העברה של הגידול מניפולציות הקשורים נויטרופילים לתוך הגידול עכברים נושאת ללמוד פוטנציאל אנגיוגנטי שלהם ב Vivo

Summary

כאן, אנו מראים פוטנציאל טיפולי של אנטי-אנגיוגנטי הקשורים לגידול נויטרופילים לאחר העברתו לתוך עכברים נושאת הגידול. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לתמרן את פעילות נויטרופילים לשעבר vivo וכתוצאה מכך להעריך את הפונקציונליות שלהם ב vivo בפיתוח גידולים. זהו מודל מתאים ללימודי חיסוני פוטנציאלי מבוססי נויטרופילים.

Abstract

התרומה של נויטרופילים לוויסות של tuמוריגנזה הוא מקבל תשומת לב מוגברת. תאים אלה הם הטרוגנית, ובהתאם לסביבה הגידול יכול להכיל pro-או אנטי גידול קיבולת. אחד של ציטוקינים חשוב הוויסות פונקציות נויטרופילים בהקשר הגידול הם סוג אני הפרעות. בנוכחות של הפרעות, נויטרופילים לצבור תכונות נגד הגידול, כולל הרעלת ציטוקיות או גירוי של המערכת החיסונית. לעומת זאת, העדר אינטרפרון איתות תוצאות בולטים פעילות הגידול, המאופיינת גירוי חזק של אנגיוגנזה הגידול. לאחרונה, אנו יכולים להדגים את התכונות pro-אנגיוגנטי של נויטרופילים תלוי בהפעלה של ניטינאמיד פוספוריבבויואז (NAMPT) איתות בתאים אלה. עיכוב של מסלול זה הקשורים הגידול נויטרופילים מוביל שלהם פנוטיפים חזקים אנטי-אנגיוגנטיים. כאן, אנו להדגים את המודל החדש שלנו מאפשר הערכה vivo של הפוטנציאל הטוריגניים של מניפולציות הגידול משויך נויטרופילים (שיזוף). בתוך זמן קצר, pro-אנגיוגנטי הקשורים הגידול נויטרופילים יכול להיות מבודד מן הגידול הנושאת אינטרפרון-לקויה עכברים ולאחר לתוך הפנטיפים אנטי-אנגיוגנטיים על ידי חסימת של איתות NAMPT. הפעילות האנגיוגנטית של תאים אלה ניתן להעריך לאחר מכן באמצעות שיטת הטבעת של אבי העורקים. השיזוף אנטי-אנגיוגנטי יכול להיות מועבר לתוך הגידול הנושאת מקבלי סוג פראי הגידול צריך להיות מנוטרים עבור 14 ימים. ביום 14 עכברים הם הוקרב, גידולים הוסרו לחתוך עם vascularization שלהם מוערך. בסך הכל, הפרוטוקול שלנו מספק כלי הרומן של vivo הערכת יכולת אנגיוגנטית של תאים ראשוניים, כגון משויך הגידול נויטרופילים, ללא צורך להשתמש במודלים של תאים מלאכותיים נויטרופילים קו. vc

Introduction

הפרעות סוג I (IFNs) לשחק תפקיד חשוב גירוי של תגובות המארחים neoplasias, כמו חוסר סוג אני IFNS איתות תוצאות בצמיחה הגידול מוגבר באופן משמעותי¹. אחד המנגנונים המעורבים בתהליך זה הוא הרגולציה של הפעילות הטומורגנית של הגידול, נויטרופילים הקשורים, אשר נשלט על ידי גורם המושבה מגרה 3 קולטן (CSF3R) במורד איתות². המושבה-גורם מגרה 3 (CSF3), או מושבת גרנבייט גורם מגרה, הוכח להפעיל איתות מעורבים פוספוליאמיד זרחן (nampt)^3,4. NAMPT הוא אנזים מגביל שיעור עבור הסינתזה של התיקון הניאודאמיד, אשר משפר את גליקולוליזיס ומווסת את תקן ה-DNA, ביטוי גנים, ותגובת מתח לקידום תאים סרטניים הישרדות והתפשטות⁵. NAMPT הוא מבוטא יתר על סוגי סרטן מרובים, כולל המעי הגס, השחלות, שד, קיבה, סרטן הערמונית gliomas⁶. NAMPT הוא חיוני לא רק עבור תאים סרטניים, אלא גם עבור מגוון רחב של סוגי תאים אחרים הנמצאים בגידולים, כגון תאים מיאלואיד-זה כוננים שלהם בידול⁴, מעכב אפופטוזיס ולעורר ביטוי של ציטוקינים מרובים או אנזימים משפילים מטריקס במקרופאגים⁷.

