Conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac

Résumé

Ce protocole permet une conversion rapide et efficace des cellules souches pluripotentes induites en neurones moteurs avec une identité spinale ou crânienne, par l’expression ectopique des facteurs de transcription des vecteurs inductibles de piggyBac.

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour obtenir des neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs). La conversion directe en neurone moteur est obtenue par l’expression ectopique de modules alternatifs de facteurs de transcription, à savoir Ngn2, Isl1 et Lhx3 (NIL) ou Ngn2, Isl1 et Phox2a (NIP). NIL et NIP spécifient, respectivement, l’identité du neurone du moteur rachidien et crânien. Notre protocole commence par la génération de lignes iPSC modifiées dans lesquelles NIL ou NIP sont intégrés de manière stable dans le génome via un vecteur de transposon piggyBac. L’expression des transgènes est ensuite induite par la doxycycline et conduit, en 5 jours, à la conversion des IPSC en progéniteurs mn. La maturation subséquente, pendant 7 jours, conduit à des populations homogènes de MNs spinales ou crânienne. Notre méthode contient plusieurs avantages par rapport aux protocoles précédents: il est extrêmement rapide et simplifié; il ne nécessite pas d’infection virale ou d’isolement MN supplémentaire; Il permet de générer différentes sous-populations de MN (spinale et crânienne) avec un degré remarquable de maturation, comme en témoigne la capacité de tirer des trains de potentiels d’action. En outre, un grand nombre de neurones moteurs peuvent être obtenus sans purification de populations mixtes. les neurones moteurs spinaux et crânien dérivés de l’iPSC peuvent être utilisés pour la modélisation in vitro de la sclérose latérale amyotrophique et d’autres maladies neurodégénératives du Neuron du moteur. Les populations homogènes de neurons moteurs peuvent représenter une ressource importante pour les dépistages de médicaments spécifiques au type cellulaire.

Introduction

La dégénérescence du neurone du moteur (MN) joue un rôle causal dans les maladies humaines telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et l’atrophie musculaire spinale (SMA). L’établissement de systèmes de modèles cellulaires in vitro adaptés qui récapitulent la complexité du MN humain est une étape importante vers le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Les cellules souches pluripotentes induites (ipscs), qui sont dotées de propriétés de différenciation plurilinéale remarquables, ont maintenant été dérivées d’un certain nombre de patients touchés par les maladies du neurone moteur^1,2. D’autres lignées iPSC porteuses de mutations pathogènes associées à des maladies du MN ont été générées par l’édition génique, à partir de cellules souches pluripotentes de contrôle «saines»³. Ces lignes représentent des outils utiles pour la modélisation des maladies in vitro et le dépistage des médicaments, à condition que des méthodes appropriées pour la différenciation des iPSC dans les MNs soient disponibles. Le raisonnement qui sous-tend le développement de cette méthode est de fournir à la communauté scientifique intéressée par les maladies MN un protocole de différenciation rapide et efficace donnant naissance à des MNs fonctionnelles matures. Le premier avantage de cette méthode est son délai d’exécution. Un autre point de force pertinent vient de l’élimination de toute étape de purification. Enfin, le protocole peut être utilisé pour générer deux populations distinctes de neurones moteurs.

La possibilité de générer différents sous-types de MNs est particulièrement pertinente pour la modélisation des maladies MN. Tous les sous-types de MN ne sont pas tout aussi vulnérables dans le SLA et le SMA et l’apparition des symptômes dans différentes unités motrices influe grandement sur le pronostic. Dans l’ALS, l’apparition spinale avec des symptômes commençant dans les membres supérieurs et inférieurs conduit à la mort dans environ 3-5 ans⁴. Inversement, l’apparition de bulbardes, commençant par la dégénérescence des MNs crânienne, a un pronostic pire. En outre, le pourcentage d’apparition de bulbardes est significativement plus élevé chez les patients avec des mutations dans les protéines de liaison de l’ARN FUS et TDP-43 que chez les individus avec des mutations SOD1⁵. Presque la totalité des protocoles alternatifs de différenciation du mn repose sur l’activité de l’acide rétinoïque (RA), qui confère un caractère spinal à la différenciation des ipscs^6,7,8. Cela limite la possibilité d’étudier des facteurs intrinsèques, qui pourraient être protecteurs dans des sous-types de mn spécifiques^9,10.

En accord avec un travail antérieur dans les cellules souches embryonnaires de souris¹¹, nous avons récemment montré que dans l’expression ectopique d’ipscs humaine de Ngn2, Isl1 et LHX3 (Nil) induit une identité de mn spinale, tandis que Ngn2 et Isl1 plus PHOX2A (NIP) spécifient le MNS crânien¹². Nous avons donc développé un protocole efficace, conduisant à la production de MNs humaines dotées de propriétés fonctionnelles dans un délai de 12 jours. Le but de cette méthode est d’obtenir, dans un court laps de temps et sans la nécessité de purification (par exemple, par FACS), les populations cellulaires hautement enrichi pour les MNs avec l’identité spinale ou crânienne.

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Protocole

1. maintenance des IPSC humains

1. Préparation de plaques enrobées de matrices
   1. Décongeler un flacon de 5 mL de matrice (voir tableau des matériaux) à 4 ° c pendant la nuit. Les stocks matriciels originaux proviennent de différentes concentrations de stocks et les aliquotes sont effectués selon le facteur de dilution indiqué sur la fiche technique, spécifique au lot individuel. Il est important de garder le flacon et les tubes froids pour éviter une gélification prématurée de la matrice. Distribuez la matrice en aliquotes dans des cryotubes préréfrigérés sur glace. Congeler les aliquotes inutilisés à-20 ° c.
   2. Placer une aliquote sur la glace pendant environ 2 h pour décongeler.
   3. Diluer l’aliquote de matrice avec 20 mL de DMEM/F12 froid dans un tube conique de 50 mL.
   4. Bien mélanger et distribuer 1 mL de matrice diluée dans des plats de 35 mm (quantités équivalentes par surface d’autres plats).
   5. Conserver les plats contenant une matrice diluée pendant 1 h à température ambiante pour permettre le revêtement.
      Remarque: Les plats, scellés avec du Parafilm, peuvent être stockés à 4 ° c pendant 2 semaines.
2. Préparation de la solution d’action (20 ml) et 1x aliquotes de travail du réactif de dissociation cellulaire doux (voir tableau des matériaux).
   1. Dissoudre la poudre à 10 mg/mL dans du PBS (ca^{2 +}/mg^{2 +} gratuit).
   2. Filtrer stériliser à travers une membrane filtrante de 0,22 μM.
   3. Préparer 20 aliquotes (1 mL chacun) et les conserver à-20 ° c.
   4. Avant utilisation, diluer une aliquote dans du PBS (ca^{2 +}/mg^{2 +} Free) à 1 mg/ml (1x aliquots de travail).
      Remarque: 1x les aliquotes de travail peuvent être stockés à 4 ° c pendant 2 semaines maximum.
3. Passaging iPSCs humains.
   1. Avant de commencer: s’il est stocké à 4 ° c, les plaques pré-chaudes enduites de matrice dans l’incubateur à 37 ° c pendant 20-30 min. Préchauffer à température ambiante la quantité de milieu humain iPSC (voir tableau des matériaux) nécessaire. Préchauffer le DMEM/F12.
   2. Milieu de culture aspirate.
   3. Rincez les IPSC avec du PBS (ca^{2 +}/mg^{2 +} gratuit).
   4. Ajouter 1x solution de dissociation douce (0,5 mL pour un plat de 35 mm). Incuber à 37 ° c jusqu’à ce que les bords des colonies commencent à se détacher de la plaque, généralement 3-5 min.
   5. Aspirer la solution de dissociation douce, en veillant à ne pas détacher les colonies iPSC.
   6. Laver les cellules avec du DMEM/F12 (2 mL pour un plat de 35 mm) et aspirer en veillant à ne pas détacher les cellules. Répétez cette étape une fois de plus.
   7. Ajouter le milieu iPSC humain (1 mL pour un plat de 35 mm).
   8. Détachez délicatement les colonies avec un lève-cellules et transférez-les dans un tube de 15 mL.
   9. Casser doucement les amas de cellules en pipetant de haut en bas avec un multipipette P1000 3-4 fois.
   10. Aspirer le surnageant de la (des) plaque (s) enrobées de matrice.
   11. Ensemencer les cellules dans le volume de culture approprié du milieu iPSC humain. Le ratio de fractionnement peut varier d’une ligne à l’autres et est d’environ 1:4-1:8. Changez le médium quotidiennement.

2. génération de lignes iPSC inducibles de NIL et de NIP

1. Transfection cellulaire.
   1. Rincer les cellules avec du PBS (ca^{2 +}/mg^{2 +} gratuit).
   2. Ajouter le réactif de dissociation cellulaire (voir tableau des matériaux) (0,35 ml pour un plat de 35 mm) et incuber à 37 ° c jusqu’à ce que les cellules individuelles soient séparées (5-10 min).
   3. Terminez doucement la séparation cellulaire en pipetant de haut en bas avec un multipipette P1000 3-4 fois.
   4. Prélever dans un tube de 15 mL et ajouter du PBS (ca^{2 +}/mg^{2 +} gratuit) à 10 ml. Comptez les cellules.
   5. Granulés 10⁶ cellules et resuspendre dans 100 μl de tampon R (inclus dans le kit d’électroporation cellulaire, voir tableau des matériaux).
   6. Ajouter l’ADN plasmidique pour la transfection: 4,5 μg de vecteur transposable (epB-BSD-TT-NIL ou epB-BSD-TT-NIP¹²) et 0,5 μg du plasmide de transposase piggyBac¹³.
   7. Transfect avec le système d’électroporation cellulaire (voir tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant et comme décrit précédemment³ avec les paramètres suivants: 1 200 tension V, 30 ms de largeur, 1 impulsion. Ensemencer les cellules dans un milieu iPSC humain additionné de 10 μM Y-27632 (inhibiteur de roche, voir tableau des matériaux) dans un plat à matrice de 6 mm.
2. Sélection avec des antibiotiques.
   1. Deux jours après la transfection, ajouter 5 μg/mL de blasticidine au milieu de culture.
   2. La plupart des cellules non transfection mourront dans les 48 h de sélection de blasticidine. Conserver les cellules dans la blasticidine pendant au moins 7-10 jours pour contrer-sélectionner les cellules qui n’ont pas intégré les transgènes dans le génome.
   3. Maintenir des cellules transfectées de manière stable en tant que population mixte, composée de cellules avec un nombre différent de transgènes et de différents sites d’intégration, ou isoler des clones isolés.
   4. Préparer un plat supplémentaire pour vérifier l’expression efficace des transgenes, sur 1 μg/mL d’induction de doxycycline, par RT-PCR avec des amorces spécifiques au transgène pour Ngn2 (Forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Inverse: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), comme décrit précédemment¹².
   5. À ce stade, geler les stocks des nouvelles lignées NIL-et NIP-iPSC dans le milieu de congélation pour les IPCS humains (voir le tableau des matériaux).

3. différenciation du Neuron moteur

1. Dissociez les cellules avec le réactif de dissociation de cellules comme décrit (étapes 2.1.1.-2.1.3.). Prélever des cellules dissociées dans un tube de 15 mL et diluer avec 5 volumes de DMEM/F12. Pellet les cellules et resuspendre dans le milieu humain iPSC complété avec 10 μM inhibiteur de roche. Comptez les cellules et les semences sur des plats enrobés de matrice à une densité de 62 500 cellules/cm².
2. Le lendemain, remplacez le milieu par le DMEM/F12, complété par 1x analogue de L-glutamine stable, 1x supplément de culture cellulaire de l’acide aminé non essentiel (NEAA) et 0,5 x pénicilline/streptomycine, et contenant 1 μg/mL de doxycycline. Ceci est considéré comme le jour 0 de la différenciation. Le jour 1, rafraîchissez le milieu et la doxycycline.
3. Le deuxième jour, changez le milieu en milieu Neurobasal/2/17 (milieu Neurobasal additionné de 1x 2, 1x, analogue de L-glutamine stable, 1x NEAA et 0,5 x pénicilline/streptomycine), contenant 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 et 1 μg/mL de doxycycline (voir tableau des matériaux ). Rafraîchissez le milieu et la doxycycline tous les jours jusqu’au jour 5.
4. Jour 5: dissociation des cellules avec le réactif de dissociation cellulaire (voir tableau des matériaux).
   1. Rincer les cellules avec du PBS (ca^{2 +}/mg^{2 +} gratuit).
   2. Ajouter le réactif de dissociation cellulaire (0,35 mL pour un plat de 35 mm) et incuber à 37 ° c jusqu’à ce que toute la monocouche de la cellule se sépare du plat. Notez que les cellules individuelles ne seront pas séparées pendant l’incubation.
   3. Ajouter 1 mL de DMEM/F12 et collecter les cellules dans un tube de 15 mL.
   4. Terminez doucement la séparation cellulaire en pipetant de haut en bas avec un multipipette P1000 10-15 fois.
   5. Ajoutez 4 mL de DMEM/F12 et comptez les cellules.
   6. À ce stade, geler les progéniteurs du neurone du moteur dans le milieu de congélation cellulaire (voir tableau des matériaux), selon les instructions du fabricant.
   7. Pellet les cellules et resuspendre dans neuronal Medium (Neurobasal/2, 5milieu complété avec 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF et 200 ng/mL acide L-ascorbique, voir tableau des matériauxs) complété par 10 μM inhibiteur de roche.
   8. Ensemencer les cellules sur poly-ornithine/laminine-ou alternativement sur des supports revêtus de matrices à la densité de 100 000 cellules/cm². Utilisez des supports en plastique μ-Slide avec des lamelles en polymère (voir tableau des matériaux) pour l’analyse Immunostatique.
5. Le jour 6, changez le milieu avec le milieu neuronal frais dépourvu d’inhibiteur de roche. Les prochains jours, rafraîchissez la moitié du médium tous les 3 jours. Le milieu de culture doit être changé très soigneusement afin d’éviter le détachement de la surface.

4. analyse immunostaining

1. Fixation des cellules. Rincer les cellules avec du PBS (avec ca²+/mg^{2 +}) et incuber pendant 15 min dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS (avec ca^{2 +}/mg^{2 +}) à température ambiante.
   Attention: Paraformaldéhyde est toxique et soupçonné de causer le cancer. Évitez tout contact avec la peau et les yeux et manipulez-les sous une hotte chimique.
2. Perméabilize avec PBS (avec ca^{2 +}/mg^{2 +}) contenant 0,1% de Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante.
3. Incuber pendant 30 min à température ambiante dans la solution de blocage d’anticorps (ABS: 3% BSA dans PBS avec ca^{2 +}/mg^{2 +}).
4. Incuber pendant 1 h à température ambiante avec des anticorps primaires en ABS: anti-TUJ1 (1:1000; lapin) et anti-Oct4 (1:200; souris) ou anti-CHAT (acétyltransférase anti-choline; 1:150; chèvre). Voir le tableau des matériaux.
5. Incuber pendant 45 min à température ambiante avec une paire d’anticorps secondaire d’âne appropriée en ABS: anti-souris Alexa Fluor 647 (1:250), anti-lapin Alexa Fluor 594 (1:250) et anti-chèvre Alexa Fluor 488 (1:250). Voir le tableau des matériaux.
6. Incuber en 0,4 μg/mL de DAPI pendant 5 min à température ambiante pour étiqueter les noyaux.
7. Montez les cellules avec un support de montage (voir tableau des matériaux) pour l’imagerie à un microscope à fluorescence.

5. caractérisation fonctionnelle via des enregistrements patch-clamp

1. Préparer la solution externe Equilibrée (NES) HEPES comme suit: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl₂mm MgCl₂, 10 mm HEPES et 10 mm de glucose. Réglez l’osmolarité entre 290-300 mΩ. Réglez le pH sur 7,3 à l’aide du NaOH 1N et stockez la solution à 4 ° c.
2. Préparer la solution interne: 140 mM K-gluconate, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl₂, 10 mm HEPES, 2 mm mg-ATP, 0,3 mm na-GTP. Réglez le pH sur 7,3 avec 1M KOH et vérifiez que l’osmolarité est fixée à environ 290 mΩ. Congeler la solution à-20 ° c dans les petits aliquots.
3. Avant d’exécuter les expériences, préchauffer la solution NES dans un bain d’eau à environ 28-30 ° c.
4. Tirer quelques micropipettes borosilicate (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) portant une résistance à la pointe: 5-6 MΩ et remplir avec la solution intracellulaire avant de le monter dans le porte-pipette.
   Remarque: N’oubliez pas de chlorure d’argent fils de l’électrode d’enregistrement et l’électrode de référence dans l’eau de Javel pendant au moins 30 min afin de former une couche uniforme d’AgCl sur la surface du fil.
5. Transférer la boîte de Petri dans la chambre d’enregistrement et laisser la chambre avec la solution NES à 1-2 mL/min. Laisser le flux passer par un chauffe-eau en ligne réglé à une température de 30 ° c afin de maintenir la solution au chaud.
6. Placer la chambre d’enregistrement électrophysiologique sous un microscope vertical. Enregistrez les courants membranaires avec l’amplificateur patch-clamp et acquérez des données avec un logiciel approprié.
7. Ouvrez le logiciel de commande de l’amplificateur et réglez le gain de signal à la valeur 1 et le filtre Bessel à 10 kHz. Assurez-vous que le filtre Bessel est 2,5 fois plus bas que la fréquence d’échantillonnage.
8. Définissez les protocoles expérimentaux pour les expériences de Clamp de tension et de serrage de courant dans le logiciel d’enregistrement.
9. Dans le paramètre de protocole, cochez le mode de stimulation épisodique et réglez la fréquence d’échantillonnage à 25 kHz. Ensuite, passez à l’onglet de forme d’onde et tapez l’amplitude et la longueur de l’étape de tension ou de courant comme suit.
10. Pour les courants de sodium à tension, utiliser 15 paliers de tension (durée de 50 ms chacun) de-100 mV à + 40 mV (incrément de 10 mV). Exécutez le protocole après avoir imposé à la cellule patchée un potentiel de maintien de-60 mV à travers l’amplificateur. De même, les courants de potassium à tension fermée sont évoqués par des paliers de tension (durée de 250 ms chacune) de-30 mV à + 50 mV (incrément de 10 mV) qui maintiennent la cellule enregistrée à-40 mV.
11. Pour étudier les propriétés de tir des MNs crânienne et spinales dérivées de l’iPSC, les cellules de serrage, en mode de serrage actuel, à un potentiel membranaire de-70 mV et utilisent 4 impulsions de courant (1 s de durée chacune) d’amplitude croissante (de + 20 pA à + 80 pA; 20 pA d’incrément).
12. Acquérir pour chaque courant de tension cellulaire activé, activité de tir évoquée et trois propriétés passives comme capacité de cellules entières (cm), résistance membranaire cellulaire (RM) et potentiel membranaire au repos (PGR).

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Résultats

Une description schématique de la méthode de différenciation est illustrée à la figure 1. Les iPSCs humains (WT I Line³) ont été transfrés avec EPB-BSD-TT-Nil ou EPB-BSD-TT-NIP, générant, sur sélection de blasticidine, des lignées cellulaires stables et inductibles¹², ci-après appelées IPSC-Nil et IPSC-NIP, respectivement. Les cellules différenciantes ont été caractérisées pour l’expression du marqueur de pluripotence OCT4 ...

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Discussion

Ce protocole permet de convertir efficacement les IPSC humains en neurones moteurs spinaux et crânien grâce à l’expression ectopique de facteurs de transcription spécifiques à la lignée. Ces transgènes sont inductibles par la doxycycline et sont intégrés de manière stable dans le génome grâce à un vecteur basé sur le transposon piggyBac. Dans une population mixte, une ou plusieurs copies du vecteur piggyBac seront intégrées au hasard dans le génome de cellules individuelles, augmentant ainsi le risque ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	chemicals for electrophysiological solutions
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Cell dissociation reagent
anti-CHAT	EMD Millipore	AB144P	Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003
anti-goat Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A31571	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130
anti-Oct4	BD Biosciences	611202	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722
anti-Phox2b	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-376997	Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594	Immunological Sciences	IS-20152-1	Secondary antibody used for immonofluorescence assays
anti-TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors
BDNF	PreproTech	450-02	Brain-Derived Neurotrophic Factor
Blasticidin	Sigma-Aldrich	203350	Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	chemicals for electrophysiological solutions
Clampex 10 software	Molecular Devices	Clampex 10	Membrane currents recording system
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5146	chemicals for electrophysiological solutions
DAPI powder	Roche	10236276001	4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Gamma secretase inhibitor
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
E.Z.N.A Total RNA Kit	Omega bio-tek	R6834-02	Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	chemicals for electrophysiological solutions
iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	Kit for gene expression analysis using real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121	Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument
K-Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	chemicals for electrophysiological solutions
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	chemicals for electrophysiological solutions
L-ascorbic acid	LKT Laboratories	A7210	Used in cell culture as an antioxidant
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Laser scanning confocal microscope	Olympus	iX83 FluoView1200	Confocal microscope for acquisition of immunostaining images
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	chemicals for electrophysiological solutions
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	chemicals for electrophysiological solutions
Mounting Medium	Ibidi	50001	Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays
Multiclamp patch-clamp amplifier	Molecular Devices	700B	Membrane currents recording system
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	chemicals for electrophysiological solutions
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	chemicals for electrophysiological solutions
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8	Used for cell fixation in immunostaining assays
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, with Calcium, with Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays
Upright microscope	Olympus	BX51VI	Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera
Y-27632  (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival
μ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Support for high–end microscopic analysis of fixed cells