גידול של טטרה מקסיקנית Astyanax mexicanus עבור ניתוח של Post-larval פנוטיפים ואת כולה-הר אימונוהיסטוכימיה

Summary

ב פרוטוקול זה, אנחנו מדגימים כיצד להתרבות Astyanax mexicanus מבוגרים, להעלות את הזחלים, לבצע כל-הר אימונוהיסטוכימיה על פוסט-זחל דגים כדי להשוות על הפנוטיפים של השטח, מערת morphotypes.

Abstract

נהר ואוכלוסיות הותאם המערה של Astyanax mexicanus מראים הבדלים מורפולוגיה, פיזיולוגיה והתנהגות. המחקר מתמקד בהשוואת צורות למבוגרים גילה בסיס גנטי של חלק משינויים אלה. פחות ידוע על איך האוכלוסיות שונות בשלבי פוסט-זחל (עם תחילת האכלה). מחקרים כאלה עשויים לספק תובנה איך cavefish לשרוד לבגרות בסביבתם הטבעית. שיטות להשוואת התפתחות הזחל שלאחר במעבדה דורשים מתוקננת מדגה האכלה משטרים. כאן נתאר איך לגדל דגים בדיאטה של rotifers עשירות במים ללא צואה למשך עד שבועיים פוסט הפריה. נדגים כיצד לאסוף את הדגים פוסט-זחל ממערכת זו משתלה ולבצע כל-הר immunostaining. Immunostaining הוא חלופה אטרקטיבית transgene ניתוח ביטוי עבור חוקרים פיתוח ותפקוד גן ב- mexicanus א. השיטה משתלה יכול גם לשמש פרוטוקול תקני עבור הקמת תואם צפיפות אוכלוסיות לצמיחה לתוך מבוגרים.

Introduction

טטרה מקסיקנית, Astyanax mexicanus, הוא בזן אחד של דגים אשר קיים נהר-דיור אוכלוסיות (משטח דגים), מספר אוכלוסיות שוכני המערה (cavefish) על המערות שהם שוכנים שם (קרי, Tinaja, מולינו, Pachón). מספר גדל והולך של חוקרים משתמש mexicanus א לחקור הבסיסים גנטי וההתפתחותי של התנהגות^1,2,3,4, מטבולית^{5,6 7, ,8}ואבולוציה מורפולוגית^9,10,11. המשאבים הזמינים עבור מחקרים של mexicanus א כוללים הגנום ברצף, מוערת¹²; transcriptome¹³; התפתחותית הזמני טבלה¹⁴; שיטות כמקום לרביית^15,16,17, יצירה transgenics¹⁸, ועריכה של הגנים¹⁹. הפצתו של כלים נוספים ופרוטוקולים סטנדרטיים מעודכן. נאיץ את הצמיחה של קהילת המחקר cavefish (ראה זה אוסף של שיטות²⁰).

המטרה שלנו היא להוסיף הרפרטואר הקיים של כלים על-ידי מתן שיטה חזקה להערכת ג'ין פעילות בחיי עיר ב- פוסט-זחל mexicanus א, בצורה דומה בין מעבדות. ישנם שני אתגרים להשגת מטרה זו. ראשית, יש צורך משטרים מתוקנן עבור הבקיעה ומשפיעים לגדל את הדג בין מעבדות, כמו הבדלים בפרמטרים כגון האכלה וצפיפות גדילה, התבגרות, ובכך להשפיע על פעילות הגנים. שנית, יש צורך שיטה סטנדרטית עדיין יכולת הסתגלות עבור בחינת דפוסי פעילות הגן הדג פוסט-זחל. אנחנו בבעיות אלה כאן, קביעת תקן לשיטות גידול דגים כדי שלאחר דרגות זחל, הצגת פרוטוקול כולה-הר חזקים אימונוהיסטוכימיה (IHC) להערכת ביטוי גנים ב- mexicanus א.

