Meksika Tetra Astyanax mexicanus analiz Post-larval fenotipleri ve bütün Dağı immünhistokimya için yetiştirme

Özet

Bu iletişim kuralı, biz Astyanax mexicanus yetişkin doğurmak, larvalar yükseltmek nasıl gösterir ve bütün Dağı immünhistokimya yüzey fenotipleri karşılaştırmak ve morphotypes mağara sonrası larva balık gerçekleştirin.

Özet

Nehir ve mağara adapte nüfus Astyanax mexicanus morfoloji, fizyoloji ve davranış farklılıkları gösterir. Yetişkin formları karşılaştırılmasına odaklı araştırma bazı, bu farklılıkların genetik temeli ortaya koymuştur. Daha az nasıl nüfusları (at besleme başlangıcı) sonrası larva aşamalarında farklı bilinir. Bu tür çalışmalar nasıl yoluyla yetişkinliğe kendi doğal ortamlarında cavefish hayatta içine bilgiler sağlayabilir. Yöntem sonrası larva geliştirme Laboratuvarı karşılaştırmak için standart su ürünleri ve beslenme rejimleri gerektirir. Burada nasıl bir diyet besin açısından zengin Wrotek suda sirkülasyon sigara için iki hafta sonrası döllenme kadar balık yetiştirmek için açıklamak. Biz bu kreş sistemden sonrası larva balık toplamak ve bütün-mount immunostaining gerçekleştirmek nasıl göstermek. Immunostaining araştırma geliştirme ve A. mexicanusişlevinde gen için transgene ifade analizi için cazip bir alternatif var. Kreş yöntem kurulması yoğunluğu eşlemeli nüfus büyüme içine yetişkinler için bir standart iletişim kuralı olarak da kullanılabilir.

Giriş

Meksika tetra Astyanax mexicanus, bir tek tür-in balık nehir yaşayan nüfus (yüzey balık) var ve onlar yaşamaktadır mağara için adında bir dizi mağaralarda yaşayan nüfus (cavefish) (Yani, Tinaja, Molino, Pachón) olduğunu. Araştırmacılar, giderek artan sayıda A. mexicanus davranış^1,2,3,4, metabolik^{5,6 genetik ve gelişimsel üsleri araştırmak için kullanma ,7,8}ve morfolojik evrim^9,10,11. A. mexicanus çalışmaları için kullanılabilir kaynaklar sıralı ve ek açıklama eklenen genom¹²içerir; transcriptome¹³; gelişimsel hazırlama tablo¹⁴; ve yöntemleri^15,16,17ıslahı için transgenics¹⁸oluşturma ve düzenleme genler¹⁹. Dağıtımı ek araçlar ve Güncellenme Zamanı standart protokolleri cavefish araştırma topluluk gelişimini hızlandırmak (Bu yöntemler koleksiyonu²⁰bakın).

Amacımız gen aktivitesi in situ sonrası larva A. mexicanus, laboratuvarlar arasında karşılaştırılabilir bir şekilde değerlendirmek için sağlam bir yöntemi sağlayarak araçları mevcut repertuar eklemektir. Bu hedefe ulaşmak için iki sorun vardır. İlk olarak, tarama için standart rejimleri için bir ihtiyaç ve balık laboratuvarları arasında yükselten farklılıkları besleme ve yoğunluğu gibi parametreleri olarak büyüme ve olgunlaşma, böylece gen etkinliğini etkileyen etkiler. İkinci olarak, gen etkinliği sonrası larva balık incelenmesi için bir standart henüz adapte yöntemi için bir ihtiyaç vardır. Biz bu konuları burada, sonrası larva aşamaları için Balık yetiştirme ve A. mexicanusgen ifadesinde değerlendirmek için sağlam bütün Dağı immünhistokimya (IHC) protokolü tanıtımı için standart yöntemler kurulması ele.

