JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר עבודה מפורט עבור הדור של ex-vivo אפיון של וירוסים oncolytic ביטוי של immunomodulators, באמצעות וירוסי חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה. יישום והתאמה וקטור פלטפורמות אחרות, transgenes נאיץ את ההתפתחות של הרומן immunovirotherapeutics לתרגום קליניים.

Abstract

חיסוני סרטן מוצלח יש פוטנציאל להשגת שליטה הגידול לטווח ארוך. למרות ההצלחות האחרונות קליני, נותר צורך דחוף טיפולים יעילה ובטוחה המותאמים פרופילים המערכת החיסונית גידול בודדים. וירוסים Oncolytic לאפשר את תנאי הגיוס של תגובות חיסוניות אנטי הגידול, כמו גם ביטוי גנים בעל הגבלת הגידול. פרוטוקול זה מתאר את דור לשעבר vivo וניתוח של וקטורים oncolytic immunomodulatory. התמקדות וירוסים החיסון נגד חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה, המתודולוגיה הכללית ניתן להתאים וירוס מינים אחרים, transgenes. זרימת העבודה הציג כוללת של עיצוב, שיבוט, הצלה, הפצת וירוסים רקומביננטי. מבחני לנתח שכפול קינטיקה, פעילות lytic של וקטור הפונקציונליות של immunomodulator מבודדים ex-vivo כלולים, ובכך להקל על הדור של סוכנים הרומן להמשך פיתוח במודלים פרה, ובסופו של דבר תרגום רפואי.

Introduction

Oncolytic וירוסים (OVs) מפותחים כמו הרפוי אנטי סרטניים, במיוחד לשכפל בתוך ולהרוג תאים סרטניים תוך השארת רקמות בריאה ללא פגע. זה הפך נפוץ להבין את virotherapy oncolytic (ש'), ברוב המקרים, לא להסתמך רק על פירוק הגידול מלאה על-ידי שכפול יעיל והפצת של הוירוס, אבל דורש מנגנון פעולה נוספים להצלחה בטיפול, כולל כלי הדם, סטרומה מיקוד ומעל הכל גירוי המערכת החיסונית1,2,3,4. בעוד מחקרים רבים OV מוקדם בשימוש וירוסים שלא שונתה, המחקר הנוכחי יש שהרוויח ביולוגית משופרת הבנה, וירוס biobanks המכילים פוטנציאל הרומן OVs, ואת האפשרויות המוצעות על ידי הנדסה גנטית על מנת ליצור OV מתקדם פלטפורמות5,6,7.

לאור ההצלחה האחרונה של חיסוני, immunomodulatory transgenes הם עניין מיוחד בנושא הנדסה גנטית של OVs. ביטוי יישוב של המוצרים בהם הגן על-ידי תאי הגידול הנגועים OV מפחית רעילות לעומת ניהול מערכתי. פילוח מושגת באמצעות וירוסים עם oncoselectivity הגלום או על-ידי שינוי נגיפי tropism8. Immunomodulation המקומיות משפר את מנגנוני אנטי הגידול ומגובש של עבודה בשעות נוספות. יתר על כן, אסטרטגיה זו הוא אינסטרומנטלי חוקר את יחסי הגומלין בין וירוסים, תאים סרטניים את מערכת החיסון של הפונדקאי. לשם כך, פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה ישימים, הניתנים לשינוי עיצוב, שיבוט, להציל, להפיץ של אמת oncolytic paramyxovirus (במיוחד וירוס חצבת) וקטורים קידוד כזה transgenes.

אפנון של התגובה החיסונית יכולה להיות מושגת על ידי מגוון רחב של מוצרים transgene מיקוד שלבים שונים של סרטן-חסינות מחזור9, כולל שיפור זיהוי אנטיגן הגידול [למשל, אנטיגנים סרטניים הקשורים (תעש) או inducers של מרכזי histocompatibility מורכבים (MHC) מחלקה אני מולקולות] מעל תמיכה תא דנדריטי ההבשלה למצגת יעילה אנטיגן (ציטוקינים); גיוס והפעלת תאים חיסוניים הרצוי כגון ציטוטוקסיות helper T תאי [נוגדנים, bispecific תא T engagers (BTEs)]; פילוח מדכא תאים כגון בתאי T רגולטוריים, התאים מיאלואידית נגזר משתיק קול, מקרופאגים סרטניים הקשורים לסרטן-הקשורים fibroblasts (נוגדנים, BTEs, ציטוקינים); ומניעת עיכוב תא אפקטור ותשישות (מעכבי המחסום). לפיכך, שפע של גורמים ביולוגיים זמין. הערכה של כזה immunomodulators מקודד וירוס לגבי היעילות הטיפולית ואת הסינרגיה אפשרי, כמו גם ההבנה של מנגנונים בהתאמה יש צורך לשפר טיפול בסרטן.

וירוסי RNA חד-גדילי תחושה שלילית של משפחת Paramyxoviridae מאופיינים על ידי תורמת את השימוש בהם מספר תכונות כמו oncolytic וקטורים. אלה כוללים oncotropism טבעי, קיבולת גנומית transgenes (יותר מ 5 kb)10,11, היעילה מתפשט כולל היווצרות syncytia ו- immunogenicity גבוהה12. לכן, פלטפורמות OV בהתבסס על וירוס כלבלבת13, וירוס חזרת14, וירוס מחלת ניוקאסל15,16,סנדאי וירוס17, וירוס קופיים 518, Tupaia paramyxovirus19 פותחו. בולטת, חיים חיסון וירוס חצבת הקלוש זנים (MV) התקדמו קליניות פיתוח20,21. זני וירוס אלה שימשו במשך עשרות שנים עבור חיסונים שגרתיים עם שיא בטיחות מעולה22. יתר על כן, אין שום סיכון עבור insertional מוטגנזה מכוונת בשל השכפול בקפדנות cytosolic של paramyxoviruses. מערכת רב תכליתי גנטיקה הפוכה המבוססת על אנטי-גנומית cDNA המאפשר החדרת transgenes ליחידות שעתוק נוספים (ATUs) הוא זמין11,23,24. וקטורים MV קידוד symporter סודיום יודיד (MV-ש"ח) לדימות, הקרנות או אנטיגן carcinoembryonic מסיסים (MV-CEA) כסמן הפונדקאית על ביטוי גנים ויראליים הם שמחושב כעת בניסויים קליניים (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 ו- NCT00408590). ניהול בטוח אושרה, דווח על מקרים של יעילות אנטי הגידול הקודם מחקרים25,26,27,28,29, 30 (נבדקה על ידי Msaouel et al.31), לסלול את הדרך עבור וירוסים חצבת oncolytic נוספים יש פותחה, נבדק preclinically. MV קידוד immunomodulatory מולקולות מיקוד שלבים מגוונים של מחזור סרטן-חסינות הוכחו לעכב צמיחת הגידול ו/או להאריך את הישרדות בעכברים, עם הוכחה יעילות החיסון בתיווך, זיכרון לטווח ארוך של מערכת החיסון מגן ב- syngeneic מודלים העכבר. מקודד וקטור transgenes כוללים המושבה גרנולוציט-מקרופאג מגרה פקטור (GM-CSF)32,33, חלבון מפעיל נויטרופילים של ה פילורי 34, מעכבי המערכת החיסונית מחסום35, אינטרלוקין-12 (IL-12)36תעש37, BTEs38, אשר קשר צולב אנטיגן פני שטח הגידול עם CD3, ובכך לעודד פעילות אנטי הגידול על-ידי תאי T polyclonal, ללא קשר (ירידה לפרטים וגירוי שיתוף של קולטן תא T איור 1). תוצאות פרה מבטיח שהושג בונה דרישה נוספת translational למאמצים אלו.