הגידול משויך נויטרופילים לייצג מאפטורים חשובים של צמיחת הגידול. פונקציות TAN תלויים מאוד הסוג I IFN זמינות, כמו אלה ציטוקינים הממשלה אנטי סרטניים הפעילות של נויטרופילים. להיפך, היעדר IFNs תומך בהפעלה הטוריגנית של תאים אלה, בעיקר תכונות pro-אנגיוגנטי שלהם. בהסכם עם זה, עכברים לקויה ב-ifns לפתח באופן משמעותי יותר ויותר גידולים vascularized אשר חדרו מאוד עם pro-tumoral/pro-אנגיוגנטי נויטרופילים^{1,2,8, 9,10}. חשוב מכך, כגון שיזוף pro-אנגיוגנטי להראות פעילות מוגבה של NAMPT, מציע את תפקידה העיקרי בפולריזציה הגידול פרו של נויטרופילים.

דלדול של נויטרופילים באמצעות נוגדן Ly6G או עיכוב של הגירה שלהם (CXCR2 נוגדן) תוצאות מופחת אנגיוגנזה הגידול, צמיחה, גרורות^1,8. עם זאת, נוגדנים חד-שבטיים שנוצרו הם חיסוני, והממשל שלהם משויך למגוון של תופעות לוואי סכנת חיים¹¹. טיפול עם מולקולות קטנות, כגון NAMPT מעכבי FK866, כי לווסת נויטרופילים tumorio, יכול לעזור כדי למנוע סיבוכים כאלה. למרבה הצער, עיכוב תרופתי מערכתית של NAMPT, ליד ההשפעה הטיפולית שלה על גידול הגידול, מוביל לתופעות לוואי חמורות כולל רעילות מערכת העיכול ו תרומבוציטופניה. לכן, יישום מערכתית של מעכבי nampt אינו אפשרי^12,13,14.

מסיבה זו, אנו מציעים כאן פרוטוקול בו הפעילות NAMPT חסומה ישירות בשיזוף מבודד. כגון אנטי הגידול נויטרופילים הם הועברו אז מאומצים לתוך מארח הנושאת גידול. פרוטוקול זה יסייע להימנע תופעות לוואי רעילות מערכתית של תרכובות, בעוד השפעתו על תאי היעד יהיה מתמשך.

Protocol

כל ההליכים הללו, כולל נושאי בעלי חיים, אושרו על-ידי רשויות הרגולציה: LANUV (לנדסברג הנאטור, האוולט וורוברצ'רשיץ NRW) ומרגראסנוביץ ' טיבינגן, גרמניה. כל מניפולציות יש לבצע בתנאים סטרילי (תחת כיסוי הזרם למינארי) באמצעות ריאגנטים סטרילי ומכשירים (מזרקים, מספריים, מלקחיים, מנתחים חד פעמיים, מנות פטרי).

הערה: הערכה הכוללת של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

1. הכנת קו תא מלנומה B16F10

1. להכין mycoplasma-תאים שליליים גדל 90% שוטפת conאולייר (כ 10 x 10⁶ תאים/T75 בקבוקון) ב-iscove השלם של מדיום שונה של החברה של האדם (imdmc: imdmc + 10% סרום שור עוברי (fbs) +1% פניצילין-סטרפטומיצין).
2. הסר את המדיום, ושטוף את התאים עם תמיסת מלח באגירה מפוספז (PBS). החלת 6 מ ל של פתרון התנתקות התא המכיל באנזימים פרוטאנחרדה וקולגן (לראות את הטבלה של חומרים), ו דגירה ב 37 ° c עבור 2 דקות.
3. להפיל את הבקבוקון בעדינות כדי להניע תאים חסיד שנותרו מלמטה. לאסוף את ההשעיה התא ב 15 שפופרות mL ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 7 דקות ו-20 ° c.
4. הסירו את הסופרנטאנט, והשהה מחדש. את הגלולה ב -1 מ ג של PBS הוסף 14 מ ל של PBS ו צנטריפוגה (300 x g ו 20 ° צ' עבור 7 דקות).
5. והשהה מחדש את הגלולה. ב-100 מ ג של PBS
6. לספור את התאים, ולהשעות אותם מחדש לריכוז של 3 x 10⁶/ml pbs (עבור השלב 2) או 6 x 10⁶/ml pbs (עבור השלב 6) להזרקה. לשמור על התאים בקרח למקסימום של 30 דקות.