İlk doğal yumurtlama ile balık doğurmak ve döllenmiş yumurta tanımlamak nasıl gösterilmektedir. Açıklanan ileri döllenmiş yumurtadan (larvaları) ve nereye onlar konteyner başına 20 balık yoğunluğunu, iki hafta boyunca recirculating veya su değiştirmeden korunur kreş kaplarına aktarmak nasıl olduğunu. 5-gün sonrası döllenme, balık (artık bir yumurta sarısı kaynağı olan) sonrası larva aşamaları için geliştirdik ve yosun beslemeli Brachionus plicatilis (Wrotek) günlük stok yenileme gerektirmeyen bir besin açısından zengin besin kaynağı olarak sağlanır. Bu yöntem, larva ve sonrası larva geliştirmesi için tutarlı büyüme parametrelerini sağlar.

Gen işlevini değerlendirmek için kreş kapsayıcılar balık çıkartın ve bütün Dağı IHC gerçekleştirmek nasıl gösterir. IHC yöntemi sunulan Danio rerio²¹ ile kullanılmak üzere geliştirilen protokollerinden gelen uyarlanmış ve dokularda beyin, bağırsak ve pankreas gibi test, tüm A. mexicanus antijenleri incelenmesi için etkilidir. IHC transjenik hayvanlar gen ekspresyonu ve protein yerelleştirme için üreten daha hızlı bir seçenektir. Bu protokol A. mexicanus büyüyen ve yüzey balık ve cavefish fenotipleri sonrası larva aşamalarında karşılaştırma amaçlı çalışmalar için faydalı olacaktır.

Protokol

Bu iletişim kuralı'nda açıklanan yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Harvard Tıp Fakültesi tarafından onaylanmıştır.

1. üreme

Not: Bu adımda da kullanılabilir^15,16,17,20 ıslahı için birkaç yayımlanan yöntem vardır. Önce yetiştirme, bir 10: açık: koyu döngüsü 23 ° C'de ve Pelet diyet beslenen 14 tarihinde yetişkin balık korunur (bkz: malzemeler tablo) günde bir kez. Balık bir dolaşım sistemi mekanik filtrasyon ve UV sterilizasyon ile yetiştirilen. Islah (sirkülasyon-) statik tanklarda da yapılabilir ama hızlı bir şekilde su kalitesini düşürür gibi balık statik bir depoda 3 günden fazla bırakılmamalıdır.

1. 5 gal tank balık-hazır su ile doldurun (için ayarlanabilir su dechlorinated: pH +/-2, iletkenlik 7.1 = 900 + /-150 µS, sıcaklık = = 23 ° C).
2. Koyun Plastik tankın dibine mesh ( malzemelerigörmek). Statik tanklarda ıslahı, tank tarafına bir su ısıtıcı yapıştırmayın. Dolaşım sisteminde ıslahı, bir su ısıtıcı sistem karter koyun.
   Not: Plastik kafes yetişkin yumurta kullanmasını engeller.
3. Daha büyük daha 1 yaşında Place bir kadın ve iki erkek A. mexicanus tankın balık. Balık için 30 dk alışmana izin.
4. Isıtıcının sıcaklığı 24 ° C (veya 1 ° C başlangıç sıcaklık sıcak) için ayarlayın.
5. 24 saat sonra tarafından 1 ° c sıcaklık artışı
6. 24 saat sonra tarafından 1 ° c sıcaklık artışı Her gün yumurta için tanklar tank altına bir el feneri parlayan tarafından kontrol edin. Gıdalardan balık bu 3 günlük dönemde kesintisi.
7. Yumurtlama 3 gün sonra uyarılan değil, ısıtıcıyı ve onların özgün tank balık taşımadan önce oda sıcaklığına (RT) için su izin.

2. damızlık yumurta döllenmiş

1. Yumurta yetiştirme tankında tanımlandıktan sonra çıkarmak belgili tanımlık yetişkin ve plastik kafes ve su kabı veya fincan kullanarak 10 cm derinliğe kadar azaltır.
   Not: Yumurtlama zamanı tahmin etmek için transfer pipet birkaç yumurta bir Petri kabına yerleştirin ve onları sahne¹⁴ belirlemek ve gübreleme zamanı tahmin etmek için bir stereomicroscope görüntülemek için kullanın.
2. Tank uygun çalışma yüzeyinin taşımak ve tüm opak yumurta ve dışkı, sadece yarı şeffaf, verimli yumurta bırakmak içinde belgili tanımlık tank kaldırın.
   Not: Şu anda verimli yumurta sayısı kaydedilir.
3. Dolgu Balık-hazır tankla (bkz. Adım 1.1) su ve su doldurur gibi 6-7 damla metilen mavisi tank için ekleyin.
   Not: Son metilen mavisi yaklaşık 1,5 ppm bölgedir.
4. Bir ısıtıcı ve (bir hava pompa bir regülatörü ile bağlı) Akvaryum bubbler tank için ekleyin.
5. 24 ° C-ısıtıcı ayarla ve kabarcıklar nazik akışı üretmek için hazırlayıcı regülatör ayarlayın.
6. Bir kapak tankındaki su sıcaklığı korumaya yardımcı olmak için yerleştirin.
   Not: Yumurta hatching yumurtlama zaman 24 saat içinde başlaması gerekir.

3. çocuk odası kapsayıcılara taranmış larva transferini

1. 20 g tuz ekleyin ( malzemelerigörmek) (bkz. Adım 1.1) balık-hazır 8 L su ve eriyene kadar karıştırın. Her 1, 5 L kreş kapsayıcıyı doldurmak ( malzemelerigörmek) hazırlanan su 1 litre ile.
2. Bir aktarım pipet hazırlanan kreş konteyner, konteyner başına 20 balık yoğunluğunu içine taranmış larva taşımak için kullanın.
   Not: Bir far bulup taranmış larva transferi yararlı olabilir.
3. Tüm görünür taranmış larvalar kaldırdıktan sonra su tankında karıştırma ve/veya kenarları ve köşeleri pipet ile tankın içine su jetleri üfleme tarafından tahrik.
   Not: Bu ilk geçişte cevapsız larva ortaya çıkarmak yardımcı olacaktır.
4. Kullanılmayan larva, Office, laboratuvar refah (OLAW) yönergeleri uygulayarak bu aşamada atın. Sodyum hipoklorit %6.15 son bir konsantrasyon ulaşmak için tank ekleyin. Lavaboya dökülen önce en az 5 dakika bekleyin.
5. Her çocuk odası Konteyner tarih ve saat gübreleme ile etiketleyin. Her gün kreş kapsayıcıları görüntülemek ve herhangi bir ölü larva kaldırmak devam edin.

4. Rotifer tabanlı balık yemi hazırlanması

1. Malzemeler tablo Wrotek edinme hakkında bilgi için bkz:. Ayarlamak, korumak ve Wrotek²²hasat için başvurulan Protokolü izleyin.
2. Balık hazırlamak 3 mL yosun karışımı ekleyerek gıda ( Tablo malzemelerigörmek) hasat Wrotek 1 litre için. Bu karışımı doğrudan kreş kaplarına bir gıda kaynağı olarak eklenecektir.

5. sonrası larva balık besleme

1. Balık 5 gün fertilizasyon (dpf) sonrası olduğunuzda, balık yemi (4.2 adımda hazırlanan) 3 mL her kreş kapsayıcıya Ekle. En uygun yoğunluk Wrotek konteyner merkezinde kreş kapları köşelerinde yoğun gruplar görünür ve daha az belirgin olması gerekir. Uygun yoğunluk ulaşana kadar ek rotifer karışımı ekleyin.
2. Konteyner günlük Wrotek varlığı için kontrol ve konsantrasyonu tükenmiş daha ekleyin. Herhangi bir ölü larva kaldırmak devam edin.
3. Balık 14 dpf ulaştığınızda, 5 balık/L su yoğunluğu, dolaşım sistemi ile uygun bir tank taşımak.
   Not: Şu anda sonrası larva balık yaşayan sayısı kaydedilir.

6. bütün Dağı immünhistokimya sonrası larva balık

1. Kaldır sonrası larva balık gıda içeren bir naylon ile balık kreş konteyner dökme tarafından 24 h için istenen aşamasının mesh süzgeç ve süzgeç temiz balık hazır su ile bir kaba yerleştirerek (bkz. Adım 1.1).
   Not: Tüm gıda kaldırmak gereklidir. Gıda gut bile küçük tutarları otomatik floresan ve görüntüleme etkileyecektir.
2. Toplamak ve balık ötenazi.
   Not: Ötenazi Protokolü OLAW yönergeleri takip etmeli ve sizin kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanması. Tricaine yalnız sonrası larva balık ötenazi değil ve balık balık da buzda muhafaza değil eğer sabitleştirici için tricaine transfer edildiğinde hareket başlar gözlemlemekteyiz.
   1. Tricaine-s 0.4 g ve 0.8 g sodyum bikarbonat 1 litre deiyonize su ekleyerek tricaine çözüm bir ölçek hazırlamak ve buz üzerinde yerleştirin.
   2. Balık balık toplamak için naylon mesh süzgeç aracılığıyla içeren su dökün. Yavaşça buz gibi Tricaine çözüm süzgeç daldırın ve 10 min için buz üzerinde bırakın.
3. Euthanized balık düzeltmek.
   1. Bir aktarım pipet ile kesilmiş bir ipucu balık için konik bir tüp aktarmak için kullanın.
   2. Tricaine çözüm transfer pipet ile kaldırın ve sabitleştirici ile değiştirin. Sallanan ile kuluçkaya.
      Not: Kullanılan antikor dayalı sabitleştirici ve fiksasyon zaman belirlenmelidir. gecede 4 ° C'de % 10 formalin çözüm (%4 formaldehit, bkz: belgeleri) Malzemeler tablolistelenen antikorlar için yeterlidir.
      Uyarı: Toksik ve yanıcı Formalin var. Kişisel koruyucu donanımları (eldiven, önlük ve sıçrama gözlük) ve kimyasal bir mahallede kolu. Formalin içeren çözümler tehlikeli atık atılmalıdır.
   3. Bir aktarım pipet dikkatle sabitleştirici balık bozmadan kaldırmak için kullanın. 3 mL fosfat tamponlu tuz-triton çözüm eklemek [PBS %0,1 Triton (PBST), bkz: malzemeler] ve sallanan ile 15 dakika RT, kuluçkaya.
   4. PBST kaldırmak ve taze PBST ile değiştirin ve 15 dk. yinelemek için bu "ek bir kez yıkama" kuluçkaya.
      Not: Balık birkaç hafta için 4 ° C'de % 0.02 sodyum azid içeren PBS depolanabilir.
4. Bütün Dağı immunostaining gerçekleştirin.
   1. Çözüm [PB-0.5% Triton X, %0,2 sığır serum albumin (BSA), % 1 dimetil sülfoksit (DMSO), %0.02 sodyum azid, % 5 eşek serum] engelleme 50 mL hazırlayın.
      Dikkat: Sodyum azid ve DMSO zehirlidir. Kişisel koruyucu donanım (eldiven, önlük ve sıçrama gözlük) işlerken kullanılır. Herhangi bir çözüm tehlikeli atık atılmalıdır.
   2. Balık 4 mL Cam şişe vida üst kapağı ile transfer etmek için transfer pipet kullanın. Bir aktarım pipet PBST kaldırmak ve 3 mL çözüm engelleme eklemek için kullanın. RT, 1 h için sallanan ile kuluçkaya.
   3. Bir aktarım pipet engelleme çözümü kaldırmak ve birincil antikor çözüm engelleme seyreltilmiş eklemek için kullanın. Gecede ajitasyon ile Oda sıcaklığında kuluçkaya.
      Not: Örneğin, anti-HuC/HuD nöronal Protein fare monoklonal antikor 1:250 seyreltme ekleyin ( Malzemeler tablo başarıyla A. mexicanusiçinde kullanılan antikor listesi için bakınız). Balık eklendi yok birincil antikor ile bir dizi bu adımda dahil edilmelidir. Antikor hacmi balık kapak ve ajitasyon için izin vermek için yeterli olmalıdır.
   4. 3 kez ile PBST balık 6.3.4 adımda anlatıldığı gibi yıkayın. İkincil antikor çözüm engelleme seyreltilmiş PBST yerine ve gecede RT ajitasyon ile kuluçkaya.
      Not: En iyi birincil ve ikincil antikor konsantrasyonları, kuluçka süresi ve kuluçka sıcaklık her antikor için tespit edilmelidir. RT, bir gecede Malzemeler tabloiçinde listelenen antikorlar için etkili oldu.
   5. Balık 3 kez ile PBST, 6.3.4 adımda anlatıldığı gibi 15 dk süren her yıkama ile yıkayın.
   6. Anatomi ile devam etmeden önce kısa süreli depolama için PBS için balık aktarım takılarak veya balık kesit.

Sonuçlar

Tablo 1 yüzey balık ve Tinaja, Molino ve Pachón cavefish, statik üreme tanklarında ıslahı, bir yıl boyunca başarı gösterir. Yüzey ve Pachón yumurtlar her zaman üretilen döllenmiş embriyo ile yumurtadan larva, Molino ve Tinaja zaman zaman başarısız iken (2/6 ve 2/18 olaylar yumurtlama üretmek taranmış larva, sırasıyla). Varyasyon üst Balık Çağı isnat edilebilir görünmüyor debriyaj boyutu vardır. Tablo 2 taranmış larva bazı yumurtlama olaylar ve üst Balık Çağı kaynaklanan toplam sayısını gösterir. Genel olarak, yüzey balık larvaları spawn başına en yüksek sayıda üretmek bulduk (ortalama 1.550 ± 894, n = 5), ardından Pachón (ortalama 879 ± 680, n = 6), Tinaja (ortalama 570 ± 373, n = 11) ve Molino (ortalama 386 ± 276, n = 3). Larva üretilen genellikle deneme başına veya büyüme içine yetişkinler için gerekenden daha fazla sayısıdır. Biz genellikle 6-18 kreş konteynırları (120-360 larva) yukarı ayarla ve kalan balık ötenazi.

Kreş Protokolü başarısını ölçmek için taranmış larva ve başarılı yumurtlama olaylardan kalan sonrası larva balık sayısını kaydetti. Tablo 3 tank recirculating ıslahının 1 ay verileri gösterir ve larva için 14 dpf hayatta kreş kapsayıcılara transfer içerir. Bu ay içinde 41-81 yüzde 65-293 balık deneyler veya büyüme içine yetişkin nüfus başı sonuçlanan, sağkalım arasında değişiyordu.

Bütün Dağı immunostaining başarılı olup olmadığını belirlemek için bu sadece ikincil antikor ile inkübe birincil antikor ile inkübe örnekleri floresans karşılaştırıldığında. Floresan sinyal ancak birincil antikor ile inkübe balık görülür. Bu iletişim kuralı başarıyla nöronlar¹⁰ (Şekil 1) ve pankreas hücreleri⁶ kadar her iki yüzeyde 12.5 dpf aşamalarında etiket ve morphotypes mağara için kullandık.

Şekil 1: nöron etiketleme. Tüm-in immunostaining Dağı A. mexicanus. Görüntü 12.5 dpf yüzey balık (bir) ve Pachón cavefish (b). Görüntü [gösterilen taranmış sarı anahat (a) ve (b)] Orta vücut bölgesinin yüzey balık (c) ve Pachón cavefish (d) pan-nöronal antikor (Hu) ile lekeli. bir bölge yüzey balık bağırsak gösteren enterik sinir hücreleri (Hu) ve onların projeksiyonlar (acetylated tübülin) (e) Confocal görüntüsü. Bu resim için bağırsak dışarı disseke ve çekirdekleri leke DAPI içeren ortamda monte. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

nüfus	girişimleri	olaylar yumurtlama	Debriyajlar
yüzey	94	23	23
Molino	110	6	4
Pachón	167	13	13
Tinaja	242	18	16

Tablo 1: ıslahının bir yılın verilerini Özet A. mexicanus statik tanklar. Denemelerinin sayısı ıslahı, olaylar, yumurtlama kaynaklanan ve üretilen olaylar yumurtlama sayısı larvalar yumurtadan.

nüfus	üst yaş	taranmış larva
yüzey	1 yıl	989
yüzey	1 yıl	1050
yüzey	3 yıl	2214
yüzey	3 yıl	432
yüzey	3 yıl	1768
yüzey	4 yıl	2852
Pachón	1 yıl	1194
Pachón	1 yıl	1933
Pachón	1,5 yıl	371
Pachón	3 yıl	480
Pachón	4 yıl	1190
Pachón	4 yıl	110
Tinaja	9 ay	259
Tinaja	9 ay	253
Tinaja	10 ay	1100
Tinaja	11 ay	857
Tinaja	1 yıl	713
Tinaja	1 yıl	853
Tinaja	1 yıl	542
Tinaja	1,5 yıl	360
Tinaja	1,5 yıl	58
Tinaja	1,5 yıl	1100
Tinaja	4 yıl	185
Molino	2,5 yıl	460
Molino	2,5 yıl	619
Molino	3 yıl	81

Tablo 2: yaklaşık kadının yaşı ve taranmış larva sayısı belirtilen nüfus üzerinden bireysel yumurtlama olaylardan A. mexicanus.

nüfus	girişimleri	olaylar yumurtlama	Debriyajlar	Debriyaj boyutu	kreş bardak larva transfer	14dpf sonrası larva balık	hayatta kalma (%)
yüzey	4	3	2	576 & 1728	360	174	48
Molino	4	2	1	228	159	65	41
Tinaja	4	1	1	1952	175	93	53
Pachón	4	1	1	1696	360	293	81

Tablo 3: bir sistem recirculating ve larva yetiştirme ' A. mexicanus üreme bir ayın verileri özetini. Girişimleri sonucu, üreme sayısı olaylar, yumurtlama taranmış larva, larva kreş kapsayıcılar ve sonrası larva balık 14 gün sonra kreş kaplarda mevcut transfer larva debriyaj, başına ortalama sayısı üretilen Debriyaj yapar.

Tartışmalar

Gen etkinliğini yüzey ve mağara arasında karşılaştırma A. mexicanus dikkatle incelenmiş çevre parametreleri ve laboratuvarlar arasında çoğaltılabilir yöntemleri gerektirir. A. mexicanus yükseltmek için bizim protokol sonrası larva geliştirme sırasında tutarlı besin içeriği sağlar. Bu beslenme rejiminin gene işlevi güvenle biz mevcut sağlam immünhistokimya protokolü kullanılarak nüfus arasında karşılaştırılabilir. Burada bu yöntem aynı zamanda sınırlamalar ve gelecekteki uygulamalar. önemini tartışmak

Yoğunluk eşlemeli büyüme elde etmek için post larva balık iki haftadır su sirkülasyon Wrotek diyet 1, 5 L kaplarda olmadan yükseltilebilir buldum. Bu iletişim kuralı, balık bir dolaşım sistemi yükseltmek için de kullanılabilir; Ancak, Wrotek bu tank çıkış kayıp telafi etmek için günlük eklenmelidir. Yeni taranmış Artemia nauplii sık su ürünleri gıda kaynağı olarak kullanılan ama bulduk Wrotek kullanarak da dahil olmak üzere önemli avantajlar vardır: indirimli fiyat, geliştirilmiş Biyogüvenlik, tutarlı beslenme ve daha iyi su kalitesi (aşağıya bakın).

İlk olarak, haftalık sarf malzemeleri içinde Wrotek için 14 dolar Artemiaiçin karşılaştırıldığında, 4 dolara maliyetidir. Biyogüvenlik ile ilgili Wrotek kaldırdı laboratuvarında denetlenen koşullar altında iken Artemia vahşi ve mikrobiyal doğal varyasyon tabi toplanır veya patojen içeriğini²³. Ayrıca, Artemia nauplii besin bileşimi çevre kararlı ve bu nedenle tutarsız. Nauplii tarama sonra kendi enerji stok üstünde gelişmek; Onlar geliştirmek ve en iyi şekilde balık için-meli var olmak fed birkaç saat içinde hızlı bir şekilde besin değeri gevşek. Artemia başla sonrası kuluçkalık, beslenme açısından zenginleştirilmiş ilk kez temsil eden 12 evinde besleme; Ancak, bu aşamada onlar 5 dpf balık tüketmek çok büyük olmuştur. Buna karşılık, Wrotek sürekli olarak yüksek besin içeriği ne olursa olsun ne zaman Wrotek hasat sonuçlanan deniz mikroalg beslenir. Wrotek onları balık yakalamak ve yutmak daha kolay hale Artmeia nauplii (160 vs 400 mikron), çok daha küçüktür. Sonrası larva yüzey balık ve cavefish Wrotek tercih ya da yetenek Wrotek¹⁰yakalamak için hiçbir fark düşündüren benzer miktarlarda tüketmek.

Son olarak, Artemia nauplii tatlı suda tanıtılıyor sonra birkaç saat ölmeye başlar. Yenmeyen nauplii çürüme, onlar değil el ile kaldırılırsa hızla su kalitesi düşüyor. Ölü Artemia zaman alıcı ve Artemia çok daha büyük olmayan ve kaldırıldı ya da yaralandı-ebilmek var olmak kaza sonrası larva balıklar için tehlikeli olabilir. Wrotek süresiz olarak kreş kaplarda yaşamak ve yiyecek için balık her zaman önemli ölçüde su kalitesini etkilemeden sağlamak.

Bir besin kaynağı rotifer hisse senedi, yosun korumak için önemli faydaları vardır gibi Wrotek kullanarak kültür sisteme günlük eklenen gerekir iken. Bu sıvı yosun rotifer kültür konteyner içine dispenses bir otomatik besleyici ile elde edilebilir ( Tablo malzemelerigörmek). Wrotek da bu set-up 24-48 saatte kültür sağlığını korumak için hasat gerekir. Encysted embriyolar herhangi bir zamanda yumurtadan beri balık çok seyrek (yılda bir kez, örneğin) doğurmak ve sonrası larva aşamalarında nüfus arasında karşılaştırmalar yapma ile ilgili değildir araştırmacılar bir besin kaynağı olarak Artemia tercih edebilirsiniz.

Tarama ve büyüme başarısını izlemek için taranmış ve hayatta kalan larvalar sayısını izleme tavsiye ediyoruz. Embriyo veya larva çoğu ölürsen, bakteriyel veya mantar kontaminasyon nedeniyle olabilir. Bu balık için hazır su su kalitesini izlemek ve herhangi bir ekipman % 70 etanol ile sterilize etmek için tavsiye edilir. Sonra temizlenmeli ve sterilize kreş kapsayıcılarını yeniden kullanılabilir. Hastalığı riskini en aza indirmek için bu da herhangi bir ölü balık kreş kapsayıcılardan kaldır ve balık yemeye başladığınızda önce 5 dpf Wrotek eklememek için önemlidir.

A. mexicanus yaklaşık bir yıl eski cinsel olgun. Bu transgenik A. mexicanus 10-12 hafta²⁴doğurmak edebiliyoruz Danio rerio (zebra balığı) göre oluşturmak için bir kısıtlamadır. İmmünhistokimya (IHC) gen ekspresyonu ve protein yerelleştirme araştırmak için alternatif bir yöntemdir. Burada açıklanan protokolü her adımda uyarlanmış ve antijenleri ilgi herhangi bir doku içinde algılamak için kullanılan. Ancak, bazı dokularda karşılaştırmalı çalışmalar yorumu etkileyen yüzey balık pigmentasyon (unpigmented cavefish yok bir engel), nedeniyle görselleştirmek daha zor olabileceğini unutmayın. Bu olası sorunu gidermek için yüzey balık pigment %3 hidrojen peroksit kullanarak fiksasyon sonra ağartılmış.

IHC başarılı doku fiksasyon, engelleme ve antikor penetrasyon gerektirir. Yöntemleri her için doku ve protein ilgi bağlı olarak değişir. Sabitleştirici ve fiksasyon zaman hücre mimarisi antijen epitope koruyarak korumalıdır. Bu protokol, cross-linking sabitleştirici (paraformaldehyde) kullanın ve (metanol veya aseton gibi) denaturing bir sabitleştirici atlayabilirsiniz. Aseton kuluçka antikor sinyal nöronal ve pankreas işaretleri azalmış buldum. Engelleme adım antikorlar bağlama hedef proteinler doku önlemek için önemlidir. Bu yöntem normal serum (% 5) ve BSA (% 0,2) bir arada engelleme çözümde kullanır. Engelleme çözüm antikorlar ve non-spesifik bağlama birincil ve ikincil antikorların azalan dokusunda proteinleri reaktif sitelerine bağlayan proteinler içerir.

Antikor nüfuz elde etmek için doku permeabilized gerekir. Bu deterjanlar veya denaturing çözücüler ile elde edilebilir ancak antijen epitope korumak için optimize edilmiş olması gerekir. Bizim iletişim kuralı Triton ve dimetil sülfoksit (DMSO) bir birleşimini kullanır. Triton ve DMSO % 1 ve % 0,5 konsantrasyonlarda engelleme ve antikor kuluçka adımları sırasında sırasıyla yer almaktadır. Bu konsantrasyon kullanarak, biz beyin, pankreas, ince bağırsak ve kas, boyama tüm dokulara nüfuz için büyük olasılıkla etkili olduğunu düşündüren gözlemledim. Balık boyutu da penetrasyon etkileyebilir. Bu iletişim kuralı 14 gün eski (yaklaşık 7 mm uzunluğunda) daha büyük balık üzerinde test edilmemiştir. Boyama giderilir, fiksasyon, engelleme ve antikor penetrasyon adımları değiştirmek için önerilir. İmmunogen sıra koruma A. mexicanus protein mevcut genom²⁵kullanarak ilgi ile incelemek önemlidir.

A. mexicanus olasılığını önemli ölçüde farklı ortamlarda geliştiğini aynı tür laboratuvarda doğrudan karşılaştırılabilir gibi evrim araştırmak için mükemmel bir modeldir. Standart yetiştirme, laboratuvarlar arasında ve içinde yüzey balık ve cavefish biyolojik farklılıkları anlamak için gerekli iletişim kurallarıdır. Bizim makale geliştirme ve gen aktivite sonrası larva balık istikrarlı büyüme parametreleri için maruz incelemek için bir yöntem sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
methylene blue	Kordon	B016CBHZUS	antifungal
heater	Finnex	4711457836017	100W Digital Control Heater
airstone	Lee's Aquarium & Pet Products	10838125202	disposable air stone
salt	Instant Ocean	51378014021	Sea Salt
nursery container	IPC	21545-002	40 oz or 1.5 L clear containers
transfer pipette	VWR	414004-002	plastic bulb pipettes
compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers	Reed Mariculture	na	fish food
RGcomplete	APBreed	817656016572	32 oz bottle of rotifer food
Programmable Auto Dosing Pump DP-4	Jebao	DP-4	automatic feeder for rotifers
Tricane-S	Western Chemical	MS 222	fish anesthetic
sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G	for tricane solution
nylon mesh strainer	HIC (Harold Import Co.)	735343476235	3-inch diameter
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	fixative
10X PBS	Invitrogen	AM9625	buffer, dilute to 1X using distilled water
Triton-x 100	Sigma-Aldrich	T8787-250ML	detergent
sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002-25G	anti-bacterial
bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9647-100G	blocking reagent
glass vial with screw-top cap 4mL	Wheaton	224742	staining vial
plastic mesh screen for breeding tank	Pentair	N1670	Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net.
vinyl-coated disk magnets	Kjmagnets	D84PC-AST
New Life Spectrum Thera-A pellet fish food	New Life International	na	Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website
Antibodies
insulin antibody from guinea pig	Dako	A0564	1:200
glucagon antibody from sheep	Abcam	ab36215	1:200
acetylated tubulin antibody from mouse	Sigma	T6793	1:500
HuD/HuC antibody from mouse	Life Technologies	A-21271	1:500
nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit	Abcam	ab106417	5μg/mL
choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit	Abcam	ab178850	1:2000
seratonin (5HT) from rabbit	Immunostar	20080	1:500