Talimogene laherparepvec (T-VEC), סוג אני וירוס הרפס סימפלקס קידוד GM-CSF, הוא oncolytic היחידה הטיפולית אושרה על ידי ארצות הברית מזון, והתרופות האמריקני (FDA) סוכנות התרופות האירופית (EMA). שלב המחקר השלישי המוביל אישורי בשנת 2015 מאוחר לא רק הראו יעילות באתר של הזרקת אינטרה-tumoral, אלא גם השפעות abscopal (קרי, הפוגות של נגעים ללא הזרקת) במלנומה מתקדמת39. T-VEC מאז נכנסה ניסויים נוספים עבור יישומים אחרים הישויות הגידול (למשל סרטן עור שאינו מלנומה, , NCT03458117; סרטן הלבלב, NCT03086642), הערכה של טיפולים משולבים, במיוחד עם מחסום המערכת החיסונית מעכבי (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 ו Ribas et al.40).

זה מדגים לא רק את הפוטנציאל של חיסוני oncolytic, אלא גם את הצורך בהמשך מחקר לזיהוי סופריור שילובים של תעריף שעות נוספות, immunomodulation. עיצוב רציונלית של וקטורים נוספים ופיתוח שלהם לבדיקה פרה הוא המפתח במשימה. זה גם לקדם את ההבנה של מנגנונים הבסיסית, יש השלכות על ההתקדמות לקראת טיפול בסרטן אישית יותר. לשם כך, פרסום זה מציג את המתודולוגיה שינוי ופיתוח של paramyxoviruses על חיסוני סרטן ממוקד, ליתר דיוק, של וירוסי חצבת oncolytic קידוד נוגדנים מפעיל את תא T (איור 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: [O], [P], ו [ז] להצביע על סעיפים קטנים החלים: OVs הכללי, paramyxoviruses (רוב) או MV בלבד, בהתאמה. [B] מציין סעיפים ספציפיים עבור BTE transgenes.

1 שכפול של קידוד Immunomodulator Transgenes לתוך וקטורים וירוס חצבת

  1. [O] עיצוב הכנס רצף.
    1. [O] להחליט על immunomodulator עניין מבוסס על ספרות מחקר או על מידע כגון מסכי גנטי41 , שואבים את רצף cDNA רלוונטי המתאים מסדי נתונים כגון GenBank, הארכיון נוקלאוטיד האירופית, או ImMunoGeneTics מידע מערכת בינלאומית (IMGT).
    2. [O] להוסיף תכונות נוספות הרצף transgene (איור 3). רצף קוזאק הקודמת ואופטימיזציה codon ספציפית יכול לשפר את הביטוי. האות רצפים נדרשים עבור הפרשה. כוללים רצפי קידוד תגים חלבון N - ו/או C-מסוף עבור זיהוי וטיהור42. כוללות הגבלה אתרים להכנסה לתוך וקטור.
      הערה: [M] יחידות שעתוק נוספים (ATUs) מחסה MV פולימראז ג'ין ומתחילים לעצור אותות נחוצים עבור ביטוי transgene מ רקומביננטי הגנום MV. וקטורים מתאים cDNA אנטי-גנומית, נשלט על-ידי היזמים CMV, המכיל ATUs עם הגבלת ייחודי אתרי היכרות ראשונית של תחושה חיובית transgenes-תפקידים מוגדרים, פותחו בעבר11. [P] מיקום הולם transgene הוא קריטי, מכיוון שזה משפיע על שכפול ויראלי והביטוי transgene עקב מעבר הצבע ביטוי אופייני paramyxoviruses43. ההיכרות ATU קרובים לסיומה 3' של הגנום אנטי (כלומר., בתפקיד מנהיג או במורד הזרם של הגן P ) בדרך כלל תוצאות בביטוי transgene גבוהה במחיר מופחת שכפול ויראלי. שכפול מוגבר, רמות נמוכות יותר של ביטוי transgene ניתן לצפות בעת שימוש את ATU במורד הזרם של הגן H . אריזה של הגנום של מספר paramyxoviruses, כולל וירוס חצבת, דורש קשירה של שישה נוקלאוטידים על ידי כל חלבון nucleocapsid44. להכנסה של transgenes לתוך וירוסים כאלה, להבטיח מספר נוקלאוטידים בגנום מלאה יהיה שמתחלק שש. זה גם נקרא "כלל לשישה"45,46. במידת הצורך, לכלול נוקלאוטידים נוספים תותב (הזרם של הרצף קוזאק או במורד הזרם של stop codon) ללא היכרות עם מסגרת משמרות או עצירה מוקדמת codons. [ז] למנוע רצפי transgene המסוים דומים MV ג'ין התחלה (AGGRNCMARGW), לעצור אותות (RTTAWANAAAA) ו- RNA עריכת רצפי (AAAAAGGG). רצפי הקונצנזוס כאלה פורסמו (ראה למשל, פארקים ואח47).
    3. [O] לרכוש oligonucleotide של הרצף הרצוי או להרכיב של רצפים זמינים באמצעות שיבוט מולקולרי רגיל48.
      הערה: [O] עבור הגברה PCR של transgene, לתכנן פריימר לפנים כולל האתר הגבלת במעלה הזרם של נוקלאוטידים 15-20 הראשון את תותב, פריימר הפוכה כולל האחרון 15-20 נוקלאוטידים של הקדמי ואחריו ההגבלה במורד הזרם אתר.
  2. [O] שיבוט הוספה לתוך ה-DNA קידוד הגנום הנגיפי (אנטי-).
    1. [O] לשכפל את תותב לתוך ה-DNA וקטורים או DNA הגנום אנטי וירוסים RNA לפי תקן מולקולרית שיבוט טכניקות48 (קרי, אנזימטי הגבלת ואחריו מצדו דנ א).
      1. [O] למנוע מחדש מצדו של וקטור באמצעות אתרים שאינם תואמים הגבלה או זרחון והתבקשתי לפני מצדו.
      2. [O] לבודד את המוצר מצדו על-ידי agarose בג'ל ג'ל עוקבות טיהור באמצעות ערכות זמינים מסחרית. באופן כללי, יעילות אופטימלית מצדו מושגת ביחס 3:1 שן טוחנת של הוספה וקטוריים.
    2. [O] שינוי צורה המוצר מצדו לתוך החיידקים המוסמכת המתאימה להתאוששות יעילה של פלסמידים גדולים (קרי, מבצע הלם חום של e. coli49) ולזהות שיבוטים חיידקי מסתיר את ה-DNA הנכונה על ידי המושבה PCR50 .
    3. [O] בידוד מוגבר DNA שיבוט חיידקי יחיד באמצעות ערכות הכנה DNA זמינים מסחרית. לאשר את תקינות גנומית שליטה תקציר עם אנזימי הגבלה המתאים (למשל, HindIII עבור MV הגנום [M]). לאשר נכון והתקינות של transgene ידי רצף.
      הערה: [ז] עבור transgenes הוכנס HMV - ATU, לבצע סנגר רצף עם תחל הבאים: H-9018 [פריימר לפנים, איגודים למיקום MV הגנום 9018 H פתח קריאה מסגרת (ORF)]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'; L-9249 + (הפוך פריימר, איגודים למיקום הגנום MV 9249 ב ORF L ): 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