תחילה נדגים כיצד מתרבים הדגים דרך טבעית ההשרצה, לזהות את הביצים. הבא לתאר הוא כיצד בוקעות הביצים (הזחלים) ומעבירים אותם אל חדר הילדים מכולות, היכן הן נשמרות על צפיפות של 20 דגים לכל מיכל למשך שבועיים ללא צואה או שינוי המים. ב- 5-ימים שלאחר ההפריה, הדג פיתחו כדי שלאחר שדרגות (יש יותר היצע החלמון), מקבלים אצות-fed Brachionus plicatilis (rotifers) כמקור מזון עשירות שאינם דורשים חידוש המלאי היומי. שיטה זו מספקת צמיחה עקבית פרמטרים עבור פיתוח זחל פוסט-זחל.

כדי להעריך תפקוד הגן, נדגים כיצד להסיר את הדגים משתלה מכולות ולבצע IHC כולה-הר. השיטה IHC המובאת מותאמת מן הפרוטוקולים פותח לשימוש עם רזבורה rerio²¹ , והוא יעיל לבחינת אנטיגנים ברקמות כל mexicanus א שנבדקו, לרבות המוח, המעיים, הלבלב. IHC היא חלופה מהירה יותר לייצר חיות הטרנסגניים בחינת התבטאות גנים ולוקליזציה חלבון. פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור מחקרים שמטרתם השוואת על הפנוטיפים של דגים משטח cavefish בשלבים שלאחר זחל וגדל mexicanus א .

Protocol

ההליכים המתוארים בכל פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בבית הספר לרפואה בהרווארד.

1. רבייה

הערה: קיימות מספר שיטות שפורסמו כמקום לרביית^15,16,17,20 יכול לשמש גם בשלב זה. לפני הרבייה, דגים למבוגרים נשמרים ב- 10:14 בהירה: כהה מחזור ב 23 ° C והאכילה גלולה דיאטה (ראה טבלה של חומרים) יומי פעם. ניתן לגדל דגים במערכת recirculating עם סינון מכני, עיקור UV. רבייה יכול להתבצע גם במיכלים (ללא צואה) סטטי, אבל דגים לא אמורים להישאר בטנק סטטי במשך יותר מ 3 ימים, כמו איכות המים במהירות מבזה.

1. למלא מיכל גל 5 במים דגים-מוכנות (dechlorinated מים התרגלו: pH = 7.1 + /-2, מוליכות = 900 + /-150 Μs, טמפרטורה = 23 ° C).
2. במקום פלסטיק רשת שינוי (ראה חומרים) בחלק התחתון של הטנק. אם לגידול במיכלים סטטי, מוספית דוד לצד של הטנק. אם גידול במערכת recirculating, מקום דוד הניקוז במערכת.
   הערה: רשת פלסטיק מונע מבוגרים לצרוך ביצים.
3. מקום אחד נקבה, זכר שני mexicanus א דגים של יותר מ בן שנה לתוך הטנק. לאפשר את הדגים להסתגלות למשך 30 דקות.
4. הגדר את הטמפרטורה של החימום 24 ° C (או 1 מעלות חם יותר מאשר הטמפרטורה ההתחלתי).
5. לאחר 24 שעות, מעלה את הטמפרטורה על ידי 1 ° C.
6. לאחר 24 שעות, מעלה את הטמפרטורה על ידי 1 ° C. בדוק את הטנקים מדי יום עבור הביצים על ידי זוהר פנס לתוך החלק התחתון של הטנק. מסתיר את הדגים ממזון בתקופה זו 3 ימים.
7. אם ההשרצה יש לא נגרמו לאחר 3 ימים, לכבות את התנור ומאפשרים למים לחזור לטמפרטורת החדר (RT) לפני העברת הדגים מיכל המקורי שלהם.

