המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

Summary

פרוטוקול זה מאפשר המרה מהירה ויעילה של תאי גזע pluriפוטנטי לתוך נוירונים מוטוריים עם זהות בעמוד השדרה או הגולגולת, על ידי ביטוי חוץ רחמי של גורמי שעתוק מתוך וקטורים inducible,.

Abstract

אנו מתארים כאן שיטה להשגת נוירונים פונקציונלי והגולגולת מנוע הגולגולתית האדם בתאי גזע pluriפוטנטי (iPSCs). המרה ישירה לתוך תא מנוע מושגת על ידי ביטוי חוץ רחמי של מודולים חלופיים של גורמים שעתוק, כלומר Ngn2, Isl1 ו Lhx3 (אפס) או Ngn2, Isl1 ו Phox2a (ניפ). אפס ו ניפ לציין, בהתאמה, מנוע השדרה ואת הגולגולת זהות תא העצב. הפרוטוקול שלנו מתחיל עם הדור של הקווים iPSC שונה שבו אפס או ניפ משולבים באופן מובן בגנום באמצעות מעבר טרנספסון וקטור. ביטוי של הטרנסגנים נגרמת לאחר מכן על ידי דוקסיציקלין ומוביל, בתוך 5 ימים, כדי ההמרה של iPSCs לתוך MN ושלתי. ההבשלה הבאים, עבור 7 ימים, מוביל אוכלוסיות הומוגנית של MNs השדרה או הגולגולת. השיטה שלנו מחזיקה מספר יתרונות על פני פרוטוקולים קודמים: הוא מהיר מאוד ופשוט יותר; היא אינה דורשת זיהום נגיפי או בידוד MN נוסף; היא מאפשרת יצירת משנה שונים MN (השדרה הגולגולת) עם תואר מדהים של התבגרות, כפי שניתן להדגים על ידי היכולת אש רכבות של פוטנציאל פעולה. יתר על כן, מספר גדול של נוירונים מוטוריים ניתן להשיג ללא טיהור מאוכלוסיות מעורבות. מנוע השדרה הנגזר של iPSC, הגולגולת והגולגולתית ניתן להשתמש בדוגמנות מבחנה של טרשת Amyotrophic לרוחב ומחלות ניווניות אחרות של תא העצב המנוע. אוכלוסיות מוטוריות הומוגניות עשויות לייצג משאב חשוב עבור סוג תא הקרנות סמים ספציפיות.

Introduction

מוטוריים תא העצב (MN) ניוון משחק תפקיד סיבתי במחלות האדם כגון טרשת Amyotrophic לרוחב (ALS) ו ניוון שרירים השדרה (SMA). הקמת מערכות מודל לבניית תאים מחוץ לתחום, המתאימות למורכבות של האדם האנושי, היא צעד חשוב לקראת התפתחות גישות טיפוליות חדשות. המושרה בתאי גזע פלוריפוטנטי (iPSCs), אשר ניחן בתכונות בידול השושלת המדהימה pluripotent כבר נגזר ממספר מטופלים המושפעים על ידי מחלות תא מנוע^1,2. קווי iPSC נוספים הנושאים מוטציות פתוגניים הקשורים מחלות MN נוצרו על ידי עריכת גנים, החל לשלוט "בריא" תאים גזע pluripotent³. קווים אלה מייצגים כלים שימושיים למידול מחלות חוץ גופית והקרנת סמים, בתנאי שהשיטות המתאימות לבידול iPSC לתוך MNs זמינים. הרציונל מאחורי הפיתוח של שיטה זו הוא לספק את הקהילה המדעית המעוניינים מחלות MN עם פרוטוקול בידול מהיר ויעיל ומעורר MNs פונקציונלי בוגרת. היתרון הראשון של שיטה זו הוא מסגרת ההוצאה להורג. עוד נקודה רלוונטית של חוזק באה מחיסול כל צעד טיהור. לבסוף, את הפרוטוקול ניתן להשתמש כדי ליצור שתי אוכלוסיות נפרדות של נוירונים מוטוריים.