2. להציל את חלקיקי וירוס חצבת רקומביננטי קידוד Immunomodulators

  1. [O] לייצר חלקיקי וירוס רקומביננטי מ (אנטי-) גנומית הדנ א באמצעות תקנים של וירוס תאים מפיק לפי הפרוטוקול הסטנדרטי עבור הנגיף בהתאמה. פעל לפי ההנחיות לעבודה בתנאים סטריליים. לבצע תרבית תאים תחת וקולטי, בפרט כל השלבים הכרוכים וירוס ב- class II ארונות בטיחות ביולוגית.
    1. [ז] על לעזרתו של וירוסי חצבת מ cDNA23,24, צלחת MV מפיק (הקוף הירוק אפריקאי כליות נגזר Vero) תאים באופן שווה על צלחת 6-ובכן 24 שעות לפני תרביות תאים. זרע 2 x 105 תאים ב- 2 mL בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS) לכל טוב כדי להשיג 65-75% confluency בזמנו של תרביות תאים.
      הערה: [P] להפחית את מספרי הטלפון הנייד אם התאים והדבר לפני היווצרות syncytia הנוצרות על-ידי וירוס.
    2. [P] Transfect התאים עם ה-DNA קידוד של פלסמידים עוזר נגד הגנום, נדרש ויראלי, וקידוד, אם רצונך בכך, פלסמיד כתב פלורסנט כדי להעריך את יעילות תרביות תאים.
      1. [M] µg 5 מיקס של דנ א רקומביננטי קידוד חצבת וירוס אנטי הגנום, 500 ננוגרם של פלסמידים ביטוי בתרבית של קידוד וירוס חצבת N ו- L חלבונים ו 100 ננוגרם של פלסמידים קידוד החלבון P ו כתב פלורסנט הנפח הכולל של 200 µL DMEM.
      2. הוסף µL 18.6 של ריאגנט liposomal תרביות תאים, לערבב מיד על ידי מצליף את הצינור, תקופת דגירה של 25 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      3. [P] להחליף את המדיום 1.8 מ של DMEM, 2% FBS, 50 kanamycin µg/mL (או אנטיביוטיקה אחרים למניעת זיהום) לכל טוב, ואז להוסיף את תערובת תרביות תאים dropwise הבאר ו מערבולת בקפידה. דגירה תאים בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. החלף בינוני 2 מ של DMEM טריים, 2% FBS ו- µg 50/mL kanamycin למחרת; חזור על זה בינוני הופך חומצי.
        התראה: [O] להתמודד עם תאים וחומרים לפי תקנות אבטחה, כמו וירוס עשויה להיות נוכח של תרביות תאים באמצעות השלבים הבאים. השלך פסולת זיהומית (פוטנציאל) כראוי.
  2. [P] לאסוף, הפצת חלקיקי וירוס.
    1. [P] להתבונן תאים מדי יום על ידי מיקרוסקופ על הכתב ג'ין ביטוי syncytia היווצרות (איור 4). הקציר וירוס כאשר syncytia גדול, המורכב תאים 20 או יותר, גלויים או תאים להפוך צפופה מדי (כלומר., כשהם מתחילים לגדול בשכבות מרובות, בדרך כלל לאחר 7-9 ימים).
      הערה: [P] אם אין syncytia שנצפו בונה ווקטור נתון, זה לא בהכרח אומר כי החילוץ נכשלה. כמו וירוסים זיהומיות עשויות להיות נוכח במדגם, העברת תאים מפיק טריים עבור passaging.
    2. [P] זרע כ 1.5 x 10 תאים מפיק6 ב 12 מ של DMEM עם 10% FBS, על 10 ס מ מנות 24 שעות לפני הקציר הצפוי, או 2.5 x 106 תאים לכל צלחת 4-6 שעות לפני passaging של הווירוס להשיג 65-75% confluency בזמנו של וירוס inoculat יון.
    3. [P] כדי לאסוף וירוס רומא, בזהירות לגרד מפיק חסיד התאים מהצלחת באמצעות מגרד תא ולהעביר את תגובת שיקוע המכיל תאים לתוך שפופרת צנטרפוגה. להסיר את שאריות תאים על ידי צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 2,500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: שרוטים תאים עשוי להיות מועבר ישירות מבלי צנטריפוגה כדי למקסם את וירוס דחויים על חשבון תנאי שיוצרת התרבות וחפצים מיקרוסקופ פוטנציאליים.
      זהירות: הימנעו [O] לשפוך המדיה כאשר גירוד התאים. מזער את היווצרות תרסיס.
    4. [P] להכין על ידי ערבוב את תגובת שיקוע ללא תא מהשלב 2.2.3 בינונית ללא סרום לאמצעי הסופי של 4 מ ל- inoculum. החלפת המדיום על המפיק תאים על-ידי inoculum, דגירה תאים עבור פחות 2 h-CO 37 ° C ו-5%2. להוסיף 6 מ של DMEM עם 10% FBS דגירה תאים בין לילה לפני שינוי המדיום 12 מ של DMEM טריים עם 10% FBS.
    5. [P] לבחון את התאים לפחות פעמיים ביום ואת הקציר וירוס לפני פרץ syncytia (קרי, ממברנה הפרעה הופך גלוי). הקציר המעבר הראשון של וירוס, להסיר את תגובת שיקוע מהצלחת, להוסיף µL 600 בינוני ללא סרום, לגרד תאים עם מרים התא, להעביר צינור נקי.
      הערה: [ז] תלוי וירוס זן51,52 והתקדמות של זיהום, להעביר צלחות עם תאים נגועים 32 ° C כדי להקל על שכפול ויראלי וכפולה. באופן כללי, MV שוורץ זנים להפיץ טוב ב- 37 מעלות צלזיוס, תוך העברת תאים נגועים בוירוסים זן edmonston ב B 32 ° C תוצאות היווצרות syncytia איטי יותר אך titers גבוהה יותר.
      הערה: [P] אינם מאפשרים את שכבת תאים להתייבש במשך הקציר, כמו התוצאה תהיה infectivity מופחת של נגיפים. למרות כמה וירוס אבודים כשזה מגיע. להסתרת את תגובת שיקוע של תאים נגועים, ניתן להשיג titers גבוהה משכבת תאים.
    6. [P] מיד להקפיא את המתלים וירוס בחנקן נוזלי. חנות ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות להבטיח יסודית קפוא. להאריך עד כמה ימים כדי להפסיק את ההליך, במידת הצורך.
    7. לשחרר חלקיקים נגיפיים ידי מפשיר ב 37 º C. Homogenize על ידי vortexing, צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 2,500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס. להעביר את supernatants cryotubes שכותרתו וחנות ב-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: [O] לאחסן וירוסים בגדלים aliquot נאותה לניסויים מאוחר יותר, כפי הם מעדיפים הקרת פעם אחת בלבד, שימוש באופן מיידי. [P] נוסף ההקפאה-הפשרה מחזורי או אחסון ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר ימים התוצאה בהפחתה משמעותית של titers ויראלי.
    8. [P] יום אחד לפני passaging נוספת כדי להשיג את הכמות הנדרשת כייל נוגדנים, זרע 4 x 106 תאים מפיק 12 מ של DMEM עם 10% FBS על מנות 15 ס מ. לחסן עם וירוס-ריבוי של זיהום (MOI) של 0.03. להדביק ב mL 8 ללא סרום בינוני לכל צלחת ושנה בינונית ל- DMEM עם 10% FBS לאחר המקננת תאים עבור פחות 2 ה סולם למעלה באמצעות לוחות מרובים.
    9. הקציר כפי שמתואר שלב 2.2.5, כאשר syncytia התפשטו לאורך השכבה כל התא. מאגר של המתלים שהושג ב 50 מ ל צינורות, תהליך כפי שמתואר שלבים 2.2.6–2.2.7.
      הערה: [O]. זה חיוני לבדוק את כל הצלחות באופן חזותי עבור חיידקים ופטריות זיהום לפני הקציר. באופן כללי, בדוק את כל השורות תא באופן קבוע עבור זיהום עם mycoplasma או וירוסים adventitious על ידי ה-PCR מולטיפלקס.
  3. [P] הערך נגיפי titers. לקבוע titers של וירוס מניות ב- octuplicates לכל aliquot באמצעות לוחות 96-ובכן. לבצע טיטור של שלוש aliquots בודדים לכל וירוס הצלה ולהשתמש הערך הממוצע כדי לחשב את הכמות של וירוסים ההשעיה כדי לשמש בניסויים.
    1. [P] בריכת המפיק תאים, ספירה, ולהתאים את 1.5 x 10 תאי5 מ ל DMEM עם 10% FBS.
    2. [P] pipet 90 µL של DMEM עם 10% FBS לתוך כל טוב של צלחת 96-ובכן.
    3. [P] להוסיף 10 µL aliquot אחד של המניה וירוס אל כל בארות 8 בעמודה הראשונה של הצלחת ומערבבים היטב על-ידי pipetting למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים.
    4. [P] ביצוע דילולים 10-fold סדרתי של הנגיף. העברת 10 µL של כל טוב מן הראשונים העמודה השניה באמצעות של pipet רב-ערוצי. לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה ולהשתמש pipet טריים טיפים עבור כל שלב דילול. להתעלם µL 10 מכל קידוח של העמודה האחרונה.
      הערה: כל צלחת 96-ובכן מאפשר 12 השלבים דילול טורי. [ז] וקטורים MV, 8 צעדים של דילולים 10-fold מספיקים בדרך כלל, כפי titers לעיל עונה 1 פרק 109 תאים יחידות זיהומיות (ciu לקדם) /mL מתקבלים לעיתים רחוקות בשיטה של התפשטות שמתואר בשלב 2.2. [P] וולס בקרה ללא וירוס ניתן להשוואה וכדי לפקח על זיהום.
    5. [P] להוסיף 100 µL תא השעיה מכל קידוח, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 עבור 48 ה ודא העדר תא גושים ההשעיה להשגת הומוגנית חלוקת תאים.
    6. [P] בדוק syncytia באמצעות מיקרוסקופ אור. הרוזן syncytia היטב כל העמודה עם הגורם הדילול הגבוהה ביותר המכיל syncytia גלויה.
    7. [P] לחשב את המספר הממוצע של syncytia לכל טוב באותה עמודה על-ידי חלוקת המספר הכולל של syncytia עד שמונה. להכפיל את הממוצע עם הגורם דילול של העמודה בהתאמה, החל מ- 10 ciu לקדם2 לכל mL עבור העמודה הראשונה53 (ראה איור 5 כדוגמה).