2. הבקיעה מופרית ביצים

1. ברגע ביצים מזוהים בתוך מיכל רבייה, להסיר את המבוגרים ואת רשת פלסטיק, ולהפחית את המים עד לעומק של 10 ס מ באמצעות כוס כימית או גביע.
   הערה: כדי להעריך זמן ההשרצה, השתמש פיפטה של העברת למקם כמה ביצים לתוך צלחת פטרי, להציג אותם עם stereomicroscope כדי לקבוע את שלב¹⁴ ולהעריך את הזמן של הפריה.
2. להזיז את הטנק על משטח עבודה נוח, להסיר את כל הביצים אטום או צואה, להשאיר רק את הביצים שקופה, פורייה במיכל.
   הערה: ניתן לרשום את מספר הביצים פורייה בשלב זה.
3. מילוי מיכל מוכן-דגים מים (ראה שלב 1.1) ולהוסיף 6-7 טיפות של מתילן כחול למיכל כמו המים ממלאים.
   הערה: הריכוז הסופי של מתילן כחול הוא כ 1.5 ppm.
4. להוסיף חימום ו bubbler אקווריום (מחובר משאבת אוויר, עם הרגולטור) למיכל.
5. הגדר את החימום 24 ° C ולהתאים את הרגולטור זרימת אוויר כדי לייצר זרם עדין של בועות.
6. במקום כיסוי על הטנק כדי לסייע בשמירה על טמפרטורת המים.
   הערה: הביצים כדאי להתחיל הבקיעה בתוך 24 שעות מהזמן ההשרצה.

3. העברה של הזחלים המקווקו כדי משתלה מכולות

1. הוסף 20 גרם מלח (ראה חומרים) 8 L של דגים-מוכנות מים (ראה שלב 1.1) ומערבבים עד התפרקה. מילוי לכל מכולה משתלה 1.5 ליטר (ראה חומרים) עם 1 ליטר של המים מוכנים.
2. השתמש פיפטה של העברה כדי להזיז הזחלים המקווקו לתוך מיכלים משתלה מוכן-צפיפות של 20 דגים לכל מיכל.
   הערה: מפנס קדמי יכול להיות שימושי לאתר ולהעביר את הזחלים המקווקו.
3. לאחר כל הזחלים המקווקו גלוי הוסרו, להתסיס את המים במיכל זע, ו/או לנשוף סילוני מים לתוך בקצוות ובפינות של מיכל פיפטה.
   הערה: פעולה זו תסייע לחשוף את הזחלים הוחמצו על המעבר הראשון.
4. תשליך הזחלים שאינו בשימוש בשלב זה באמצעות ההנחיות של המשרד של מעבדה רווחה (OLAW). להוסיף טנק כדי להשיג ריכוז סופי של 6.15% נתרן תת-כלורי. חכה לפחות 5 דקות לפני לשפוך לכיור.
5. תווית לכל מכולה משתלה עם התאריך והשעה של הפריה. הצג את חדר הילדים מכולות מדי יום ולהמשיך להסיר כל הזחלים מת.

4. הכנת מזון לדגים מבוסס-Rotifer

1. לקבלת מידע על קבלת rotifers, ראה טבלה של חומרים . לפי התקנון המופנה כדי להגדיר, לשמור על הקציר rotifers²².
2. הכנת דגים מזון על ידי הוספת 3 מ"ל של אצות תערובת (ראה טבלה של חומרים) עד 1 ליטר של rotifers שנקטפו. תערובת זו תתווסף ישירות אל המכולות משתלה בתור אספקת מזון.

5. האכלה של דגים פוסט-זחל

1. כאשר הדג 5 ימים פוסט הפריה (dpf), להוסיף 3 מ ל מזון דגים (להכין בשלב 4.2) לכל מכולה משתלה. -צפיפות אופטימלית, rotifers צריך להיות גלוי בקבוצות צפופות בפינות של המכולות משתלה, פחות נראית לעין במרכז של הגורם המכיל. מוסיפים את תערובת rotifer נוספים עד הגיעה הצפיפות המתאים.
2. בדוק את המכולות מדי יום לנוכחות של rotifers, להוסיף עוד אם הריכוז מקבל דלה. המשך להסיר כל הזחלים מת.
3. כאשר הדגים מגיעים 14 dpf, להעביר אותם למיכל מתאים עם מערכת recirculating-צפיפות של 5 דגים/לליטר מים.
   הערה: ניתן לרשום מספר ששרדו דגים שלאחר הזחל בשלב זה.