2. מודל הגידול אלוגניים בעכברים

1. השתמש 10 נקבה Ifnar1^-/- עכברים בן 8-12 שבועות כי נשמרים תחת ספציפי-הפתוגן ללא-המחלה (SPF) תנאים.
   הערה: עכברים נקבה עדיפים במודל תת עורית של גידול הגידול, מאז הזכרים הם אגרסיביים יותר ולכן נוטה פרות של אתר הגידול, אשר משפיע על צמיחת הגידול.
2. לגלח את העור של העכבר על הצלע עם מכונת גילוח חשמלית, ולחטא את העור עם רקמה רטובה עם 70% אתנול.
3. לאסוף את תאי מלנומה B16F10 מוכן בריכוז של 3 x 10⁶/mL PBS (לראות את השלב 1) ב 1 מזרק mL ו-0.4 x 19 מ"מ מחט. הכנס 100 mL של תת-עורי ההשעיה.
   1. מערבבים היטב את התאים לפני כל זריקה. השימוש מחטים לא פחות מ 0.4 מ"מ בקוטר לא להפריע תאים סרטניים.
4. מקום עד 5 עכברים בכלוב אחד, ושליטה גודל הגידול (אורך, רוחב ועומק) עם קליבר עבור 14 ימים.
   הערה: על פי תקנות בעלי חיים, גודל הגידול לא יעלה על 15 מ"מ קוטר, עכברים עם גידולים גדולים או נמק/פתוח יש להקריב מראש.
5. ביום 14, להקריב את העכברים בחדר שיתוף₂ .
6. לחטא את העור עם 70% אתנול ולהסיר גידולים עם מספריים ומלקחיים בצלחת פטרי סטרילית. לשמור על גידולים בצינור 50 mL ב-בינונית מלאה של הנשר שונה של Dulbecco (DMEMc: DMEMC + 10% FBS + 1% פניצילין-סטרפטומיצין) על הקרח.

3. בידוד שיזוף

1. מקום גידולים לתוך סטרילי 6-צלחות, 5 גידולים לכל טוב. חותכים גידולים לחתיכות 2-3 מ"מ עם מספריים סטרילית.
   1. לעכל עם 1 מ ל של dispase/קולגיאז D/DNase אני פתרון (0.2 mg/0.3 mg/100 מ"ג ב 1 מ ל של Dnase) לכל גידול. מודטה ב 37 ° c, 5% CO₂ בחממה לח, ולערבב עם מזרק 10 מ ל ללא מחט כל 15 דקות 3 פעמים.
2. כדי להסיר סיבים לא מעוילים, שינוי תאים באמצעות 100 יקרומטר מסננים לתוך 15 שפופרות mL (אחד טוב לכל מסנן לכל שפופרת). הוסף PBS ל 15 מ"ל, צינורות צנטריפוגה ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את הסופרנטאנט.
3. Lyse אריתרופוציטים עם מאגר פירוק (NH₄Cl 150 MM, khco₃ 10 מ"מ, Edta 0.1 mm, PH 7.3, 20 ° c) על ידי הוספת 1 mL לתוך כל צינור. מערבבים היטב, ולשלב את הפתרון מכל הצינורות לתוך אחד. להפסיק את התגובה לאחר 2 דקות עם 11 מ ל של קרח קר (4 ° c) DMEMc.
4. צנטריפוגה ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה עם 15 מ ל של הקור PBS. צנטריפוגה ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את הסופרנטאנט.
5. השהה את הגלולה ב-1 מ ל של PBS. הוסף 3 מ ל של נוגדנים לחסום Fc (CD16/CD32, מלאי 0.5 mg/mL), ו-דגירה על הקרח עבור 15 דקות.
6. הוסף נוגדנים: 10 מ ל של Ly6G-PE (מניות 0.2 mg/mL) ו-10 מ ל של CD11b-APC (מניות 0.2 mg/mL). הוסף 20 מ ל של 6-Diamidin-2-פניללינדול לצבוע (DAPI, מלאי 5 מ"ג/mL) ו דגירה על הקרח בחשיכה עבור 30 דקות.
   הערה: ניתן להשתמש בשילוב נוסף של צבעי הכדאיות ושל השערים הפלואורסצנטית של נוגדנים.
7. הוסף את ה-PBS עד 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את הסופרנטאנט.
8. השהה מחדש את הגלולה ב-DMEMc לריכוז כ-10 x 10⁶/mL, ושמור על קרח.
9. מיין CD11b⁺ Ly6G^hi בחיים (dapi-שלילי) נויטרופילים עם סדרן התא עם הפעלה פלואורסצנטית (לאחר אסטרטגיה לראות איור 2).
   הערה: שמור את השפופרת עם השעיית תא וצינור עם DMEMc עבור תאים ממוינים ב 4 ° c. השתמש בהגדרות מיון אופטימליות הבאות: זרבובית 70 מ"מ, שיעור סף של 22,000 מקסימלית אירועים/שנייה וקצב זרימה של 1-3.
10. בדוק את הטוהר של נויטרופילים מיון באמצעות cytometer לטוהר מומלץ של > 95%.
11. צנטריפוגה מיון נויטרופילים ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את supernatant. השהה מחדש את התאים הממוינים ב-DMEMc לריכוז של 1 x 10⁶/Ml.
    הערה: המספר הצפוי של נויטרופילים בגידול 1 14 יום B16F10 (בקוטר 10 מ"מ) הוא כ 3 x 10⁴ תאים.

