Behandlung bei der Human-HSPC- und Hepatozytentransplantation

  1. Umgang mit Tieren
    1. Als Folge einer schweren Immunschwäche, Rasse, Haus, und behandeln TK-NOG Mäuse unter aseptischen Bedingungen.
    2. Tragen Sie immer einen Labormantel, Handschuhe, Schuhbezüge und eine Gesichtsmaske, um eine Infektion mit potenziell pathogenen Mikroorganismen zu verhindern.
    3. Verwenden Sie sterile Handschuhe und Instrumente für die Operation und behandeln Sie die Tiere während der gesamten Operation aseptisch.
  2. Auswahl von TK-NOG-Mäusen für das Experiment
    1. Erhalten Sie die TK-NOG-Stammkolonie, indem Sie weibliche TK-NOG-Mäuse mit männlichen Nicht-TK-NOG-Wurfgenossen züchten und transgene Nachkommen durch Genotypisierung auswählen.
      HINWEIS: Führen Sie Genotypisierung (siehe Schritt 3.3) durch, um das Vorhandensein oder Fehlen des Transgens bei neugeborenen männlichen und weiblichen Mäusen zum Zeitpunkt der Entwöhnung zu bestimmen.
    2. Wählen Sie Männchen im Alter von 6 - 8 Wochen für die Transplantation aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit gegenüber der GCV-vermittelten Erschöpfung der HSV-TK Transgen-exekutionierenden Hepatozyten21.
    3. Ohr-Tag die Mäuse zum Zeitpunkt der Entwöhnung oder Operation, um die Identifizierung zu erleichtern. Beachten Sie das Gewicht und den Gesundheitszustand der Tiere.
  3. Genotypisierung für das Vorhandensein des HSV-TK-Transgens mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion
    1. Führen Sie Genotypisierung zum Zeitpunkt der Entwöhnung (in der Regel im Alter von 3 - 4 Wochen). Für die Genotypisierung schneiden Sie ein Stück des Mausohrs in einem laminaren Fluss-Biologischen Sicherheitsschrank, um die Sterilität aufrechtzuerhalten und genomische DNA mithilfe eines genomischen DNA-Isolationskits zu extrahieren.
    2. Amplify genomische DNA aus Ohrstück in einem 20 L Reaktionsgemisch auf Bildschirm für HSV-TK-Transgen unter Kontrolle des menschlichen Albumin-Promoters durch Zugabe von 1 L Vordergrundgrund 5'-CCATGCACCTTTATCCTGG-3', 1 l Reverse Primer 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 FAM-Sonde 5-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3' und 10 L Master-Mix auf einem Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions-Instrument (PCR)22.
    3. Stellen Sie die Echtzeit-PCR-Einstellungen wie folgt ein: 60 °C für 30 s (Vorlesestufe), 95 °C für 10 min (Haltestufe), 40 Zyklen von 95 °C für 15 s und 60 °C für 1 min (PCR-Stufe) und 60 °C für 30 s (Postread-Stufe).
      HINWEIS: Ein Schwellenwertzyklus (Ct) unter 22 gilt als positiv für die HSV-TK-Transgene.
  4. Behandlung mit Ganciclovir und Treosulfan
    1. Mit 27 G-Nadel, injizieren Sie die TK-NOG-Mäuse mit intraperitonealen GCV-Injektionen (6 mg/kg) 2x pro Tag an Tag 7 und an Tag 5 in 100 l Saline vor der Operation, um die transgenen parenchymalen Zellen der Mäuse zu erschöpfen (wie in der experimentellen Strategie in Abbildung 2gezeigt)23 .
    2. An den Tagen 3, 2 und 1 vor der Operation Vorkonditionierende Mäuse mit nichtmyeloablativen intraperitonealen Dosen Treosulfan (1,5 g/kg/Tag) in 100 l Saline mit einer 27 G-Nadel.
    3. Einen Tag vor der Operation zwei bis drei Tropfen Blut aus der submandibulären Vene ziehen, indem Sie es mit einer 5 mm Lanze stechen, und isolieren Sie das Serum durch Zentrifugieren (1.500 x g für 10 min bei 4 °C) für den Alanin-Aminotransferase (ALT)-Assay zur Beurteilung des Degr Leberschäden.