6. כולה-הר אימונוהיסטוכימיה של דגים פוסט-זחל

1. הסר דגים פוסט-זחל של השלב הרצוי ממזון במשך 24 שעות ביממה על ידי מזיגת המכולה משתלה המכיל את הדגים דרך ניילון mesh מסננת והצבת את מסננת לתוך מיכל עם מים נקיים דגים-מוכנות (ראה שלב 1.1).
   הערה: זה חיוני כדי להסיר את כל המזון. כמויות אוכל בבטן אפילו קטנות אוטומטי-פלורסנט, ישפיע הדבר על הדמיה.
2. לאסוף, המתת חסד את הדגים.
   הערה: פרוטוקול המתת חסד צריך ההנחיות OLAW, יאושרו על-ידי שלך אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש. אנו ציינו כי tricaine לבד לא המתת חסד פוסט-זחל דגים, הדגים מתחילים לנוע בעת העברת מ tricaine כדי מקבע אם הדג לא נשמרים גם על קרח.
   1. להכין tricaine פתרון בתוך על-ידי הוספת 0.4 גר' tricaine-S 0.8 גר' סודה לשתייה 1 ליטר של מים יונים, ומניחים אותו על קרח.
   2. שופכים את המים המכיל את הדגים דרך מסננת רשת ניילון כדי לאסוף את הדגים. בעדינות להטביע את מסננת בפתרון Tricaine קר כקרח, תשאיר את זה על קרח למשך 10 דקות.
3. לתקן את הדגים לאללה.
   1. להשתמש על פיפטה העברה עם טיפ לחתוך כדי להעביר את הדגים צינור חרוטי.
   2. הסר את הפתרון Tricaine עם פיפטה העברת והחלף מקבע. דגירה עם נדנדה.
      הערה: מקבע וזמן קיבוע להיקבע בהתאם הנוגדן בשימוש. 10% פורמלין (4% פורמלדהיד, ראה חומרים) בן לילה ב 4 ° C הוא הפתרון נאותה נוגדנים המופיעים בטבלה של חומרים.
      התראה: פורמלין הוא רעיל, דליק. ללבוש ציוד מגן אישי (כפפות, חלוק המעבדה, ומשקפת splash) וטפל בשכונה כימי. פתרונות שמכילה פורמלין צריך להיות מסולק כפסולת מסוכנת.
   3. השתמש פיפטה של העברת בזהירות להסיר את מקבע מבלי להפריע את הדגים. להוסיף 3 מ"ל של פוספט buffered תמיסת מלח-טריטון פתרון [PBS עם 0.1% טריטון (PBST), רואה חומרים] דגירה למשך 15 דקות ב RT עם נדנדה.
   4. להסיר PBST להחליף PBST טריים, דגירה במשך 15 דקות חזור על פעולה זו פעם נוספת אחת של "כביסה".
      הערה: ניתן לאחסן דגים ב- PBS המכיל 0.02% אזיד הנתרן ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
4. לבצע כל-הר immunostaining.
   1. להכין 50 מ של חסימת פתרון [PB-0.5% טריטון X, 0.2% אלבומין שור (BSA), 1% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), אזיד הנתרן 0.02%, 5% חמור סרום].
      התראה: אזיד הנתרן, דימתיל סולפוקסיד רעילים. ציוד מגן אישי (כפפות, חלוק המעבדה, ומשקפת splash) אמור לשמש בעת הטיפול. כל פתרון צריך להיות מסולק כפסולת מסוכנת.
   2. להשתמש על פיפטה העברה כדי להעביר את הדגים בקבוקון זכוכית 4 מ עם מכסה מתברג. השתמש פיפטה של העברה כדי להסיר את PBST ולהוסיף 3 מ"ל חסימת פתרון. תקופת דגירה של 1 h RT עם נדנדה.
   3. השתמש פיפטה של העברה כדי להסיר הפתרון חסימה ולהוסיף נוגדן ראשוני מעורבבת עם חסימת פתרון. דגירה ללילה בטמפרטורת החדר עם עצבנות.
      הערה: לדוגמה, להוסיף 1:250 דילול של אנטי-ההיברו/HuD עצביים נוגדנים חד שבטיים של העכבר חלבון (ראה טבלה של חומרים עבור רשימה של נוגדנים שימשו בהצלחה בא mexicanus). ערכה של דג עם נוגדן ראשוני אין הוסיף צריך להיכלל בשלב זה. נפח של נוגדן צריך להיות מספיק כדי לכסות את הדגים ולאפשר עצבנות.
   4. לשטוף את הדג 3 פעמים עם PBST כפי שמתואר בשלב 6.3.4. להחליף את PBST עם נוגדנים משניים מעורבבת עם חסימת פתרון, דגירה ללון במלון RT עם עצבנות.
      הערה: ריכוז נוגדן האופטימלית הראשיים והמשניים, זמן הדגירה, בטמפרטורת דגירה צריך להיקבע עבור כל נוגדן. לינה במלון RT היה יעיל עבור נוגדנים המופיעים בטבלה של חומרים.
   5. לשטוף את הדג 3 פעמים עם PBST, עם כל כביסה שנמשך 15 דקות כפי שמתואר בשלב 6.3.4.
   6. להעביר את הדגים PBS לאחסון לטווח קצר לפני שתמשיך עם לנתח, הרכבה, או חלוקתה הדג.