4. עיכוב NAMPT ב השיזוף בחוץ

1. הכנת FK866 (מעכב NAMPT) מניות ב dimethylsulfoxide (DMSO) בריכוז הסופי של 100 מ"מ.
2. זרע מיון נויטרופילים (שלב 3.11) לתוך 2 בארות של הצלחת 96-באר U-התחתון (1.5 x 10⁵ נויטרופילים/גם). הוסף FK866 לתוך התערבות היטב (הריכוז הסופי של 100 ננומטר), וכמות שווה של DMEMc עם DMSO לתוך השליטה היטב. דגירה עבור 2 h ב 37 ° צ', 5% CO₂ בחממה לח.
3. צנטריפוגה ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את הסופרנטאנט. השהה מחדש ב-200 mL של PBS בכל באר. חזור פעמיים.
4. צנטריפוגה ב 460 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות, ולהסיר את הסופרנטאנט. השהה מחדש בינונית צמיחה של תא מסחרי בינוני (בתוספת עם 4 μL/mL מוסף צמיחה של תאים, 0.1 ng/mL האדם גורם גידול באפידרמיס, 1 ng/mL רקומביננטי גורם הצמיחה פיברופיצוץ בסיסי, 90 μg/mL ו-1 μg/mL הידרוקורטיזון) לריכוז הסופי של 0.2 x 10⁶ תאים/ml (ב 0.75 mL) (עבור שלב 5) או ב-PBS לריכוז הסופי של 0.6 x 10⁶ תאים/mL (בשנת 0.25 mL) (עבור שלב 6).

5. הערכת תכונות אנגיוגנטי של היזוף באמצעות שיטת הטבעת של אבי העורקים

1. לנתח את העורקים הבית החזה מן העכבר זכר C57BL/6J (WT). נקי לחתוך לתוך טבעות רוחב 0.5 מ"מ. הניחו את כל הטבעות בבאר של צלחת של 24 מיל עם 1 מ ל של מדיום צמיחה של תא שיושלם. מודטה לילה ב 37 ° c, 5% CO₂ בחממה לח.
   הערה: השימוש של צעירים (צעיר מ 8 שבועות) עכברים זכר לניתוח העורקים עדיף, שכן הם נותנים תגובה אנגיוגנטית חזקה יותר¹⁵.
2. למלא את הבארות של 96-ובכן שטוח למטה צלחת עם 50 μL של מטריצה מרתף מסיסות במרתף, תן את הג להגדיר 30 דקות ב 37 ° צ', 5% CO₂ חממה לחות כדי לאפשר מטריקס כדי פולימלזציה. הכינו לפחות 3 בארות לכל תנאי.
3. להטביע את הטבעות בתוך מטריצת מרתף ממברנה מסיסות על ידי הצבת טבעת אבי העורקים על החלק העליון של שכבת מטריצה מוצק, 1 טבעת במרכז של כל טוב. הוסף עוד 50 μL של מטריצת קרום מרתף מסיסות כדי לכסות כל טבעת.
   1. מניחים את הצלחת ב 37 ° c, 5 % החממה לחות עבור 30 דקות נוספות כדי לאפשר את הפילמור של שכבת המטריצה השנייה.
4. הוסף 150 mL/ובכן של שיושלם בינוני הצמיחה התאים בינונית ו-2x10⁴Ifnar1^-/- השיזוף (שליטה FK866 מטופלים) (שלב 4.4).
5. מודקת את הצלחת 14 ימים ב 37 ° c, 5% CO₂ בחממה לח.
6. תמונה בעזרת מיקרוסקופ רגיל משלב הפאזה ומעריכים את הסתעפות האנדותל. הערכה כמותית של כלי ממורמטרי ופרמטרים מרחביים כולל אינדקס הסתעפות ניתן לבצע באופן אוטומטי באמצעות תוכנית עיבוד תמונה המיועדת תמונות מדעיות.
   הערה: תוצאות הנציגים מתוארות באיור 3.