  5. Vorbereitung auf die Operation
    1. Verwenden Sie Clipper, um das Fell der Maus um die Einschnittstelle (links der Peritonealwand) vor der Operation zu rasieren.
    2. Stellen Sie den Sauerstoffstrom auf 1 l/min und den Isofluran-Fluss mit einer Mausanästhesiemaschine auf 3% - 5% in einer Induktionskammer ein. Legen Sie eine Maus nach der anderen in die Induktionskammer für die Anästhesie.
    3. Befestigen Sie das eine Ende eines sterilen Verlängerungsrohres (mit einer Haltekapazität von 550 l Suspension; siehe Materialtabelle für Spezifikationen) an einer 30 G Nadel und das andere Ende an einer 1 ml Spritze.
    4. Füllen Sie die Spritze mit der Aufhängung (80 l/Maus) von gepoolten HEPs und HSPCs (siehe Abschnitt 2), passen Sie die Spritze in die Kerbe einer sich wiederholenden Dosierpipeette und stellen Sie den Spender so ein, dass er 10 l in jeder Presse ausgibt.
    5. Sobald die Mäuse anästhesiert sind (in der Regel nach 3 - 4 min), schalten Sie den Isofluran-Fluss auf den Nasenkegel und reduzieren Sie den Isofluran-Durchfluss auf 2% - 3%.
  6. Intrasplenische Transplantation menschlicher HSPCs und Hepatozyten bei Mäusen
    1. Führen Sie alle chirurgischen Schritte in einem laminaren Strömungsschrank unter sterilen Bedingungen durch.
    2. Legen Sie einen sauberen sterilen Vorhang über die Arbeitsfläche und schrubben Sie die linke Seite des Körpers jeder Maus mit 10 % Povidon-Jod gefolgt von 70 % Isopropylalkohol, bevor Sie einen Schnitt machen.
    3. Machen Sie einen kleinen Schnitt (1 - 1,5 cm in der Länge und 5 mm tief) in der Haut, Muskel, und Peritoneum an der linken Seite der Peritonealwand mit Vanna Typ Schere, um die Peritonealhöhle etwa 5 mm unter dem unteren Rand des Rippenkäfigs zu betreten.
    4. Suchen Sie die Milz, ziehen Sie sie leicht mit Zangen in den Operationsbereich für einen einfachen Zugang, und setzen Sie die 30 G Nadel in den unteren Pol der Milz.
    5. Schalten Sie den Kolben der Dosierpipette frei und geben Sie 10 l des Volumens gleichzeitig mit einem Limit von 60 - 80 l pro Milz aus. Ziehen Sie die Nadel langsam zurück und schneiden Sie die Milz mit Ligating-Clips mit einem Ligations-Applier.
    6. Schieben Sie die Milz zurück in die Körperhöhle mit baumwollgekippten Applikatoren, die mit sterilem PBS benetzt sind.
    7. Schließen Sie die Muskelschicht der Bauchwand mit einem resorbierbaren Naht unterbrochen Nahtmuster (nicht kontinuierlich). Erreichen Sie den Hautverschluss mit einem unterbrochenen Nahtmuster mit nicht resorbierbaren Nähten.
    8. Verwenden Sie warme Wasser zirkulierende Pads, um die Mäuse vor Unterkühlung nach der Operation zu schützen.
    9. Entfernen Sie nicht resorbierbare Nähte 10-14 Tage nach der Operation.
  7. Postoperative Pflege
    1. Wenn das transplantierte Tier weckt, injizieren Analgetika Buprenorphin (0,1 mg/kg) intraperitoneal, 2x pro Tag für aufeinander folgenden 3 Tage.
    2. Beobachten Sie die Tiere mindestens 1x pro Tag, bis sie zu normalen körperlichen Bedingungen zurückkehren.
      HINWEIS: Überprüfen Sie das Körpergewicht jedes Tieres, da einige Mäuse nach der Postchirurgie abnehmen können. Mäuse gewinnen in der Regel ihr ursprüngliches Gewicht in 1 bis 2 Wochen zurück.