3. קביעת Replicative ויכולות ציטוטוקסיות של וקטורים ויראלי קידוד Immunomodulators

  1. [O] השווה שכפול קינטיקה של וירוס רקומביננטי שנוצר ולא הווקטור יאומתו באמצעות עקומות גדילה בשלב אחד או צעד מרובת (Gc). עבור מחשבי: קטלוגים כלליים בשלב אחד, רומא ויראלי הם העריכו בעקבות זיהום בו זמנית של כל התאים (תיאורטית, 100% זיהום). רב שלבי ההתחלה מחשבי קטלוגים כלליים על אחוז נמוך של תאים נגועים לעקוב אחרי כמה סיבובים של וירוס שכפול.
    1. [ז] לניתוח של קינטיקה שכפול הוירוס חצבת, זרע עונה 1 פרק 105 תאים Vero ב 1 מ"ל של DMEM עם 10% FBS לכל טוב על. ובכן 12 צלחות יום אחד לפני זיהום. צלחת לפחות שתי בארות עבור כל timepoint עניין כמו משכפל טכני.
    2. [O] להדביק את התאים בווירוס. נמוכה שהוויזה בתוקף רב שלבי או MOI גבוהה עבור מחשבי קטלוגים כלליים בשלב אחד [מ] (0.03 ו- 3 עבור שכפול MV ב- Vero תאים, בהתאמה). החלף בינוני µL 300 בינוני ללא סרום המכיל את הכמות המתאימה של וירוס, דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 לפחות 2 ה' הסר inoculum, להוסיף 1 מ"ל של DMEM עם 10% FBS, ולהמשיך הדגירה.
    3. [P] בבית timepoints רלוונטי כגון 12, 24, 36, 48, 72 ו- h 96 לאחר ההדבקה, לקצור ויראלי רומא על ידי ישירות גירוד התאים לתוך האמצעי. להעביר תוכן מכל קידוח שפופרת בודדים, snap-הקפאת בחנקן נוזלי, לאחסן ב- 80 ° C עד טיטור.
      הערה: [P] דוגמאות שכפל ייתכן איחדו בשלב זה לניתוח של titers הממוצעת.
    4. [P] לאסוף דגימות timepoints כל. להפשיר בו זמנית ב 37 מעלות צלזיוס להערכת צאצאי ויראלי. מערבולת, גלולה שאריות תאים על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 2500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס.
    5. [P] לחשב ממוצע titers של כל מבנה, timepoint כפי שתואר לעיל. מגרש titers לאורך זמן. להשוות עקומות גדילה של וקטורים עם ובלי transgenes שנוסף, עם transgenes שונים, או עם transgenes מוכנס לעבר עמדות שונות (ראה איור 6א).
  2. [O] השווה lytic פעילויות של וירוסים קידוד immunomodulator ולא יבוצעו בהם שינויים.
    1. [O] בחר מתוך מתודולוגיות אפשרי כולל מדידות עכבה, לקטט דהידרוגנאז (LDH) לשחרר assay, או מבוסס-מטבוליזם התא ערכי צבע מוחלטים הכדאיות מבחני [למשל, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT ) ו 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) מבחני].
      1. [ז] לנתח את cytotoxicity של חצבת וירוס וקטורים באמצעות XTT assay, תאים Vero זרע כפי שמתואר בשלב 3.1.1. כוללים/בית לבריא פקד עבור כל timepoint.
        הערה: [O] ביצוע XTT assay בבית timepoints שונים באותה דגימת זרע יכול להגביל את שגיאות טכניות, אבל הכביסה חוזרות וחשיפה ריאגנט XTT משפיע על מספר התאים קיימא. עכבה מספק readout חלופית של מדידות רציפה.
    2. [ז] להדביק תאים Vero ב MOI 1 כפי שמתואר בשלב 3.1.2.
      הערה: [ז] לדלקת של תאים פחות מתירניות היעד כמו כמה שורות תאים סרטניים מאתר, MOI גבוה 3 או 5 ייתכן שיהיה צורך.
    3. [O] בבית timepoints עניין (למשל., 12, 24, 36, 48, 72 ו- h 96 לאחר ההדבקה) להכין את הכמות הנדרשת של ריאגנט XTT (כלומר., µL 300 לאדם טוב פלוס 10% עודף). למנוע חשיפה קלה.
    4. [ז] על כל timepoint, הסר בינוני ולס המתאימות. להחליף על ידי 300 µL של ריאגנט XTT, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. איסוף supernatants כאשר הכימית ב הבארות שליטה הפך אדום עמוק, אשר בדרך כלל לוקח בין 15 דקות ו- 2 h, ומקפיאים ב-20 ° C.
      הערה: [O] אינקובציה פעמים תלויים לבנות וירוס, סוג התא, צפיפות, אפקט ציטופתי.
    5. [O] לאחר איסוף כל הדגימות, להפשיר בו זמנית. להעביר 100 µL של כל מדגם צלחת 96-ובכן ולמדוד את ספיגת אופטי-450 nm, עם 630 ננומטר כמו אורך גל הפניה.
    6. [O] מגרש timepoints (ציר x) לעומת. ספיגת אופטי של דגימות ביחס פקדים, המציינת פעילות חילוף החומרים בתור פונדקאית עבור תא הכדאיות (ציר y). הפחתת ספיגת יחסית לאורך זמן מרמז cytotoxicity ויראלי (ראה איור 6B).