6. העברה המאמצת של מטופלים נויטרופילים במודל הגידול allogenic

1. להכין תאים B16F10 מלנומה (שלב 1.6) ב PBS בריכוז של 6 x 10⁶ תאים/mL.
2. להכין 2 סוגים של נויטרופילים: FK866-מטופלים נויטרופילים ובקרת נויטרופילים מטופל (שלב 4.4) ב PBS בריכוז 6 x 10⁵ תאים/mL. מערבבים נויטרופילים עם תאים B16F10 מלנומה (הסופי נויטרופילים לתאים סרטניים יחס 1:10) יש 2 סוגים של תערובות תאים.
3. קח 10 עכברים הנקבה WT 8-12 בן שבועות, 5 בכל קבוצה. לגלח את העור על הצלע עם מכונת גילוח חשמלית, ולחטא עם 70% אתנול.
4. הכנס 100 μL של השעיית התא (שלב 6.2) תת-עורי עם מזרק אינסולין ו מחט קוטר 0.4 מ"מ, לשתי קבוצות של עכברים. מניחים 1-5 עכברים מאותה קבוצה בכלוב אחד.
5. ביום 2, להכין 2 סוגים של נויטרופילים: FK866-מטופלים נויטרופילים ובקרת נויטרופילים מטופל (שלב 4.4) ב PBS בריכוז 6 x 10⁵ תאים/mL. הכנס 100 μL של השעיית תא (שלב 6.4) עירוי לווריד הזנב עם מזרק אינסולין ומחט קוטר 0.4 מ"מ, לשתי קבוצות של עכברים. מניחים עכברים בחזרה לכלוב.

7. גידול במדידה הצמיחה, בדיקה היסטולוגית

1. נטר צמיחת גידול. בכל יום אחר להעריך את גודל הגידול עם קליפרס ולחשב את נפח הגידול עם הנוסחה V = 4/3 * π * (h * w²)/8 (h = גובה, w = רוחב, עומק = רוחב).
2. להקריב עכברים ביום 14 בחדר CO₂ . להסיר גידולים ולמדוד את משקולות הגידול.
3. הקפאת גידולים בתרכובת מיטבית לחיתוך טמפרטורה בחנקן נוזלי, וחנות at-80 ° c.
4. הפשרת דגימות ל-20 ° c והכינו סעיפים של 5 מ"מ באמצעות קריוטומה. תנו להקפאה להתייבש. במשך 30 דקות ב -20 ° c לתקן את הסעיפים ב-20 ° c באצטון קר עבור 2 דקות ולתת להם להתייבש 30 דקות ב 20 ° c.
5. בלוק עם נוגדנים בבלוק Fc (CD16/CD32, מלאי 0.5 mg/mL 1:500) ב PBS עבור 1 h ב 20 ° c.
6. כתם עם ארנב נגד העכבר מלבלב נוגדן גמא (1:1500 ב PBS, 200 μL) עבור 1 h ב 20 ° c. . שטוף עם הPBS 3 פעמים
7. כתם עם משני עז אנטי הארנב נוגדן (מניות 0.5 mg/mL, 1:400 ב PBS,), נגד עכבר αSMA (1:500 ב-PBS) ו 2 μL של DAPI (מלאי 5 מ"ג/mL, 1:100 ב-PBS) בנפח הסופי של 200 μL של פתרון נוגדן. מודלת ב-20 ° c בחשיכה. . שטוף עם הPBS 3 פעמים
8. שקופיות יבשות למשך 20 דקות ב -20 ° c בחשיכה. הר עם בינוני הרכבה הידרולי עבור מיקרוסקופ וכיסוי עם שמיכות. הרשו לו להתייבש. ב-37 מעלות צלזיוס
9. בצע בדיקה מיקרוסופית. לכמת את הvascularization על ידי ספירת המספר הכולל (באופן אופציונלי) של מלמינציה⁺ כלי קיבול ואת המספר (שטח) של SMA⁺ כלי מפותח.
   הערה: כדי לבצע ניתוח תמונה, בצע את כל התמונות תחת אותם תנאים (אור, ניגודיות, הגדלה). במקרה זה, פרמטרי עיבוד הם קבועים, עיבוד תמונה הופך אוטומטי לחלוטין. תוצאות הנציגה מתוארות באיור 4 ובאיור 5.