4. Transplantationsvalidierung der menschlichen Leber durch ELISA und das menschliche Immunsystem durch Durchflusszytometrie

HINWEIS: Bewerten Sie die Rekonstitution der menschlichen Leber und des Immunsystems monatlich, beginnend 1 Monat Nachtransplantation durch enzymgebundenen Immunsorbent Assay (ELISA) bzw. Durchflusszytometrie.

  1. Sammeln Sie Blutproben aus der submandibulären Vene mit Lanzen in EDTA-Röhrchen und Zentrifuge bei 1.500 x g für 10 min bei 4 °C. Isolieren Sie das Serum, um den menschlichen Albuminspiegel zu überprüfen, um die Transplantationseffizienz der Mausleber für transplantierte menschliche Hepatozyten zu bewerten, indem Sie ein menschliches Albumin-ELISA-Quantifizierungsset (siehe Tabelle der Materialien) verwenden, indem Sie dem Hersteller folgen Anweisungen.
    HINWEIS: Entsorgen Sie das Pellet nicht und verwenden Sie die Pelletzellen nicht für eine Durchflusszytometrieanalyse, um die Rekonstitution des menschlichen Immunsystems zu bewerten.
  2. Das Zellpellet ohne Serum in 35 l FACS-Puffer (PBS + 2% FBS) und mit 5 l mausspezifischem CD45 (Konzentration 0,5 mg/ml), 5 CD45 (0,1 mg/ml), CD3 (0,2 mg/ml), CD8 (0,1 mg/ml) und CD19 (0,5 mg/ml) und 20 l CD4 (0,25 mg/ml) und CD14 (0,25 mg/ml) jeweils 30 min bei 4 °C, um die Entwicklung eines funktionellen Immunsystems von CD34+ HSPCs zu überprüfen.
    HINWEIS: Erwägen Sie, eine zusätzliche Röhre von ungefärbten Zellen hinzuzufügen, um das Gating der gefärbten Zellen zu bestimmen.
  3. Nach der Inkubation die gebeizte Suspension (ca. 100 l) in ein Polystyrol-Rund-Boden-Flow-Zytometrierohr übertragen und 2 ml 1x Lysepuffer (siehe Materialtabelle)verwenden, indem 1 Teil des 10-fachen Lysepuffers mit 9 Teilen destilliertem Wasser verdünnt und 10 - 15 min, um rote Blutkörperchen zu lysieren.
    HINWEIS: Beobachten Sie Trübung, um die Rote Blutzelllyse zu bewerten. Sobald die Probe klar wird, ist die Lyse abgeschlossen.
  4. Nach der Lyse 3 ml des FACS-Puffers in das Rohr und Zentrifuge bei 300 x g bei 4 °C für 5 min geben, um ein Pellet zu erhalten. Wiederholen Sie die Wäsche, indem Sie dem Pellet und der Zentrifuge 3 ml FACS-Puffer bei 300 x g bei 4 °C für 5 min hinzufügen.
  5. Fixieren Sie die Zellen in frisch hergestelltem 1% Paraformaldehyd (PFA) und erfassen Sie gefärbte Zellen auf dem Durchflusszytometer, analysiert mit Strömungssoftware.
  6. Wählen Sie für die Analyse Lymphozyten auf einem FSC/SSC-Plot aus, gefolgt von einzelligen Gatings auf FSC-Fläche/FSC-Höhe.
  7. Darüber hinaus Gate für humanspezifische CD45 (hCD45) auf der einzelzelligen Population und enthalten mausspezifische CD45 (mCD45) für den Ausschluss von Zellen murinen Ursprungs. Strategisieren Sie die Färbung der gefärbten Population basierend auf dem Gating von ungefärbten Zellen.
  8. Gate hCD45+ Zellen zur Bestimmung der Frequenz von CD3+ T-Zellen und CD19+ B-Zellen. Gate-T-Zellen, um CD4- und CD8-Teilmengen zu bestimmen. Um Monozyten auszuwerten, gate auf hCD45, um CD14+ Monozyten zu bestimmen.

5. HIV-Infektion von TK-NOG-Mäusen und ihre Auswirkungen auf die menschliche Leber und das Immunsystem

  1. Behandeln Sie das HIV-1-Virus und alle infizierten Mäuse in einer ausgewiesenen Einrichtung der Biosicherheitsstufe 2.
    ACHTUNG: Autoklav und entsorgen Sie alle HIV-infizierten Abfälle in doppelten Biohazard-Beuteln. Tragen Sie aus Sicherheitsgründen schnittfeste Handschuhe, während Sie HIV-infizierte Mäuse abgeben.
  2. Tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA), einschließlich eines Einweg-Coverall-Kleid, Schuhbezüge, eine Gesichtsmaske und Doppelhandschuhe zu jeder Zeit während der Arbeit mit dem Virus.
  3. Wählen Sie Mäuse mit einer Rekonstitution von mehr als 15% der menschlichen CD45+ Zellen (getestet in Schritt 4.7) und mit einer Anwesenheit von menschlichem Albumin im Serum für HIV-1-Infektion (getestet in Schritt 4.1).
  4. Injizieren Sie die Mäuse mit 1 x 103 bis 1 x 104 Gewebekultur infektiösen Dosen 50 (TCID50) HIV-1ADA in einem Volumen von 100 - 200 l pro Maus, intraperitoneal.
  5. Euthanisieren Sie die HIV-infizierten Mäuse 5 Wochen nach der Infektion mit Isofluran (mit einer Isofluran-Dampfkonzentration von >5%).
  6. Nach der Einschläferung der Mäuse, sammeln Sie Blut in EDTA-Röhren durch eine Herzpunktion für die Isolierung von Serum, um die Wirkung von HIV-1 auf die Leber zu sehen, indem Sie die humanspezifischen Albuminspiegel von ELISA (siehe Schritt 4.1) und Blutzellen bewerten, um Veränderungen des menschlichen Immunsystems zu überprüfen Zellen mit Durchflusszytometrie (siehe Schritte 4.2 - 4.8).
    HINWEIS: Bewerten Sie die periphere Viruslast 5 Wochen nach der Infektion auf einem Bioanalyzer, um zu bestätigen, ob die Mäuse infiziert sind.
  7. Nach dem Ziehen von Blut, verbrauchen Sie die Leber von den eingeschläferten Mäusen.
  8. Für die Leberexzision, setzen Sie die Bauchhöhle durch einen Schnitt von 1,5 - 2 cm lang und 0,5 cm tief in der Haut, Muskeln, und Peritoneum, aus dem Xyphoi. Machen Sie einen Schnitt senkrecht zur Wirbelsäule zwischen der Leber und der Membran. Heben Sie die Leber und trennen Sie alle Membranen, die sie an Magen und Darm anheften.
  9. Sammeln und fixieren Sie die Leber in 4% Paraformaldehyd über Nacht und folgen Sie einem Standard-Immunhistochemischen Protokoll, um die Wirkung von HIV auf CK18+ Hepatozyten mit humanspezifischem CK18-Antikörper8zu bewerten.

Ergebnisse

Die Etablierung eines dualen humanisierten Mausmodells mit menschlichen Leber- und Immunzellen kann bei jedem Schritt mit sehr einfacher ELISA bzw. Durchflusszytometrie leicht überwacht werden. Die Durchflusszytometrie wird regelmäßig durchgeführt, um die Entwicklung eines funktionellen Immunsystems zu bewerten und die Wirkung einer HIV-Infektion auf Immunzellen zu sehen. Bei dual humanisierten Mäusen kann die Entwicklung funktioneller Immunzellen zwischen 15% und 90% des Lymphozyten...