האפשרות של יצירת תת סוגים שונים של MNs רלוונטי במיוחד עבור דוגמנות של מחלות MN. לא כל תת-הסוגים של MN פגיעים באותה מידה ב-ALS ו-SMA, והתחלתה של סימפטומים ביחידות מוטוריות שונות משפיעים מאוד על הפרוגנוזה. ב ALS, התפרצות השדרה עם סימפטומים החל בגפיים העליונים והתחתונים מוביל למוות בערך 3-5 שנים⁴. לעומת זאת, התפרצות בולבר, החל מניוון של MNs הגולגולת, יש פרוגנוזה הגרוע ביותר. יתר על כן, אחוז התפרצות בולבר הוא גבוה באופן משמעותי בחולים עם מוטציות ב-RNA-כריכת חלבונים פוס ו TDP-43 מאשר אנשים עם מוטציות SOD1⁵. כמעט מכלול הפרוטוקולים החלופיים MN בידול מסתמך על הפעילות של חומצה retinoic (RA), אשר מעניקה אופי השדרה כדי להבדיל iPSCs^6,7,8. זה מגביל את האפשרות של ללמוד גורמים פנימיים, אשר יכול להיות מגונן על מסוימים מסוימים MN^9,10.

בקנה אחד עם עבודה קודמת בתאי גזע מעובריים של העכבר¹¹, הצגנו לאחרונה כי בביטוי האנושי iPSCs רחמי של Ngn2, Isl1 ו LHX3 (אפס) מעורר זהות בעמוד השדרה, בעוד Ngn2 ו Isl1 פלוס PHOX2A (ניפ) לציין הגולגולת MNs¹². יש לנו ולכן פיתח פרוטוקול יעיל, המוביל לייצור של MNs האדם ניחן בתכונות פונקציונלי ב 12 יום הסבב. מטרת שיטה זו היא להשיג, במסגרת זמן קצר, ללא צורך לטיהור (למשל, על ידי FACS), אוכלוסיות תאים מועשר מאוד עבור MNs עם זהות השדרה או הגולגולת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תחזוקת הiPSCs האנושית

1. הכנת צלחות מצופות מטריקס
   1. הפשרת בקבוקון אחד של 5 מ ל (ראה טבלת חומרים) ב -4 ° c בלילה. מניות המטריצה המקוריות מגיעות לריכוזים שונים של מניות, ובהתאם לפקטור הדילול המצוין בגליון הנתונים, ספציפי למגרש הבודדים. חשוב לשמור על המבחנה וצינורות קרח קר כדי למנוע הגילינג מוקדמת של המטריצה. מטריצת מדבקות לתוך השפופרות. של ההקפאה המוקדמת על הקרח הקפאה ללא שימוש בהקפאה ב-20 ° c.
   2. מניחים אחד על הקרח על 2 h כדי להפשיר.
   3. לדלל את העליות של מטריקס עם 20 מ ל של הצטננות/F12 בצינור 50 mL.
   4. מערבבים היטב לוותר 1 מ ל של מטריצה מדולל לתוך 35 מ"מ מנות (כמויות שוות ערך לכל שטח של מנות אחרות).
   5. שמרו את הכלים המכילים מטריצה מדוללת עבור 1 h בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ציפוי.
      הערה: ניתן לאחסן כלים האטומים עם parafilm ב-4 ° צ' עד שבועיים.
2. הכנת פתרון המניה (20 מ ל) ו-1x עבודה באמצעות מגיב הדיסוציאציה של התאים העדינים (ראו טבלת חומרים).
   1. התמוססות אבקה ל 10 מ"ג/mL ב-PBS (Ca^{2 +}/mg^{2 +} חינם).
   2. מסנן לעקר דרך קרום מסנן יקרומטר 0.22.
   3. הכינו 20 מעלות (1 מ"ל לכל אחד) ואחסן ב-20 ° c.
   4. לפני השימוש, לדלל את אחד סדרת מחלקים ב PBS (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} חינם) ל 1 מ"ג/mL (1x העבודה המאביטים).
      הערה: ניתן לאחסן 1x שבועות עבודה ב -4 ° צ' עד שבועיים.
3. . מiPSCs אנושי
   1. לפני ההתחלה: אם הוא מאוחסן ב -4 ° c, לוחות מצופים חמים לפני מטריקס בחממה ב-37 ° c עבור 20-30 דקות. לחמם את החדר בטמפרטורה כמות האדם iPSC בינונית (ראה טבלת חומרים) הדרושים. לחמם מראש את Dמאמ/F12.
   2. . משוף תרבות בינונית
   3. לשטוף iPSCs עם PBS (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} חינם).
   4. הוסף פתרון דיסוציאציה עדינה של 1x (0.5 mL למנה 35 מ"מ). דגירה ב 37 ° צ' עד הקצוות של המושבות להתחיל להתנתק מן הצלחת, בדרך כלל 3-5 דקות.
   5. לשים לב לפתרון הדיסוציאציה העדינה, להיזהר שלא לנתק מושבות iPSC.
   6. שטוף את התאים עם Dמאמ/F12 (2 מ ל עבור צלחת 35 מ"מ) ומשלחים להיות זהירים לא לנתק את התאים. . חזור על השלב הזה עוד פעם אחת
   7. הוסף בינונית iPSC אנושי (1 mL עבור צלחת 35 מ"מ).
   8. התנתק בעדינות את המושבות באמצעות מרים ניידים והעבר לשפופרת של 15 מ ל.
   9. בעדינות לשבור את הגושים תאים על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם P1000 הצינורות או ה3-4 פעמים.
   10. מתיף את הסופרנטאנט מהפלטה.
   11. הזרע את התאים בנפח התרבות המתאים של מדיום iPSC אנושי. היחס המפוצל יכול להשתנות משורה לשורה, והוא כ-1:4-1:8. שנה את המדיום מדי יום.

2. יצירת שורות אפס ו-ניפ Inducible iPSC

1. . זיהום תאים
   1. לשטוף את התאים עם PBS (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} חינם).
   2. הוסף מגיב לדיסוציאציה של תא (ראה טבלת חומרים) (0.35 mL לצלחת 35 מ"מ) ו-דגירה ב 37 ° צ' עד שתאים בודדים מופרדים (5-10 דקות).
   3. בעדינות להשלים את ההפרדה התא על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם P1000 הצינורות ו-3-4 פעמים.
   4. לאסוף בצינור 15 מ"ל ולהוסיף PBS (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} חינם) עד 10 מ"ל. . תספור את התאים
   5. גלולה 10⁶ תאים ולהשעות מחדש ב 100 μl של מאגר R (כלול בערכת אלקטרופורציה התא, ראה טבלת חומרים).
   6. הוסף דנ א פלמיד לצורך העברה: 4.5 μg של טרנספסבל וקטור (epB-Bsd-TT-0 או epB-Bsd-TT-ניפ 12) ו 0.5 μg של המשלוח העביר את המשלוח^ב-13.
   7. Transfect עם מערכת אלקטרופורציה תא (ראה טבלת חומרים) לפי הוראות היצרן וכמתואר בעבר³ עם הפרמטרים הבאים: 1,200 V מתח, 30 ms רוחב, 1 פעימה. זרע את התאים בינונית iPSC אנושי בתוספת עם 10 μM Y-27632 (סלע מעכבי, ראה טבלת חומרים) ב 6 מ"מ מטריצה מצופה הצלחת.
2. בחירה עם אנטיביוטיקה.
   1. יומיים לאחר החצייה, להוסיף 5 μg/mL בלאסיפידין למדיום התרבות.
   2. רוב התאים הבלתי-מזוהמים ימותו ב48. שמור את התאים בלאסיטות לפחות 7-10 ימים כדי לבחור את התאים שאינם משולבים הטרנסגנים בגנום.
   3. לשמור על תאים מזוהמים באופן מורכב כאוכלוסיה מעורבת, המורכבת מתאים עם מספר שונה של טרנסגנים ואתרי אינטגרציה שונים, או לבודד שיבוטים יחיד.
   4. להכין צלחת נוספת כדי לבדוק ביטוי אפקטיבי של טרנסגנים, על 1 μg/mL דוקסיציקלין אינדוקציה, על-ידי RT-PCR עם התחל-Ngn2 הספציפי ביותר עבור הראשון (קדימה: TATGCACCTCCCCATAG; הפוך: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), כפי שמתואר בעבר¹².
   5. בשלב זה, להקפיא את המניות של הרומן אפס וניפ-iPSC קווים בהקפאה בינונית עבור האדם iPSCs (ראה לוח חומרים).

3. תא מנוע בידול

1. הנתק את התאים באמצעות מגיב לדיסוציאציה של תא כמתואר (שלבים 2.1.1.-2.1.3.). לאסוף תאים בלתי מתאים בצינור 15 מ"ל ו לדלל עם 5 כרכים של Dמאמ/F12. גלולה את התאים ולהשעות מחדש בינונית iPSC אנושי בתוספת עם 10 מעכב הסלע μM. ספור את התאים והזרעים על מנות מצופות מטריקס בצפיפות של 62,500 תאים/cm².
2. יום לאחר מכן, להחליף את המדיום עם DMEM/F12, שיושלם עם 1x יציבה L-גלוטמין אנלוגי, 1x לא חיוני חומצה אמינית (NEAA) התרבות תא תוסף ו 0.5 x פניצילין/סטרפטומיצין, ומכיל 1 μg/mL דוקסיציקלין. זה נחשב כיום 0 של בידול. ביום 1, רענן את המדיום ו דוקסיציקלין.
3. ביום 2, לשנות את המדיום כדי Neurobasal סיס/B27 בינונית (נוירובינונית מדיום שיושלם עם 1x B27, 1x יציבה L-גלוטמין אנלוגי, 1x NEAA ו-0.5 x פניצילין/סטרפטומיצין), המכיל 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 ו-1 μg/mL דוקסיציקלין (ראה טבלת חומרים ). רענן את המדיום ו דוקסיציקלין כל יום עד יום 5.
4. יום 5: תאים דיסוציאציה עם מגיב לדיסוציאציה של תא (ראו טבלת חומרים).
   1. לשטוף את התאים עם PBS (Ca^{2 +}/Mg^{2 +} חינם).
   2. הוסף את מגיב הדיסוציאציה של תא (0.35 mL עבור צלחת 35 מ"מ) ו-דגירה ב 37 ° צ' עד מפריד התא כולו מפרידה ממנה. שים לב שתאים בודדים לא יופרדו במהלך הדגירה.
   3. הוסף 1 מ ל של DMEM/F12 ולאסוף את התאים בצינור 15 מ ל.
   4. בעדינות להשלים את ההפרדה התא על ידי ליטוף למעלה ולמטה עם P1000 הצינורות ו-10-15 פעמים.
   5. להוסיף 4 מ ל של Dמאמ/F12 ולספור את התאים.
   6. בשלב זה, הקפאת מנוע תא העצב ושלתי בתא הקפאת בינונית (ראה טבלת חומרים), על פי הוראות היצרן.
   7. גלולה את התאים ולהשעות מחדש בינונית עצבית (Neurobasal סיס/B27 בינוני בתוספת 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF ו 200 ng/mL-חומצה אסקורבית, ראה לוח חומריםs) שיושלם עם 10 ΜM סלע מעכב.
   8. הזרע את התאים על האורשים/למינציה-או לחילופין על תמיכה מצופי מטריקס בצפיפות של 100,000 תאים/cm². השתמש ב-μ-שקופית פלסטיק תומך עם שמיכות פולימר (ראה טבלת חומרים) לניתוח חיסוני.
5. ביום 6, לשנות את המדיום עם המדיום העצבי הטרי נטול מעכבי סלע. בימים הקרובים, תרענן. חצי מהמדיום כל 3 ימים יש לשנות את מבנה התרבות בזהירות רבה כדי למנוע ניתוק מפני השטח.

4. ניתוח חיסוני

1. . קיבוע תאים לשטוף את התאים עם PBS (עם Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) ו דגירה עבור 15 דקות ב 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS (עם ca^{2 +}/Mg^{2 +}) בטמפרטורת החדר.
   זהירות: פאראפורמלדהיד הוא רעיל וחשוד לגרום לסרטן. הימנע ממגע עם העור והעיניים וטפל מתחת למכסה כימי.
2. החדירות עם PBS (עם Ca^{2 +}/Mg^{2 +}) המכיל 0.1% טריטון X-100 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
3. דגירה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר בפתרון חסימת נוגדנים (ABS: 3% BSA ב-PBS עם Ca^{2 +}/Mg^{2 +}).
4. דגירה עבור 1 h בטמפרטורת החדר עם נוגדנים העיקרי ABS: anti-TUJ1 (1:1000; ארנב) ו anti-Oct4 (1:200; עכבר) או נגד צ'אט (אנטי כולין Acetyltransferase; 1:150; עז). ראה טבלת חומרים.
5. מודטה עבור 45 דקות בטמפרטורת החדר עם החמור המתאים נוגדן משני בתוך ABS: נגד עכבר אלקסה Fluor 647 (1:250), אנטי ארנבת אלקסה Fluor 594 (1:250) ונגד עז אלקסה Fluor 488 (1:250). ראה טבלת חומרים.
6. דגירה ב 0.4 μg/mL DAPI עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר לתייג גרעינים.
7. הר את התאים עם הרכבה בינונית (ראה טבלת חומרים) לדימות במיקרוסקופ פלואורסצנטית.

5. אפיון פונקציונלי באמצעות טלאי-הקלטות קלאמפ

1. הכינו את הפתרון החיצוני (נס) כדלקמן: 140 מ"מ, 2.8 מ"מ KCl, 2 מ"מ בגודל 2mm, 2 מ"מMgCl₂, 10 מ"מ hepes, ו 10 מ"מ גלוקוז. הגדר את האוסמגליות בין 290-300 mΩ. כוונן את ה-pH ל 7.3 באמצעות 1N NaOH ואחסן את הפתרון ב-4 ° c.
2. הכינו את הפתרון הפנימי: 140 mM K-גלוקונאט, 2 מ"מ הייגל, 5 מ מ באפטה, 2 מ"מ MgCl₂, 10 מ"מ hepes, 2 מ ג MG-ATP, 0.3 mm NA-gtp. להתאים את ה-pH ל 7.3 עם קו 1M ו לבדוק את האוסמלקיים מוגדר בסביבות 290 mΩ. הקפאת הפתרון ב-20 ° c בעלי מענה קטן.
3. לפני הפעלת הניסויים, לחמם מראש את הפתרון NES באמבט מים על 28-30 ° c.
4. משוך מיקרורטט בורוסיליקט (מזהה 0.86 מ"מ; OD 1.5 mm) נושאת התנגדות טיפ: 5-6 MΩ ולמלא עם פתרון תאיים לפני ההרכבה לתוך המחזיק פיפטה.
   הערה: זכור את חוטי כסף כלוריד של אלקטרודות ההקלטה התייחסות אלקטרודה אקונומיקה לפחות 30 דקות כדי ליצור שכבה אחידה של AgCl על משטח התיל.
5. העבירו את צלחת פטרי בתא ההקלטה והרשו לחדר עם פתרון NES בשעה 1-2 mL/min. תנו לזרימה לעבור דרך מחמם מוטבע שנקבע בטמפרטורה של 30 ° c כדי לשמור על הפתרון חם.
6. חדר הקלטה אלקטרולוגי. מתחת למיקרוסקופ זקוף הקלט זרמי ממברנה באמצעות מגבר מהדק התיקון והשגת נתונים באמצעות תוכנה מתאימה.
7. פתח את תוכנת בקרת המגבר, והגדר את רווח האות בערך 1 ואת מסנן בסל ב-10 kHz. ודא שמסנן בסל נמוך פי 2.5 מתדירות הדגימה.
8. הגדר את הפרוטוקולים הניסיוניים עבור מלחציים מתח וניסויים מלחציים נוכחיים בתוכנת ההקלטה.
9. בהגדרת הפרוטוקול, שנתות מצב גירוי האפיזודי ולהגדיר את תדירות הדגימה ב 25 kHz. לאחר מכן, לעבור אל הכרטיסיה צורת גל ולהקליד את המתח או הצעד הנוכחי משרעת ואורך כמו הפעל.
10. עבור זרמי הנתרן מגודרת, להשתמש 15 שלבי מתח (50 ms משך כל אחד) מ-100 mV כדי + 40 mV (10 mV הגדל). הפעל את הפרוטוקול לאחר הטלת תא שתוקנה הפוטנציאל המחזיק של-60 mV דרך המגבר. באופן דומה, זרמים מגודרת מתח האשלגן מעורר באמצעות צעדי מתח (250 ms משך כל אחד) מ-30 mV כדי + 50 mV (10 mV תוספת) מחזיק את התא המוקלט ל-40 mV.
11. עבור חקירת תכונות הירי של הגולגולת iPSC-נגזר MNs השדרה, תאים מלחציים, במצב הנוכחי-קלאמפ, על פוטנציאל הממברנה של-70 mV ולהשתמש 4 פולסים הנוכחי (1 משך כל אחד) של משרעת הגוברת (מ + 20 pA כדי + 80 pA; 20 pA תוספת).
12. לרכוש עבור כל זרם מופעל מתח, פעילות ירי מעורר ושלושה מאפיינים פסיביים כמו קיבול תא שלם (Cm), עמידות קרום התא (Rm) והפוטנציאל ממברנה מנחה (RMP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תיאור סכמטי של שיטת הבידול מוצג באיור 1. האדם iPSCs (WT I קו³) היו מזוהמים עם Epb-BSD-TT-אפס או Epb-BSD-TT-ניפ, הפקת, על בחירת בלטות, יציבה ושורות תא inducible¹², להלן המכונה ipsc-אפס ו ipsc-ניפ, בהתאמה. תאים ההבחנה התאפיין בביטוי של סמן הפלאואון OCT4 ו-TUJ1 סמן הפאן-עצבי. ניתוח חיס...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מאפשר להמיר ביעילות את iPSCs אנושי לתוך מנוע השדרה ואת הגולגולת נוירונים בזכות הביטוי החוץ רחמי של השושלת הספציפיים שעתוק גורמים. הטרנסגנים האלה הם inducible על ידי דוקסיציקלין ו משולבים באופן מובן בגנום הודות לטרנספבאק המבוסס על מוקטור. באוכלוסיה מעורבת, עותק אחד או כמה של וקטור הש?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	chemicals for electrophysiological solutions
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Cell dissociation reagent
anti-CHAT	EMD Millipore	AB144P	Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003
anti-goat Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A31571	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130
anti-Oct4	BD Biosciences	611202	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722
anti-Phox2b	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-376997	Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594	Immunological Sciences	IS-20152-1	Secondary antibody used for immonofluorescence assays
anti-TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors
BDNF	PreproTech	450-02	Brain-Derived Neurotrophic Factor
Blasticidin	Sigma-Aldrich	203350	Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	chemicals for electrophysiological solutions
Clampex 10 software	Molecular Devices	Clampex 10	Membrane currents recording system
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5146	chemicals for electrophysiological solutions
DAPI powder	Roche	10236276001	4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Gamma secretase inhibitor
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
E.Z.N.A Total RNA Kit	Omega bio-tek	R6834-02	Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	chemicals for electrophysiological solutions
iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	Kit for gene expression analysis using real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121	Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument
K-Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	chemicals for electrophysiological solutions
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	chemicals for electrophysiological solutions
L-ascorbic acid	LKT Laboratories	A7210	Used in cell culture as an antioxidant
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Laser scanning confocal microscope	Olympus	iX83 FluoView1200	Confocal microscope for acquisition of immunostaining images
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	chemicals for electrophysiological solutions
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	chemicals for electrophysiological solutions
Mounting Medium	Ibidi	50001	Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays
Multiclamp patch-clamp amplifier	Molecular Devices	700B	Membrane currents recording system
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	chemicals for electrophysiological solutions
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	chemicals for electrophysiological solutions
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8	Used for cell fixation in immunostaining assays
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, with Calcium, with Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays
Upright microscope	Olympus	BX51VI	Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera
Y-27632  (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival
μ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Support for high–end microscopic analysis of fixed cells