תוצאות

טבלה 1 מציגה את ההצלחה במהלך שנה אחת של גידול דגים משטח, cavefish Tinaja Molino, Pachón במיכלים הרבייה סטטי. פני השטח ואת Pachón מולידה עם עוברי מופרית תמיד ייצרו בקעו הזחלים, בעוד Molino ו Tinaja החמיץ חלק מהזמן (2/6 ו- 2/18 ההשרצה אירועים לא לייצר הזחלים מקווקו, בהתאמה). יש וריאציה בתטולה אשר אינו מופיע כדי לייחס גיל של הדג האב. בטבלה 2 מציג את המספר הכולל של הזחלים המקווקו הנובע בחלק מהאירועים ההשרצה, ואת הגיל של הדג האב. באופן כללי, מצאנו כי דגים משטח לייצר מספר גדול יותר של הזחלים לכל הצאצאים (הממוצע ± ו-1,550 894, n = 5), ואחריו Pachón (הממוצע ± 879 680, n = 6), Tinaja (הממוצע ± 570 373, n = 11), ואת מולינו (הממוצע ± 386 276, n = 3). המספר של הזחלים המיוצר הוא בדרך כלל יותר נדרשים לכל ניסוי או לצמיחה לתוך מבוגרים. אנו בדרך כלל להגדיר 6-18 משתלה מכולות (120-360 הזחלים), המתת חסד הדגים הנותרים.

כדי למדוד את ההצלחה של פרוטוקול משתלה הקלטנו את המספר של הזחלים המקווקו ודגים זחל שלאחר ששרדו מאירועים ההשרצה מוצלחת. טבלה 3 מציג נתונים מ 1 חודש המעלה צואה טנקים, כולל המספר של הזחלים הועבר המכילים משתלה שרד 14 dpf. במהלך חודש זה, שיעור ההישרדות נע בין 41-81 אחוזים, וכתוצאה מכך 65-293 דגים לכל האוכלוסייה עבור ניסויים או צמיחה לתוך מבוגרים.

כדי לקבוע אם כולה-הר immunostaining היא מוצלחת, השווינו את זריחה של דגימות מודגרות עם נוגדן ראשוני לאלה מודגרות עם נוגדנים משניים בלבד. האות פלורסנט מוצגת רק בהדג מודגרות עם נוגדן ראשוני. השתמשנו פרוטוקול זה בהצלחה תווית נוירונים¹⁰ (איור 1) ובתאי הלבלב⁶ בשלבים עד 12.5 dpf השטח שני ואת מערת morphotypes.

איור 1: תיוג נוירון. כולה-הר immunostaining של mexicanus א. תמונה של 12.5 dpf משטח דגים () Pachón cavefish (b). תמונה של אזור אמצע הגוף [חלוקה לרמות צהוב המקווקו באיור (א) ו- (ב)] של פני השטח דגים (ג) Pachón cavefish (ד) מוכתם נוגדן פאן עצבית (Hu). (e) Confocal תמונה של אזור של הנוירונים המעית מראה במעי דג משטח (Hu) והקרנות שלהם (טובולין acetylated). עבור תמונה זו, המעי היה גזור החוצה וטיפס בינוני המכיל דאפי כתם הגרעינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

האוכלוסייה	ניסיונות	ההשרצה אירועים	מצמדים
משטח	94	23	23
מולינו	110	6	4
Pachón	167	13	13
Tinaja	242	18	16

טבלה 1: סיכום של נתונים שנה אחת של רבייה Mexicanus א במיכלים סטטי. מספר הרבייה ניסיונות, וכתוצאה מכך ההשרצה אירועים, מספר ההשרצה אירועים שהפיקה בקעו הזחלים.

האוכלוסייה	גיל האב	הזחלים מקווקו
משטח	1 שנה	989
משטח	1 שנה	1050
משטח	3 שנים	תודה
משטח	3 שנים	432
משטח	3 שנים	1768
משטח	4 שנים	2852
Pachón	1 שנה	1194
Pachón	1 שנה	1933
Pachón	1.5 שנים	371
Pachón	3 שנים	480
Pachón	4 שנים	1190
Pachón	4 שנים	110
Tinaja	9 חודשים	259
Tinaja	9 חודשים	253
Tinaja	10 חודשים	1100
Tinaja	11 חודשים	857
Tinaja	1 שנה	713
Tinaja	1 שנה	853
Tinaja	1 שנה	542
Tinaja	1.5 שנים	360
Tinaja	1.5 שנים	58
Tinaja	1.5 שנים	1100
Tinaja	4 שנים	185
מולינו	2.5 שנים	460
מולינו	2.5 שנים	619
מולינו	3 שנים	81

בטבלה 2: אומדן גיל הנשי ומספר הזחלים המקווקו מאירועים ההשרצה בודדים מתוך האוכלוסיות המצוין של א mexicanus.

האוכלוסייה	ניסיונות	ההשרצה אירועים	מצמדים	בתטולה	הזחלים הועבר משתלה כוסות	דגים פוסט-זחל-14dpf	הישרדות (%)
משטח	4	3	2	576 & 1728	360	174	48
מולינו	4	2	1	228	159	65	41
Tinaja	4	1	1	1952	175	93	53
Pachón	4	1	1	1696	360	293	81

טבלה 3: סיכום של נתוני חודש אחד של רבייה mexicanus א צואה המערכת וכן גידול הזחלים. מספר נסיונות, וכתוצאה מכך גידול ההשרצה אירועים, מצמדים שהפיקה הזחלים מקווקו, המספר הממוצע של הזחלים תטולה, הזחלים להעביר את משתלת מכולות, ודגים פוסט-זחל נוכח המכולות משתלה לאחר 14 יום.

Discussion

השוואת פעילות גנים בין משטח המערה mexicanus א דורש פרמטרים סביבתיים מבוקרת בקפידה שיטות שבהן ניתן לשכפל אותו על פני מעבדות. פרוטוקול שלנו לגידול mexicanus א מספק תוכן תזונתי עקבי במהלך התפתחות הזחל פוסט. בעקבות המשטר האכלה, ג'ין פונקציה ניתן בביטחון להשוות בין אוכלוסיות באמצעות פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה חזקים שאנו מציגים. כאן נדון את המשמעות של שיטה זו, כמו גם המגבלות, יישומים עתידיים.

כדי להשיג גידול מתאימים-צפיפות, מצאנו כי דגים פוסט-זחל יכול להיות הרים ללא צואה מים במשך שבועיים במיכלים 1.5 ליטר בדיאטה של rotifers. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לגדל דגים על מערכת recirculating; עם זאת, rotifers להתווסף מדי יום כדי לפצות על אלה לאיבוד דרך זרימה החוצה טנק. הדברים Artemia בימיו משמשים כמקור מזון, חקלאות ימית, אבל מצאנו כי שימוש rotifers יש יתרונות רבים, לרבות: צמצום מחיר, biosecurity משופרת, תזונה עקבית, איכות מים טובה יותר (ראה להלן).

ראשית, העלות שבועי במתכלים הוא 4 דולר עבור rotifers, בהשוואה ל- 14 דולר עבור Artemia. לגבי biosecurity, rotifers מגודלים במעבדה בתנאים מבוקרים, בעוד Artemia נאספים מן הטבע ובכפוף וריאציה טבעי מיקרוביאלי או פתוגן תוכן²³. בנוסף, ההרכב התזונתי של הדברים Artemia הם ונחוש ולכן לא עקבי לסביבה. הדברים שפורחים את מאגרי האנרגיה שלהם לאחר הבקיעה; הם במהירות רופף ערך תזונתי כפי שהם מפתחים צריך בצורה אופטימלית להאכיל את הדגים בתוך מספר שעות. Artemia להתחיל להאכיל בבית 12 לאחר הבקיעה, המייצגים בפעם הראשונה יכול להיות תזונתית העשירו; עם זאת, בשלב זה הם הפכו להיות גדול מדי עבור 5 דגים dpf לצרוך. לשם השוואה, rotifers ניזונים באופן רציף microalgae ימית וכתוצאה מכך גבוהה מזין תוכן ללא קשר כאשר נקצרים את rotifers. Rotifers קטנים בהרבה Artmeia הדברים (160 לעומת 400 מיקרון), איתורם של הדג כדי ללכוד ולבלוע. Cavefish ודגים משטח פוסט-זחל לצרוך rotifers בכמויות דומות רומז אין הבדל העדפה או היכולת ללכוד את rotifers¹⁰.

לבסוף, Artemia הדברים מתחילים למות במים מתוקים מספר שעות אחרי שהתוודעתי. הדברים השוקולדים תרקב, הפחתת במהירות את איכות המים, אם הם לא יוסרו באופן ידני. הסרת מת Artemia היא גוזלת זמן ומסוכן עבור פוסט-זחל דגים גדולים לא הרבה יותר מאשר Artemia, ייתכן בטעות הוסר או נפגע. Rotifers ניתן לחיות ללא הגבלת זמן המכולות משתלה, לספק מזון דגים בכל עת מבלי להשפיע באופן משמעותי על איכות המים.

בזמן שימוש rotifers כמו מקור מזון יש יתרונות ניכר, כדי לשמור על האצות rotifer מניות, יש להוסיף מערכת התרבות מדי יום. אפשר להשיג עם מזין אוטומטי זה dispenses אצות נוזלי לתוך המיכל תרבות rotifer (ראה טבלה של חומרים). Rotifers חייב גם להיות שנקטפו זה כל 24-48 שעות כדי לשמור על הבריאות של התרבות. חוקרים מתרבים דגים מאוד לעיתים רחוקות (פעם בשנה, למשל), לא עוסקים ביצוע השוואות בין האוכלוסיות בשלבים שלאחר זחל עשויים להעדיף Artemia כמקור מזון, שכן יכול להיות בקע העוברים encysted בכל עת.

מומלץ מעקב אחר מספר הזחלים בקעו וכבר ששרד לעקוב אחר ההצלחה של הבקיעה וצמיחה. אם רוב של העוברים או הזחלים אמות, זה יכול להיות בגלל זיהום חיידקי או פטרייתי. מומלץ לפקח על איכות המים של המים דגים-מוכנות ולחטא את כל ציוד עם 70% אתנול. משתלת מכולות, אליו יכול לשמש מחדש לאחר הם ניקו, עיקור. כדי למזער את הסיכון של המחלה, חשוב גם כדי להסיר את כל דג מת המכולות משתלה לא להוסיף rotifers לפני 5 dpf, כאשר הדג מתחיל לאכול.

Mexicanus א הם בגרו בת כ אחד בשנה. זוהי מגבלה ליצירת הטרנסגניים mexicanus א לעומת רזבורה rerio (דג זברה) מסוגלים להתרבות בגיל 10-12 שבועות²⁴. אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא שיטה חלופית לחקור ביטוי גנים ולוקליזציה חלבון. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות הותאם בכל שלב, המשמשים לזיהוי אנטיגנים ברקמות בכל עניין. חשוב לציין, עם זאת, כי רקמות מסוימות עשוי להיות יותר קשה לדמיין בדגים השטח בשל פיגמנטציה (מכשול לא קיים ב- unpigmented cavefish), העלולים להשפיע על הפרשנות של מחקרים השוואתיים. לטיפול בבעיה פוטנציאליים, דגים משטח פיגמנט יכול להיות מולבן לאחר קיבוע באמצעות מי חמצן 3%.

IHC מחייב קיבעון רקמות מוצלחת, חסימת ו נוגדן חדירה. שיטות עבור כל אחד משתנים בהתאם רקמת החלבון עניין. הפעם מקבע, קיבוע חייב לשמר ארכיטקטורה התא תוך שמירה על epitope אנטיגן. עבור פרוטוקול זה, אנו משתמשים מקבע cross-linking (paraformaldehyde), להשמיט מקבע denaturing (כגון מתנול או אצטון). מצאנו כי דגירה של אצטון פחתה נוגדן סיגנל סמנים עצביים והלבלב. השלב חסימה הוא חיוני כדי למנוע נוגדנים איגוד-יעד חלבונים ברקמות. שיטה זו משתמשת בשילוב של סרום רגילה (5%) BSA (0.2%) בהפתרון חסימה. הפתרון חסימה מכיל נוגדנים וחלבונים לאגד לאתרים תגובתי על חלבונים ברקמות, הולכת ופוחתת שאינם ספציפיים קשירה של נוגדנים ראשיים ומשניים.

כדי להשיג חדירה נוגדן, חייב להיות permeabilized הרקמה. זו יכולה להיות מושגת באמצעות חומרי ניקוי או ממיסים denaturing אך חייב להיות מותאם כדי לשמר את epitope אנטיגן. פרוטוקול שלנו משתמשת בשילוב של טריטון, דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). טריטון דימתיל סולפוקסיד הינם כלולים במהלך השלבים הדגירה חסימה ו נוגדן בריכוזים של 0.5%, 1%, בהתאמה. באמצעות ריכוז הזה, הבחנו מכתימה המוח, הלבלב, המעי ו שריר, רומז שזה יעיל סביר לחדירה של כל הרקמות. דגים בגודל עשויים להשפיע גם חדירה. פרוטוקול זה לא נבדק על דגים מהערך בת 14 ימים (כ 7 מ מ אורך). כדי לפתור בעיות מכתים, מומלץ לשנות את השלבים חדירה קיבעון, חסימת ו נוגדן. חשוב גם לבחון את שימור רצף immunogen עם החלבון mexicanus א עניין באמצעות הגנום זמין²⁵.

Mexicanus א הוא מודל מצוין לחקור האבולוציה כמו אוכלוסיות של בני אותו מין שהתפתח בסביבות שונות באופן דרמטי ניתן להשוות ישירות במעבדה. פרוטוקולי גידול רגיל, הן בתוך והן בין מעבדות, חיוניים להבנת ההבדלים הביולוגיים בין משטח דגים cavefish. המאמר שלנו מספק שיטה לבחון פיתוח ופעילות גנים בדגים פוסט-זחל נחשפים צמיחה עקבית פרמטרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
methylene blue	Kordon	B016CBHZUS	antifungal
heater	Finnex	4711457836017	100W Digital Control Heater
airstone	Lee's Aquarium & Pet Products	10838125202	disposable air stone
salt	Instant Ocean	51378014021	Sea Salt
nursery container	IPC	21545-002	40 oz or 1.5 L clear containers
transfer pipette	VWR	414004-002	plastic bulb pipettes
compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers	Reed Mariculture	na	fish food
RGcomplete	APBreed	817656016572	32 oz bottle of rotifer food
Programmable Auto Dosing Pump DP-4	Jebao	DP-4	automatic feeder for rotifers
Tricane-S	Western Chemical	MS 222	fish anesthetic
sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G	for tricane solution
nylon mesh strainer	HIC (Harold Import Co.)	735343476235	3-inch diameter
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	fixative
10X PBS	Invitrogen	AM9625	buffer, dilute to 1X using distilled water
Triton-x 100	Sigma-Aldrich	T8787-250ML	detergent
sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002-25G	anti-bacterial
bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647-100G	blocking reagent
glass vial with screw-top cap 4mL	Wheaton	224742	staining vial
plastic mesh screen for breeding tank	Pentair	N1670	Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net.
vinyl-coated disk magnets	Kjmagnets	D84PC-AST
New Life Spectrum Thera-A pellet fish food	New Life International	na	Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website
Antibodies
insulin antibody from guinea pig	Dako	A0564	1:200
glucagon antibody from sheep	Abcam	ab36215	1:200
acetylated tubulin antibody from mouse	Sigma	T6793	1:500
HuD/HuC antibody from mouse	Life Technologies	A-21271	1:500
nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit	Abcam	ab106417	5μg/mL
choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit	Abcam	ab178850	1:2000
seratonin (5HT) from rabbit	Immunostar	20080	1:500