Diskussion

Die Leber ist bei HIV-infizierten Patienten kompromittiert und geschädigt24. Experimentelle Kleintiermodelle zur Untersuchung menschlicher Lebererkrankungen in Gegenwart von HIV-1 sind extrem begrenzt, trotz der Verfügbarkeit einiger kotransplantierter Tiermodelle mit CD34+ HSPCs und Hepatozyten7,12, 25. In In-vitro-Experimenten haben Hepatozyten nachweislich eine HIV-1-Infektion auf niedrig...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health Grant R24OD018546 (an L.Y.P. und S.G.) unterstützt. Die Autoren danken Weizhe Li, Ph.D., für die Hilfe bei chirurgischen Eingriffen, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng für Immunhistologie, UNMC Flow Cytometry Forschungseinrichtung Mitglieder Direktor Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., und Samantha Wall, B.S., UNMC Advanced Microscopy Core Facility Mitglieder Janice A. Taylor, B.S., und James R. Talaska, B.S., für den technischen Support. Die Autoren würdigen Drs. Mamoru Ito und Hiroshi Suemizu von CIEA für die Bereitstellung von TK-NOG-Mäusen und Dr. Joachim Baumgart für die Bereitstellung von Treosulfan. Die Autoren danken Dr. Adrian Koesters, UNMC, für ihren redaktionellen Beitrag zum Manuskript.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
27 G1/2" needlesBD biosciences305109
30 G1/2" needlesBD biosciences305106
5 mL polystyrene  round-bottom tube 12 mm x 75 mm styleCorning352054
BD 1 mL Tuberculin Syringe Without NeedleBD biosciences309659
BD FACS array bioanalyzer BD BiosciencesFor purity check of eluted CD34+ cells 
BD FACS array softwareBD BiosciencesSoftware to analysis acquired CD34+ cell on FACS array
BD FACS lysing solutionBD Biosciences349202To lyse red blood cells
BD LSR IIBD BiosciencesInstrument for acquisiton of flow cytometry samples
BD Vacutainer Plastic Blood Collection TubeBD biosciencesBD 367874To collect Cord blood
Bovine Serum Albumin Sigma-aldrichA9576
BuprenorphineControlled substance and pain-killer
CD14-PEBD Biosciences555398Specific to human
CD19-BV605BD Biosciences562653Specific to human
CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyi Biotec130-046-702For isoation of   CD34+ HSPC
CD34-PE, humanMiltenyi Biotec130-081-002Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells 
CD3-AF700BD Biosciences557943Specific to human
CD45-PerCPCy5.5BD Biosciences564105Specific to human
CD4-APCBD Biosciences555349Specific to human
CD8-BV421BD Biosciences562428Specific to human
Cell counting slidesBio-rad1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue KitThermofisher scientificCS11204for extraction of genomic DNA from ear piece
Cobas Amplicor system v1.5 Roche Molecular Diagnosticsbioanalyzer to measure viral load
Cotton-tipped applicators  McKesson24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18)DAKOM7010Specific to human
DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-aldrichD2650-5X5ML
Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path SterileBD biosciences30914Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion
FACS Diva version 6BD Biosciencesflow cytometer software required for  acqusition of sample
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10438026
FLOWJO analysis software
v10.2		FLOWJO, LLCflow cytometry analysis software
GanciclovirAPP Pharmaceuticals, Inc.315110Prescripition drug
Greiner MiniCollect EDTA TubesGreiner bio-one450475
Hepatocytes thawing medium Triangle Research Labs MCHT50
Horizon Open Ligating Clip AppliersTeleflex537061To hold the ligating clips
Hospira Sterile Water for InjectionACE surgical supply co. Inc.001-1187For dilution of Buprenorphine (pain-killer)
Human Albumin ELISA Quantitation SetBethyl laboratoriesE80-129For assesing human albumin levels in mouse serum
Human hepatocyteTriangle Research Labs HUCP1 Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified 
Iris Scissors, StraightTed Pella, Inc.13295
LancetMEDIpointGoldenrod 5 mm
LS columns Miltenyi Biotec130-042-401Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)
Lymphocyte Separation Medium (LSM)MP Biomedicals50494For isoation of   lymphocytes from peripheral blood
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303holds Qudro MACS seperator and LS columns
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring ScissorsRoboz Surgical Instrument Co.RS-5605Used to make an incision on skin to expose spleen
Micro Dissecting ForcepsRoboz Surgical Instrument Co.RS-5157 to hold and pull out spleen from peritoneal cavity
mouse CD45-FITCBD Biosciences553080mouse-specific
PBS (Phosphate Buffered Saline)HycloneSH30256.02
Qudro MACS separator Miltenyi Biotec130-090-976holds four LS columns
RPMI 1640 mediumGibco11875093
StepOne Plus Real Time PCR Applied BiosystemsInstrument used  to  genotype
Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1mlDYMAX CORPT15469Used to  dispense  HSPC and HEP supension in controlled manner
Suturevet PGA synthetic absorbale sutureHenry Schein Animal Health41178Suturing of skin and peritoneum
TaqMan Gene Expression Master MixThermofisher scientific4369016
TC20 automated cell counterBio-rad1450102
TK-NOG mice Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)
TreosulfanMedac GmbHProvided by  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan BlueBio-rad1450022
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm LTed Pella, Inc.1346Used to make an incision on skin to expose spleen
Weck hemoclip traditional titanium ligating clipsEsutures523700To ligate the spleen post-injection

Referenzen

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