4. ניתוח פעילות של Immunomodulators מקודד הווירוס מופרש מתאי נגוע

  1. [O] transgene מופרשים ולבודד מוצרים לידי ביטוי התאים הנגועים בנגיף היעד.
    1. [P] תן מפיק וירוס תאים לגדול 70% confluency ב T175 המבחנות.
    2. [P] להסיר את המדיום של תאים, לשטוף פעמיים עם 12 מ של PBS להסיר בסרום. לחסן תאים עם הוירוס MOI של 0.03 ב 12 מ ל בינונית ללא סרום, דגירה-CO של 37 ° C ו- 5%-2 בלילה. החלף בינוני 12 מ ל בינונית ללא סרום טריים.
      1. [ז] עבור וירוסים edmonston ב B, להעביר תאים מ 37 עד 32 ° C לאחר ה 40 עבור עוד 24 שעות של דגירה כדי להקל על זיהום ולמנוע התפוצצותה מוקדמת של syncytia. בהתאם למתח וירוס התקדמות52 ו- syncytia51,, דגירה טמפרטורות ושעות ייתכן לכוונן את התשואה חלבון אופטימלי וטוהר.
    3. [P] בזהירות לאסוף supernatants ללא תאים התולש לפני פרץ syncytia. בצורה אופטימלית, syncytia התפשטו לאורך השכבה כל התא. בריכת supernatants צינורות 50 מ.
      הערה: [P] עבור טיהור יעיל של המוצר transgene, להימנע התפוצצותה של syncytia, למזער את שאריות תאים כאשר לקצור את supernatants של תאים נגועים.
    4. [P] להסיר שאריות תאים תגובת שיקוע על ידי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 2500 x g ו 4 ° C ועובר דרך מסננים מיקרומטר 0.22. בהתאם לנפח הכולל של פילטרט של, זה ניתן לבצע באמצעות מזרק או של משאבת ואקום.
    5. [O] לבודד transgene מוצר באמצעות שיטת טיהור המתאים. לטהר חלבונים עם תג hexa-היסטידין (שלו) על ידי exchange כרומטוגרפיית זיקה באמצעות Ni-נ ספין מיני עמודות38 כפי שמתואר כאן בקצרה (צעדים 4.1.5.1–4.1.5.4).
      הערה: [O] לבצע את כל השלבים מהר על קרח. מראש להירגע buffers וצנטריפוגה מראש מגניב עד 4 ° C.
      1. [O] להכין 100 מ"ל כל מאגר עם PBS, 200 מ"מ נתרן כלוריד, imidazole בריכוזים הסופי של 10 מ מ (כביסה מאגר 1, WB1), 20 מ מ (שטיפת מאגר 2, WB2), 500 מ מ (מאגר • תנאי, EB). להתאים את ה-pH של WB1 ושל WB2 כדי 8.0 ושל EB אל 7.0. בהתאם החלבון כדי להיטהר, ריכוזי imidazole עשוי להיות יותאם.
      2. [O] equilibrate עמודות עם 600 µL של WB1, צנטריפוגה ב x 800 גרם למשך 2 דקות עם מכסה פתוח.
      3. [O] לטעון 600 µL של supernatants מסוננים על גבי עמודות. מאפשרים קשירה של חלבונים שלו מתויג למטריקס עמודה על-ידי צנטריפוגה ב x 200 גרם 5 דקות עם מכסה סגור. ניתן לחזור על טעינת ואיגוד עד סך של 300 µg שלו מתויג חלבון בכל עמודה.
      4. [O] לשטוף שלוש פעמים עם WB1 ופעם עם WB2, או עד הזרימה דרך חסר צבע. להוסיף 600 µL של המאגר, ספין-800 x גרם למשך 2 דקות עם מכסה פתוח.
      5. [O] elute החלבון לתוך צינור טריים על-ידי ביצוע שני צעדים • תנאי עם 300 µL EB, צנטריפוגה למשך 2 דקות ב x 800 גרם.
      6. [O] desalt, להתרכז מוצר באמצעות מסננים צנטריפוגלי בהתאם לגודל המוצר. להוסיף PBS נפח של 15 מ"ל, מסנן באמצעות צנטריפוגה 10 דקות ב x 4,000 גרם. אני חוזר עד טוהר הרצוי, ריכוז מושגת. כדי להגדיל את ריכוז חלבון, להפחית את נפח סופי כדי µL כ 200 על ידי צנטריפוגה למשך 40 דקות ב x 4,000 גרם.
  2. [O] לאשר טוהר והזהות של המוצר.
    1. [O] לכמת את כמות חלבון הכולל מבודד באמצעות מבחני ערכי צבע מוחלטים סטנדרטיים כגון חומצה bicinchoninic (BCA) או ברדפורד assay54,55. [M] ערכי טיפוסי יכול לנוע בין 1-3 µg transgene מוצר לפי תגובת שיקוע מ"ל של תאים נגועים.
    2. [O] על כימות היחסי של חלבון מבודד, להפריד באמצעות סודיום dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) ולבצע Coomassie מכתים56.
    3. [O] לאשר את הזהות של המוצרים מטוהרת על ידי immunoblotting בעזרת נוגדנים ספציפיים מיקוד החלבון או תג של פפטיד המשויך57.
    4. [O] לנתח חלבון מחייב ירידה לפרטים באמצעות טכניקות המתאימות העשויות לכלול מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה) או לזרום cytometry (ראה איור 7). איגוד התא יכול לאשר שימוש assay תיאר לאחרונה הנפתח מגנטי38.
      הערה: [O] השתמש בפקדי המתאים. תא מבחני הכריכה, לכלול פקדים שלילי עם תאים לא מבטא את המולקולה יישוב (כמו ב איור 9), חלבון ללא פילוח המחליפים (איור 8). בניסויים cytometry זרימה, כוללים חיובי, שלילי בקרות isotype (איור 7).
      1. [O] שיתוף דגירה היעד תאים וחלבונים לבודד כדי לאפשר מחייב. [B] עבור מחייב ניתוח של BTEs לדם ההיקפי תאי תאי (PBMCs) מבודד דם אנושי58, דגירה 2.5 x 106 תאים עם 200 ng של BTE ב µL 100 ל- PBS עם 1% FBS (מאגר מחייב, BB) עבור h 1 על קרח.
      2. [B] שטיפת תאים עם 1 מ"ל של BB להסרת חלבון לא מאוגד. צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend צנפה ב 100 µL של BB. מוסיפים נוגדן biotinylated מיקוד החלבון עניין או תג פפטיד משויך, דגירה על קרח למשך 30 דקות. עבור BTEs עם שפעת hemagglutinin (HA) תג, שימוש 100 ננוגרם של אנטי-HA-ביוטין (שיבוט 3F10).
      3. [B] לשטוף תאים פעמיים עם 1 מ"ל של BB, resuspend, µL 80 של BB. להוסיף 20 µL של גרגרי מגנטי מצמידים streptavidin ולאחר תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 º C.
      4. [B] השטיפה פעם כדי להסיר עודפי חרוזים, resuspend צנפה ב 500 µL של BB בתוספת 2 מ מ EDTA (מאגר עמודה, CB).
      5. [B] לבודד תאים עם עמודות ו עמדה מגנטי לפי המדריך של הספק.
        1. [B] equilibrate על-ידי מתן µL 500 של CB לעבור דרך העמודה על-ידי כוח הכבידה זרם.
          הערה: [B] העמודה חייבים להתייבש. Pipet בקפידה, דגה המאגרים להימנע בועות.
        2. [B] למקם צינור נקי תחת העמודה ולהחיל התליה תא/חרוז על העמודה. לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 500 µL של CB לכל לשטוף. לאסוף זרימה דרך דגימות של המתלה ושל לפחות כביסה הצעד הראשון בצינור ולאחר מכן לאחסן בקירור.
        3. [B] elute חרוז מכורך תאים נשמרים על ידי השדה המגנטי. לשם כך, הסר את העמודה הדוכן מגנטי, למקמו מעל צינור נקי, להוסיף 1 מ"ל של CB, ודחף במהירות המאגר באמצעות המדור לתוך הצינורית באמצעות פומפה. שמור את הצינורית על קרח.
      6. [B] צנטריפוגה צינורות המכיל דוגמאות זרימה דרך ו • תנאי למשך 20 דקות ב- 16,000 x g ו- 4 ° C עד הצניפה תאים. למחוק את supernatants ואת lyse תאים במאגר assay (ריפה) radioimmunoprecipitation (המוצע: 75 µL). לבצע מרחביות-עמוד56.
      7. [B] immunoblotting באמצעות נוגדן ראשוני מתאימים לבצע. נוגדנים עשויים למקד את המוצר transgene או חלבון תאית (למשל., β-אקטין, איור 8) כדי להעריך BTE-תא מחייב.
  3. [O] להעריך את הפונקציונליות אימונולוגי של immunomodulators מבודדים.
    1. [O] לזהות מבחני הרלוונטי לפי מאפייני immunomodulator מקודד. בנוגע לפעילות immunomodulatory הצפוי, שיטות הערכת התפשטות תאים, הגירה, התבגרות, הפעלה או cytotoxicity ניתן להחיל.
      הערה: [O] התפשטות תאים ניתן לנתח באמצעות תיוג59 CFSE או מכתימים Ki6760. ניסויים Transwell או לשרוט זמינים לנתח תא העברה61. ההבשלה והפעלה של תאים יכול להיות מוערך באמצעות פרוטוקולי מכתימים המתאים עבור סמני בהתאמה. [B] זמינה טכניקות כדי להעריך בתיווך BTE cytotoxicity הסלולר כוללות עכבה מדידות ו כרום לשחרר וזמינותו. אם בחירה וזמינותו שחרור כרום, להתבונן אמצעי בטיחות נאותים בעת טיפול חומר רדיואקטיבי.
    2. [B] בתור חלופה לא-רדיואקטיבי, להלן מתאר בפירוט כיצד להעריך BTE-induced, תאית cytotoxicity על ידי LDH שחרור assay (כפי שתוארה לעיל בקצרה38).
      1. [B] להחליט על תנאים להיבדק במהלך הניסוי (ראה איור 9 כדוגמה). Timepoints (שעות עד ימים), ריכוזי immunomodulator (pg/mL כדי µg/mL), יכולים להיות מגוונים אפקטור אל היעד יחסי תא (E:T) (בין 1:50 50:1, למשל). תמיד הכינו דגימות ב- triplicates.
      2. [B] לכלול דוגמאות ללא חלבון ולשחרר ללא תאים אפקטור, פקדים עבור LDH ספונטנית של סוגי לתא בודד (Tsp ו- Esp), פקד פירוק המרבי תא מטרה (Tmax) עם חומר ניקוי נוסף לפני הבדיקה, מדיום רק שליטה, פקד עוצמת הקול עבור Tmax.
        הערה: [B] נדרש מספר התאים היעד ושעות אינקובציה יכול להשתנות. לבצע מבחן ראשוני פועל ללא תאים אפקטור, immunomodulators כדי לזהות פרמטרים אופטימליים. כוללים Tsp ו Tmax ודוגמאות הפקדים המתאימים כדי להעריך את מספרי הטלפון הנייד שונים ו- timepoints.
      3. [B] בידוד תאי מערכת החיסון אפקטור, למשל על-ידי (צפיפות, הדרגתיות צנטריפוגה של דם אנושי כדי לקבל PBMCs58 ) או שלילי מבחר מאתר T תאים מן העכבר splenocytes62.
      4. [B] זרע היעד תאים על פי שלב 4.3.2 (למשל, 5 x 10³ לכל טוב) לתוך צלחת U-התחתון 96-ובכן.
      5. [B] להוסיף חלבון מבודד בריכוזים הרצויים כדי הדגימות בהתאמה. להוסיף תאים חיסוניים אפקטור היחס הרצוי. להוסיף בינוני הנפח הכולל של µL 100 לכל טוב.
      6. [B] Incubate עבור מסגרת הזמן נקבע צעד 4.3.2, בדרך כלל בין 4 ל- 48 שעות (24 h עבור unstimulated PBMCs ו- h 48 עבור תאי T מאתר טרי מבודדים; פעמים דגירה קצר יכול להגיש בקשה prestimulated תאים חיסוניים), ב- CO 37 ° C ו-5%2.
      7. [B] 45 דקות לפני איסוף הדגימות, להוסיף 10 µL של 10 x פירוק פתרון בארות המכיל Tmax ודוגמאות הפקדים בינונית המתאימה. המשך הדגירה.
      8. [B] ספין למטה תאים ב x 250 g עבור 4 דק 50 להעביר µL של כל תגובת שיקוע על צלחת 96-ובכן שטוח התחתונה. אל תעביר תאים כדי להימנע תא מכורך LDH.
      9. [B] הכנת המצע פתרון על פי היצרן. להוסיף 50 µL מכל קידוח, דגירה-RT בחושך למשך 30 דקות או עד טימקס דגימות אדום עמוק.
      10. [B] להוסיף 50 µL של להפסיק פתרון טוב לכל. להסיר בועות אוויר על ידי צנטריפוגה עבור 1 דקות ב x 4,000 גרם, באופן ידני עם מחט חלולה. למדוד את ספיגת אופטי 490 nm.
      11. [B] לחשב ערכים ספציפיים פירוק % עבור כל דגימה.
        1. [B] לחשב ממוצעים עבור בית פקדים בינוני עם וללא פירוק פתרון. להחסיר ערכים שהושג דגימות ניסיוני ומן Tמקס ופקדי לשחרור ספונטני, בהתאמה. השתמש בערכים אלה תוקנו-רקע לחישובים נוספים.
        2. [B] לחשב ממוצעים עבור מתוקן-רקע Tmax, Tspופקדים Esp . המשוואה הבאה באמצעות ממוצע של ערכים אלה, התשואות האחוז של פירוק ספציפיים עבור כל דגימה:

          figure-protocol-25412
        3. [B] להתוות % פירוק ספציפי ערכים לעומת חלבון ריכוז או יחס E:T, להשוות בין דגימות הבקרה ללא פילוח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 1 מדגימה את מנגנון הפעולה של וירוסי חצבת oncolytic קידוד bispecific תא T engagers. תרשים זרימה המתאר את זרימת העבודה של פרוטוקול זה מוצגת באיור2. איור 3 מראה דוגמה של גנום הוירוס חצבת oncolytic שונה. זה מספק ייצוג חזותי של השינוי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Oncolytic חיסוני (כלומר., שעות נוספות בשילוב עם immunomodulation) טומן בחובו הבטחה גדולה לטיפול בסרטן, בדרישה נוספת פיתוח ואופטימיזציה של וירוסים oncolytic קידוד חלבונים immunomodulatory. פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי ליצור ולאמת כזה וקטורים עבור בדיקות עוקבות הרלוונטיים במודלים פרה, תרגום קליניים עתידיים פוטנ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Engeland לספירה מופיע בתור שותף הממציא של וירוסים RNA לגבי פטנטים עבור סרטן Immunovirotherapy בבעלות אוניברסיטת היידלברג. J.P.W. Heidbuechel אין לחשוף.

Acknowledgements

שיטות אלה הוקמו בקבוצה Virotherapy בראשות פרופסור ד ר ד ר גיא Ungerechts במרכז הלאומי למחלות הגידול בהיידלברג. . אנחנו חבים לו ואת כל חברי צוות מעבדה, במיוחד ד ר טוביאס שפק, ד ר Rūta Veinalde, ג'ודית פורסטר, בירגיט Hoyler ו ג'סיקה אלברט. עבודה זו נתמכה על ידי עוד Kröner-Fresenius-Stiftung (גרנט 2015_A78 כדי Engeland לספירה) של קרן המדע הלאומית הגרמנית (DFG, להעניק EN 1119/2-1 לספירה Engeland). J.P.W. Heidbuechel מקבל מלגה על ידי הלמהולץ הבינלאומי המדרשה לחקר הסרטן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Rapid DNA Dephos & Ligation KitRoche Life Science, Mannheim, Germany4898117001
CloneJET PCR Cloning KitThermo Fisher Scientific, St. Leon-RotK1231
AgaroseSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyA9539-500G
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN, Hilden, Germany28704
NEB 10-beta Competent E. coliNew England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, GermanyC3019I
LB medium after LennoxCarl Roth, Karlsruhe, GermanyX964.1
AmpicillinCarl Roth, Karlsruhe, GermanyHP62.1
QIAquick Miniprep KitQIAGEN, Hilden, Germany27104
Restriction enzyme HindIII-HFNew England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, GermanyR3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Invitrogen, Darmstadt, Germany31966-021
Fetal bovine serum (FBS)Biosera, Boussens, FranceFB-1280/500
FugeneHDPromega, Mannheim, GermanyE2311may be replaced by transfection reagent of choice
KanamycinSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyK0129
Vero cellsATCC, Manassas, VA, USACCL81
B16-CD46/ B16-CD20-CD46J. Heidbuechel, DKFZ Heidelbergavailable upon request
Granta-519DSMZ, Braunschweig, GermanyACC 342
Opti-MEM (serum-free medium)Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany31985070
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)PromoKine, Heidelberg, GermanyPK-CA20-300-1000includes XTT reagent
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS)Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin ColumnsQIAGEN, Hilden, Germany31014
Sodium chlorideCarl Roth, Karlsruhe, Germany3957.3
ImidazoleCarl Roth, Karlsruhe, GermanyI5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDaMerck, Darmstadt, GermanyUFC901024
BCA Protein Assay KitMerck Milipore71285-3
IgG from human serumSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyI4506
Anti-HA-PEMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-092-257RRID: AB_871939
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibodyBD Biosciences, Heidelberg, Germany555749RRID: AB_396091
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany12158167001RRID: AB_390915
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-090-485
MS ColumnsMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-042-201
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-042-303
RIPA bufferRockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USAMB-030-0050
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity AssayPromega, Mannheim, GermanyG1780includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution
Cell lifterCorning, Reynosa, Mexico3008
10 cm dishesCorning, Oneonta, NY, USA430167
15 cm dishesGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany639160
96-well plates, U-bottomTPP, Trasadingen, Switzerland92097
96-well plates, flat bottomNeolab, Heidelberg, Germany353072
6-well platesNeolab, Heidelberg, Germany353046
12-well platesNeolab, Heidelberg, Germany353043
50 mL tubesnerbe plus, Winsen/Luhe, Germany02-572-3001
T175 cell culture flasksThermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot159910
0.22 µm filtersMerck, Darmstadt, GermanySLGPM33RS