תוצאות

באמצעות ההליך המתואר כאן, Ifnar1^-/- נויטרופילים היו מבודדים גידולים וטופלו עם מעכבי nampt FK866 עבור 2 h. Ifnar1 לא מטופל ^-/- נויטרופילים שימשו כפקד. את האפקטיביות של הטיפול הוערך באמצעות שיטת הטבעת אבי העורקים, אשר משקף את השלבים העיקריים המעורבים אנגיוגנזה (השפ?...

Discussion

למרות ההתקדמות בטיפול כירורגי ותרופתי בסרטן, טיפול מוצלח נשאר אתגר. מאז התאים החיסוניים ידועים לשחק תפקיד חשוב בוויסות צמיחת הגידול, שיטות הרומן מעכב tuמגנגניות של תאים כאלה יש להקים. כאן אנו מדגימים גישה הרומן לדכא את צמיחת הגידול באמצעות העברה המאמצת של אנטי-אנגיוגנטי הגידול משויך נויטר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml tubes	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	62,554,502
50 ml tubes	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany	227261
5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany	6006180 / 607180 / 760180
6 well flat-bottom cell culture plates	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	833,920
96 well flat-bottom cell culture plates	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany	655180
96 well U-bottom cell culture plates	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany	65018
AMG EVOS fl digital inverted microscope	AMG, Bothel, U.S.
anti-mouse CD11b	BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.	553312	clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL
anti-mouse Ly6G	BioLegend, California, U.S.	127608	clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL
BD FACS AriaII	BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.		cell sorter
Caliper	Vogel Germany, Kevelaer, Germany
Casy cell counter	Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany
Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters	Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany	04-004-2327 / 04-004-2328
Centrifuge Rotina 420 R	Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany	4706
Collagenase D	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany	11088858001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	BioLegend, California, U.S.	422801	Stock: 5mg/ml
Dispase I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany	D4818-2MG
DMEM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.	41966-029	DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
DMSO (Dimethylsufoxide)	WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany	WAK-DMSO-10	CryoSure-DMSO
DNase I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany	DN25-100MG
DPBS	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.	14190-094
Endothelial cell growth medium	PromoCell, Heidelberg, Germany	c-22010
FBS (Fetal Bovine Serum)	Biochrom, Berlin, Germany	S0115
Fc-block (Anti-mouse CD16/32)	BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.	553142	clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL
FK 866 hydrochloride	Axon Medchem, Groningen, Netherlands	Axon 1546	Stock: 100 mM
Goat Anti-Rabbit IgG H&L	Abcam, Cambridge, U.K.	ab97075	Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL
Heracell 240i CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.	51026334
IMDM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.	12440-053	IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
Isis GT420 shaver	B. Braun Asculap, Suhl, Germany	90200714
Matrigel Matrix basement membrane	Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands	7205011
Microtome Cryostat Microm HM 505 N	Microm International GmbH, Walldorf, Germany
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany	F3777	FITC-conjugated, no information about stock concentration
Needles 0.4 mm x 16 mm	BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.	302200
Neomount	Merck, Darmstadt, Germany	HX67590916
Normal goat serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S.	005-000-121
Penicillin Streptomycin	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.	15140-122
Pipetus automatic pipette	Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany	9907200
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.	P36935
rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain	Immundiagnostik, Bensheim, Germany	AP1001.1	No information about stock concentration
StemPro Accutase	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.	A1105-01
Sterile disposal scalpel (no. 15)	MedWare, Naples, U.S.	120920
Syringes 1 ml	BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.	303172
Syringes 10 ml	BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.	309110
T75 sterile cell culture flasks	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany	833,911,302
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Torrance, U.S.	4583
Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany