שימוש בקרוב-אינפרא אדום פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה סריקה למדוד חלבון הביטוי במוח מכרסם

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול העושה שימוש בצבעים ליד אינפרא-אדום בשילוב עם האימונוהיסטוכימיה וסריקה ברזולוציה גבוהה כדי לאשר את החלבונים באזורי המוח.

Abstract

מדעי המוח הוא חקר כיצד תאים במוח בתווך פונקציות שונות. מדידת חלבון הביטוי בנוירונים ו glia היא קריטית לחקר מדעי המוח כפונקציה תאית נקבעת על ידי הרכב ופעילות של חלבונים סלולריים. במאמר זה, אנו מתארים כיצד ניתן לשלב את היכולות האימונולוציטוכימיה עם סריקה ברזולוציה גבוהה-אינפרא-אדום כדי לספק מידה חצי כמותית של ביטוי חלבון באזורי מוח נפרדים. ניתן להשתמש בטכניקה זו לביטוי חלבון יחיד או כפול באותו אזור המוח. מדידת חלבונים בצורה זו יכולה לשמש כדי לקבל שינוי יחסי בביטוי חלבון עם מניפולציה ניסיוני, חתימה מולקולרית של למידה וזיכרון, פעילות במסלולים מולקולריים, ופעילות עצבית באזורי מוח מרובים. ניתן לקבוע באמצעות החלבונים והניתוחים הסטטיסטיים הנכונים, קישוריות פונקציונלית בין אזורי מוח. בהתחשב בקלות של יישום כימיה חיסונית במעבדה, שימוש באמצעות אימונולוציטוכימיה עם סריקה ברזולוציה גבוהה-אינפרא-אדום יכול להרחיב את יכולת הנוירומדען לבחון תהליכים נוירויולוגיים ברמת מערכות.

Introduction

המחקר של מדעי המוח חששות חקירה של איך תאים במוח מתווך פונקציות ספציפיות¹. אלה יכולים להיות סלולריים בטבע כגון איך התאים גליה מעניקה חסינות במערכת העצבים המרכזית או יכול לכלול ניסויים שמטרתם להסביר כיצד הפעילות של נוירונים בהיפוקמפוס החלק המוביל לניווט מרחבי. במובן רחב, הפונקציה התאית נקבעת על ידי החלבונים המתבטאת בתא ואת הפעילות של חלבונים אלה². כתוצאה מכך, מדידת הביטוי ו/או הפעילות של חלבונים בתאי המוח הם קריטיים לחקר מדעי המוח.

מספר טכניקות זמינות כדי למדוד ביטוי חלבון במוח. אלה כוללים בשיטות vivo כגון טופוגרפיה פליטת פוזיטרונים עבור צפיפויות הקולטן³ ו מיקרו-דיאליזה עבור פפטידים קטנים⁴. בדרך כלל, שיטות vivo ex משמשות כדי לבחון את תפקוד החלבון ואת הביטוי. אלה כוללים טכניקות ספקטרומטר המסה⁵, כתם מערבי ושיטת חיסוני מקושרת באמצעות אנזימים (אליסה)⁶, ואימונוציטוטוכימיה⁷. אימונוציטוכימיה נמצאת בשימוש נרחב בתחום המדעי המוח. טכניקה זו כוללת את השימוש בנוגדן העיקרי כדי לזהות חלבון (או אנטיגן) של עניין (g., c-Fos) ו נוגדן משני מצותת כדי לזהות את החלבון-העיקרי נוגדן קומפלקס (איור 1). כדי לאפשר זיהוי של החלבון-העיקרי נוגדן מורכב נוגדן, נוגדנים משניים יש סוכנים אוקסיגון כגון חזרת peroxidase (HRP) מעלה באוב להם. הדבר מאפשר היווצרות מאיצים בתאים שניתן לאתרם באמצעות מיקרוסקופ אור⁷. נוגדנים משניים יכולים להיות גם כימיקלים זרוח עלה באוב אותם (כלומר, fluorophores). כאשר מגורה אלה כימיקלים פולטים אור, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות חלבון-ראשי נוגדן משני מכלולי נוגדנים⁷. לבסוף, לפעמים נוגדנים ראשוניים יש הפחתת סוכנים וכימיקלים פלואורסצנטית המצורפת אליהם ישירות לאשר את הצורך נוגדנים משניים⁷ (איור 1).

מעניין, הרבה שיטות אימונוציטוטוקכימיה לאפשר ויזואליזציה של חלבונים בתאי המוח, אבל לא את היכולת לכמת את כמות החלבון בתא מסוים או באזור המוח. שימוש במיקרוסקופיה קלה לאיתור מאיצים מתגובות הפחתת מאפשר ויזואליזציה של נוירונים ו גליה, אבל שיטה זו אינה יכולה לשמש לכמת ביטוי חלבון בתאים או באזור המוח מסוים. בתאוריה, מיקרוסקופ ניאון ניתן להשתמש בשביל זה, כי האור הנפלט הנוגדן משני פלורסנט הוא מדד של החלבון-העיקרי נוגדנים משני נוגדנים מורכבים. עם זאת, פלואורסצנטית אוטומטי ברקמת המוח יכול להקשות על השימוש מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי לכמת את הביטוי חלבון רקמת המוח⁸. כתוצאה מכך, אור הנפלט מתמונות פלורסנט של רקמת המוח משמש לעתים רחוקות כדי לכמת את הביטוי חלבון במוח.

רבים מהנושאים הללו ניתן לטפל באמצעות באמצעות אינפרא-אדום האימונוציטוכימיה בשילוב עם סריקה ברזולוציה גבוהה^9,10. במאמר זה, אנו מתארים כיצד משולבים כימיה חיסונית עם fluorophores בספקטרום הפליטה הקרוב-אינפרא אדום ניתן לשלב עם סריקה ברזולוציה גבוהה (g., 10 – 21 μm) כדי לקבל תמונות חדות המאפשרות כימות החלבון בנפרד אזורי המוח.

Protocol

הפרוטוקול הבא אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת דלאוור. גברים בחולדות מג בני 55-75 ימים שימשו לפרוטוקול זה.

1. מיצוי המוח והכנת רקמות

1. בחדר ההרדמה עד שחולדה כבר. לא מציגה תגובה לצביטה ברגל
2. להקריב חולדות באמצעות עריפת ראש מהירה באמצעות גיליוטינה.
3. חותכים את העור מאחורי הגולגולת לקדמי וברור מראש הגולגולת.
4. השתמש rongeurs להסיר בזהירות את החלק האחורי של הגולגולת, ולאחר מכן באמצעות מספריים מחתך קטן לחתוך את קו האמצע של הגולגולת, דוחף כלפי מעלה על החלק העליון של הגולגולת בכל עת כדי למנוע פגיעה רקמת המוח.
5. השתמש rongeurs לקלף מימין ומשמאל חצי גולגולת כדי לחשוף את המוח.
6. השתמשו במרית קטנה לסקופ תחת המוח והעצבים, העלה בזהירות את המוח והקפא את המוח באיזופנטאן צוננים על קרח יבש (לפחות 20 ° c). אחרי זה, לאחסן את המוח במקפיא של 80 ° c עד לחיתוך.
7. פורסים את המוח באזורי עניין ב-30-50 יקרומטר בקריוסטט שנשמר בין-9 ° c ו-12 ° c. הרכב באופן ישיר פרוסות על שקופיות זכוכית ולאחסן במקפיא של 80 ° c עד הזמן של שיטת כימיה חיסונית.
   הערה: בפרוטוקול זה המוח אזורים של עניין היו ההיפוקמפוס ואת האמיגדלה.

2. התגובה האימונוהיסטוכימיה היחידה

הערה: עבור תגובה אימונוהיסטוכימיה כפולה, הפרוטוקול הוא זהה התגובה החיסונית היחידה למעט התגובה הזו יש שני נוגדנים העיקרי של מארחים שונים (למשל, ארנב ועכבר) ושני נוגדנים משניים עבור המתאים המקדימות צריכה להיות מפונדקאי יחיד (למשל, אנטישפן עז וantimouse עיזים). גם הנוגדנים המשניים צריכים להיות משני ספקטרום שונה הזמינים בסורקים ברזולוציה גבוהה. לדוגמה, נוגדן משני אחד עם השיא ספקטרום פליטה ב 680 ננומטר ומשני נוגדן 800CW (הספקטרום פליטה שיא ב 780 ננומטר).

1. הסרת שקופיות זכוכית מן המקפיא ולאפשר שאיפה לטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
2. מתחת למכסה המנוע, לתקן רקמת המוח ב 4% פאראמפורמלדהיד ב 0.1 מ פוספט מתכלה באגירה (PBS) עבור 1 על 2 על הטמפרטורה בחדר.
3. לשטוף את השקופיות ב 0.1 מלוחים באגירה של M טריס (TBS) שלוש פעמים עבור 10 דקות כל אחד. ממברנות תאים מחלחלים על-ידי דגירה של שקופיות בתכשיר ניקוי קל (לדוגמה, 0.01% דטרגנטים) עבור 30-60 דקות.
4. לשטוף שקופיות ב-TBS שלוש פעמים עבור 15 דקות כל אחד.
5. לדלל את הנוגדן העיקרי עבור חלבון הריבית ב-PBS בריכוז הנכון. לדוגמה, כדי לזהות את הגן המיידי c-Fos מוקדם, להכין ארנב הראשי נגד c-Fos נוגדן בריכוז של 1:500.
6. הנוגדן הראשוני הפתרון העיקרי ישירות על רקמת המוח (כ 200 μL לכל 3 אינץ ' x 1 שקופית אינטש).
7. השתמש כיסוי כדי לדגירה את רקמת המוח על שקופיות זכוכית דילול הנוגדן העיקרי עבור או 1 על 2-h בטמפרטורת החדר או לילה (~ 17 h) ב 4 ° c.
8. הסר שמיכות ולשטוף שקופיות ב-TBS כי יש כמות קטנה של חומרי ניקוי שנוספו לו (למשל, 0.01% סבון, "TBS-T") ארבע פעמים עבור 15 דקות כל אחד.
9. השתמש כיסוי כדי דגירה סעיפים המוח בנוגדן משני בטמפרטורת החדר עבור 2 h.
   הערה: הנוגדן המשני צריך להיות לדילול הנכון בדילול המכיל TBS, אבקת כביסה, ו 1.5% של סרום מארח. לדוגמה, נוגדן משני עז בדילול של 1:2000 יכיל 1.5% סרום עז ו 0.05% כביסה.
10. לשטוף שקופיות ב-TBS-T ארבע פעמים עבור 20 דקות כל אחד, ולאחר מכן ב-TBS ארבע פעמים עבור 20 דקות כל אחד.
11. שקופיות יבשות בטמפרטורת החדר. בחשיכה, בן לילה כאשר השקופיות יבשות, הן מוכנות לדימות.

3. הדמיה

1. מניחים שקופיות על ממשק הסריקה הכמעט-אינפרא-אדום כאשר הרקמה פונה כלפי מטה. התמונה מחליקה זכוכית אחת או שקופיות מרובות בכל פעם באמצעות כלי בחירה.
2. שקופיות תמונה באמצעות הגדרת האיכות הגבוהה ביותר עם היסט של 0 ננומטר ורזולוציה של 21 μm. הסריקה בדרך כלל לוקח 13-19 h בהתאם לציוד הסריקה המשמש.
3. יבא תמונות לתוך תוכנת ניתוח התמונה (לדוגמה, ImageStudio) כדי להציג ולסמן עבור ניתוח חלבון חצי כמותי.

4. ניתוח ביטוי חלבון

1. פתח את תוכנת ניתוח התמונה ובחר באזור העבודה שאליו התמונה נסרקה.
2. פתחו את התמונה הסרוקה בתוכנת ניתוח התמונה כדי להציג את הסריקה, וכוונן אילו אורכי גל יוצגו, כמו גם את הניגודיות, הבהירות וההגדלה המוצגים מבלי לשנות את התמונה הגולמית או את הפליטה הכוללת.
3. זהה את אזורי המפתח עבור כימות ובחר את הכרטיסיה ניתוח לאורך החלק העליון של הדף ולאחר מכן בחר בצייר מלבן (או צייר אליפסה/צייר ביד חופשית) כדי לצייר מלבן מעל האזור שיוכמת.
4. כדי להציג את גודל המלבן, בחר צורות לאורך החלק השמאלי התחתון של המסך ולאחר מכן בחר בעמודות לאורך החלק התחתון הימני. הוספת עמודות גובה ורוחב כדי לזהות את גודל הצורה.
   הערה: חשוב לשלוט בגודל הצורה בהשוואת הקוונפיקציה. מומלץ להשתמש בצורות זהות ממוקמות בתוך מיקום הקוונפיקציה הרצוי, כדי לקבל דגימה מדויקת של פליטות עבור אזור זה.
5. לאחר מכן, ציין את שם הצורה וחזור על כך. לאחר שכל האזורים נדגמו, ניתן לצבור ולנתח את הנתונים הזמינים מהכרטיסיה עמודות .

תוצאות

לפני שימוש בסריקה ברזולוציה גבוהה עבור אימונוהיסטוכימיה, יש לוודא כי הפרוטוקול פועל. זה יכול להתבצע באמצעות בדיקת אימות שבו סעיפים המוח מאותו בעל חיים מודבטים עם נוגדנים הראשי והמשני, הנוגדן המשני בלבד, או לא העיקרי או נוגדן משני. תוצאות עבור שיטת אימות מסוג זה מוצגות

Discussion

התוצאות שהוצגו במאמר זה מראים כי קרוב-אינפרא-אדום אימונוציטוטוכימיה בשילוב עם סריקה ברזולוציה גבוהה ניתן להשתמש כדי לקבל אמצעים חצי כמותיים של ביטוי חלבון ברקמת המוח. זה יכול לשמש גם כדי לתייג שני חלבונים בו זמנית באותו אזור המוח. בעבר השתמשנו בשימוש קרוב-אינפרא אדום אימונוהיסטוכימיה כד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Extraction
Anesthesia Induction Chamber	Kent Scientific	VetFlo-0530SM
Kleine Guillotine	Harvard Apparatus	73-1920
Friedman Rongeur	Fine Science Tools	16000-14	used to remove back of skull
Delicate Dissecting Scissors	Fischer Scientific	08-951-5	used to cut upward along midline of skull
Micro Spatula	Fischer Scientific	21-401-5	used to scoop out brain
Glass Microscope Slides	Fischer Scientific	12-549-6
Immunohistochemical Reaction
Triton X-100			Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody
Tween-20			Used as a small amount of detergent added to TBS  to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody
Licor Odyssey scanner	Licor Biotechnology Inc.
Image Studio	Licor Biotechnology Inc.