References

  1. Lichty, B. D., Breitbach, C. J., Stojdl, D. F., Bell, J. C. Going viral with cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (8), 559-567 (2014).
  2. Cassady, K. A., Haworth, K. B., Jackson, J., Markert, J. M., Cripe, T. P. To Infection and Beyond: The Multi-Pronged Anti-Cancer Mechanisms of Oncolytic Viruses. Viruses. 8 (2), (2016).
  3. Twumasi-Boateng, K., Pettigrew, J. L., Kwok, Y. Y. E., Bell, J. C. Oncolytic viruses as engineering platforms for combination immunotherapy. Nature Reviews Cancer. , (2018).
  4. Achard, C., et al. Lighting a Fire in the Tumor Microenvironment Using Oncolytic Immunotherapy. EBioMedicine. 31, 17-24 (2018).
  5. Kelly, E., Russell, S. J. History of oncolytic viruses: genesis to genetic engineering. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 15 (4), 651-659 (2007).
  6. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nature Biotechnology. 30 (7), 658-670 (2012).
  7. Russell, S. J., Peng, K. W. Oncolytic Virotherapy: A Contest between Apples and Oranges. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (5), 1107-1116 (2017).
  8. Seymour, L. W., Fisher, K. D. Oncolytic viruses: finally delivering. British Journal of Cancer. 114 (4), 357-361 (2016).
  9. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  10. Gao, Q., Park, M. S., Palese, P. Expression of transgenes from newcastle disease virus with a segmented genome. Journal of Virology. 82 (6), 2692-2698 (2008).
  11. Billeter, M. A., Naim, H. Y., Udem, S. A. Reverse genetics of measles virus and resulting multivalent recombinant vaccines: applications of recombinant measles viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 329, 129-162 (2009).
  12. Matveeva, O. V., Guo, Z. S., Shabalina, S. A., Chumakov, P. M. Oncolysis by paramyxoviruses: multiple mechanisms contribute to therapeutic efficiency. Molecular Therapy Oncolytics. 2, (2015).
  13. Suter, S. E., et al. In vitro canine distemper virus infection of canine lymphoid cells: a prelude to oncolytic therapy for lymphoma. Clinical Cancer Research. 11 (4), 1579-1587 (2005).
  14. Ammayappan, A., Russell, S. J., Federspiel, M. J. Recombinant mumps virus as a cancer therapeutic agent. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16019(2016).
  15. Schirrmacher, V. Oncolytic Newcastle disease virus as a prospective anti-cancer therapy. A biologic agent with potential to break therapy resistance. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (12), 1757-1771 (2015).
  16. Saga, K., Kaneda, Y. Oncolytic Sendai virus-based virotherapy for cancer: recent advances. Oncolytic Virotherapy. 4, 141-147 (2015).
  17. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Netesov, S. V., Onikienko, S. B., Chumakov, P. M. Mechanisms of Oncolysis by Paramyxovirus Sendai. Acta Naturae. 7 (2), 6-16 (2015).
  18. Gainey, M. D., Manuse, M. J., Parks, G. D. A hyperfusogenic F protein enhances the oncolytic potency of a paramyxovirus simian virus 5 P/V mutant without compromising sensitivity to type I interferon. Journal of Virology. 82 (19), 9369-9380 (2008).
  19. Engeland, C. E., et al. A Tupaia paramyxovirus vector system for targeting and transgene expression. The Journal of General Virology. 98 (9), 2248-2257 (2017).
  20. Russell, S. J., Peng, K. W. Measles virus for cancer therapy. Current Topics in Microbiology and Immunology. 330, 213-241 (2009).
  21. Aref, S., Bailey, K., Fielding, A. Measles to the Rescue: A Review of Oncolytic Measles Virus. Viruses. 8 (10), (2016).
  22. Demicheli, V., Rivetti, A., Debalini, M. G., Di Pietrantonj, C. Vaccines for measles, mumps and rubella in children. The Cochrane Database of Systematic Reviews. (2), 004407(2012).
  23. Radecke, F., et al. Rescue of measles viruses from cloned DNA. The EMBO Journal. 14 (23), 5773-5784 (1995).
  24. Martin, A., Staeheli, P., Schneider, U. RNA polymerase II-controlled expression of antigenomic RNA enhances the rescue efficacies of two different members of the Mononegavirales independently of the site of viral genome replication. Journal of Virology. 80 (12), 5708-5715 (2006).
  25. Russell, S. J., et al. Remission of disseminated cancer after systemic oncolytic virotherapy. Mayo Clinic Proceedings. 89 (7), 926-933 (2014).
  26. Hardcastle, J., et al. Immunovirotherapy with measles virus strains in combination with anti-PD-1 antibody blockade enhances antitumor activity in glioblastoma treatment. Neuro-Oncology. 19 (4), 493-502 (2017).
  27. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  28. Galanis, E., et al. Phase I trial of intraperitoneal administration of an oncolytic measles virus strain engineered to express carcinoembryonic antigen for recurrent ovarian cancer. Cancer Research. 70 (3), 875-882 (2010).
  29. Galanis, E., et al. Oncolytic measles virus expressing the sodium iodide symporter to treat drug-resistant ovarian cancer. Cancer Research. 75 (1), 22-30 (2015).
  30. Kurokawa, C., et al. Constitutive Interferon Pathway Activation in Tumors as an Efficacy Determinant Following Oncolytic Virotherapy. Journal of the National Cancer Institute. , (2018).
  31. Msaouel, P., et al. Clinical Trials with Oncolytic Measles Virus: Current Status and Future Prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  32. Grote, D., Cattaneo, R., Fielding, A. K. Neutrophils contribute to the measles virus-induced antitumor effect: enhancement by granulocyte macrophage colony-stimulating factor expression. Cancer Research. 63 (19), 6463-6468 (2003).
  33. Grossardt, C., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-armed oncolytic measles virus is an effective therapeutic cancer vaccine. Human Gene Therapy. 24 (7), 644-654 (2013).
  34. Iankov, I. D., et al. Expression of immunomodulatory neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori enhances the antitumor activity of oncolytic measles virus. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (6), 1139-1147 (2012).
  35. Engeland, C. E., et al. CTLA-4 and PD-L1 Checkpoint Blockade Enhances Oncolytic Measles Virus Therapy. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 22 (11), 1949-1959 (2014).
  36. Veinalde, R., et al. Oncolytic measles virus encoding interleukin-12 mediates potent antitumor effects through T cell activation. Oncoimmunology. 6 (4), 1285992(2017).
  37. Hutzler, S., et al. Antigen-specific oncolytic MV-based tumor vaccines through presentation of selected tumor-associated antigens on infected cells or virus-like particles. Scientific Reports. 7 (1), 16892(2017).
  38. Speck, T., et al. Targeted BiTE expression by an oncolytic vector augments therapeutic efficacy against solid tumors. Clinical Cancer Research. , (2018).
  39. Andtbacka, R. H., et al. Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33 (25), 2780-2788 (2015).
  40. Ribas, A., et al. Oncolytic Virotherapy Promotes Intratumoral T Cell Infiltration and Improves Anti-PD-1 Immunotherapy. Cell. 170 (6), 1109-1119 (2017).
  41. Patel, S. J., et al. Identification of essential genes for cancer immunotherapy. Nature. 548 (7669), 537-542 (2017).
  42. Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science. 73, Unit 9.9 (2013).
  43. Cattaneo, R., Rebmann, G., Baczko, K., ter Meulen, V., Billeter, M. A. Altered ratios of measles virus transcripts in diseased human brains. Virology. 160 (2), 523-526 (1987).
  44. Gutsche, I., et al. Structural virology. Near-atomic cryo-EM structure of the helical measles virus nucleocapsid. Science. 348 (6235), New York, N.Y. 704-707 (2015).
  45. Kolakofsky, D., et al. Paramyxovirus RNA synthesis and the requirement for hexamer genome length: the rule of six revisited. Journal of Virology. 72 (2), 891-899 (1998).
  46. Kolakofsky, D., Roux, L., Garcin, D., Ruigrok, R. W. Paramyxovirus mRNA editing, the "rule of six" and error catastrophe: a hypothesis. The Journal of General Virology. 86, Pt 7 1869-1877 (2005).
  47. Parks, C. L., et al. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. Journal of Virology. 75 (2), 921-933 (2001).
  48. JoVE Science Education Database. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  49. JoVE Science Education Database. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  50. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  51. Rota, J. S., Wang, Z. D., Rota, P. A., Bellini, W. J. Comparison of sequences of the H, F, and N coding genes of measles virus vaccine strains. Virus Research. 31 (3), 317-330 (1994).
  52. Bankamp, B., Takeda, M., Zhang, Y., Xu, W., Rota, P. A. Genetic characterization of measles vaccine strains. The Journal of Infectious Diseases. 204, Suppl 1 533-548 (2011).
  53. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of Experimental Medicine. 99 (2), 167-182 (1954).
  54. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  55. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  56. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  57. JoVE Science Education Database. The Western Blot. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  58. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. Journal of Visualized Experiments. (91), e51554(2014).
  59. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. Journal of Visualized Experiments. (44), (2010).
  60. Gerdes, J. Ki-67 and other proliferation markers useful for immunohistological diagnostic and prognostic evaluations in human malignancies. Seminars in Cancer Biology. 1 (3), 199-206 (1990).
  61. JoVE Science Education Database. The Transwell Migration Assay. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  62. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), e54596(2016).
  63. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).
  64. Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).
  65. Yu, F., et al. T-cell engager-armed oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 22 (1), 102-111 (2014).
  66. Fajardo, C. A., et al. Oncolytic Adenoviral Delivery of an EGFR-Targeting T-cell Engager Improves Antitumor Efficacy. Cancer Research. 77 (8), 2052-2063 (2017).
  67. Freedman, J. D., et al. Oncolytic adenovirus expressing bispecific antibody targets T-cell cytotoxicity in cancer biopsies. EMBO Molecular Medicine. 9 (8), 1067-1087 (2017).
  68. Wing, A., et al. Improving CART-Cell Therapy of Solid Tumors with Oncolytic Virus-Driven Production of a Bispecific T-cell Engager. Cancer Immunology Research. 6 (5), 605-616 (2018).
  69. Myers, R. M., et al. Preclinical pharmacology and toxicology of intravenous MV-NIS, an oncolytic measles virus administered with or without cyclophosphamide. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (6), 700-710 (2007).
  70. Rittner, K., Schreiber, V., Erbs, P., Lusky, M. Targeting of adenovirus vectors carrying a tumor cell-specific peptide: in vitro and in vivo studies. Cancer Gene Therapy. 14 (5), 509-518 (2007).
  71. Nakamura, T., et al. Rescue and propagation of fully retargeted oncolytic measles viruses. Nature Biotechnology. 23 (2), 209-214 (2005).
  72. Campadelli-Fiume, G., et al. Retargeting Strategies for Oncolytic Herpes Simplex Viruses. Viruses. 8 (3), 63(2016).
  73. Leber, M. F., et al. MicroRNA-sensitive oncolytic measles viruses for cancer-specific vector tropism. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19 (6), 1097-1106 (2011).
  74. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-mediated multi-tissue detargeting of oncolytic measles virus. Cancer Gene Therapy. 21 (9), 373-380 (2014).
  75. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and oncolytic viruses. Current Opinion in Virology. 13, 40-48 (2015).
  76. Miest, T. S., Cattaneo, R. New viruses for cancer therapy: meeting clinical needs. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 23-34 (2014).
  77. Phuong, L. K., et al. Use of a vaccine strain of measles virus genetically engineered to produce carcinoembryonic antigen as a novel therapeutic agent against glioblastoma multiforme. Cancer Research. 63 (10), 2462-2469 (2003).
  78. Dingli, D., et al. Image-guided radiovirotherapy for multiple myeloma using a recombinant measles virus expressing the thyroidal sodium iodide symporter. Blood. 103 (5), 1641-1646 (2004).
  79. Abate-Daga, D., et al. Oncolytic adenoviruses armed with thymidine kinase can be traced by PET imaging and show potent antitumoural effects by ganciclovir dosing. PLoS One. 6 (10), 26142(2011).
  80. Ungerechts, G., et al. Lymphoma chemovirotherapy: CD20-targeted and convertase-armed measles virus can synergize with fludarabine. Cancer Research. 67 (22), 10939-10947 (2007).
  81. Ketzer, P., et al. Artificial riboswitches for gene expression and replication control of DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 554-562 (2014).
  82. Freedman, J., et al. Targeting T-cells to human cancer associated fibroblasts using an oncolytic virus expressing a FAP-specific T-cell engager. Keystone Symposia & Digitell, Inc. , (2018).
  83. Nishio, N., et al. Armed oncolytic virus enhances immune functions of chimeric antigen receptor-modified T cells in solid tumors. Cancer Research. 74 (18), 5195-5205 (2014).
  84. Bressy, C., Benihoud, K. Association of oncolytic adenoviruses with chemotherapies: an overview and future directions. Biochemical Pharmacology. 90 (2), 97-106 (2014).
  85. Wennier, S. T., Liu, J., McFadden, G. Bugs and drugs: oncolytic virotherapy in combination with chemotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (9), 1817-1833 (2012).
  86. Fillat, C., Maliandi, M. V., Mato-Berciano, A., Alemany, R. Combining oncolytic virotherapy and cytotoxic therapies to fight cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6513-6521 (2014).
  87. Li, H., Peng, K. W., Russell, S. J. Oncolytic measles virus encoding thyroidal sodium iodide symporter for squamous cell cancer of the head and neck radiovirotherapy. Human Gene Therapy. 23 (3), 295-301 (2012).
  88. Opyrchal, M., et al. Effective radiovirotherapy for malignant gliomas by using oncolytic measles virus strains encoding the sodium iodide symporter (MV-NIS). Human Gene Therapy. 23 (4), 419-427 (2012).
  89. Mansfield, D., et al. Oncolytic Vaccinia virus and radiotherapy in head and neck cancer. Oral Oncology. 49 (2), 108-118 (2013).
  90. Miest, T. S., et al. Envelope-chimeric entry-targeted measles virus escapes neutralization and achieves oncolysis. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19 (10), 1813-1820 (2011).
  91. Santiago, D. N., et al. Fighting Cancer with Mathematics and Viruses. Viruses. 9 (9), (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143Oncolytic virotherapyparamyxovirusbispecific T engager

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved