JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы показываем терапевтический потенциал антиангиогенных опухолевых нейтрофилов после их передачи в опухолевых мышей. Этот протокол может быть использован для манипулирования активностью нейтрофилов ex vivo и для последующей оценки их функциональности in vivo при разработке опухолей. Это подходящая модель для изучения потенциальных иммунотерапии на основе нейтрофилов.

Аннотация

Вклад нейтрофилов в регуляцию опухолевого генеза становится все более внимания. Эти клетки неоднородны, и в зависимости от среды опухоли может обладать про- или противоопухолевой способности. Одним из важных цитокинов, регулирующих функции нейтрофилов в опухолевом контексте, являются интерфероны i типа. При наличии интерферонов нейтрофилы приобретают противоопухолевые свойства, в том числе цитотоксичность или стимуляцию иммунной системы. И наоборот, отсутствие интерферона сигнализации приводит к заметной проопухолевой активности, характеризующейся сильной стимуляцией опухолевого ангиогенеза. Недавно мы могли бы продемонстрировать, что проангиогенные свойства нейтрофилов зависят от активации никотинамидаф фосфорибозилтрансферазы (NAMPT) сигнальный путь в этих клетках. Ингибирование этого пути у опухолевых нейтрофилов приводит к их мощному антиангиогенного фенотипу. Здесь мы демонстрируем нашу недавно созданную модель, позволяющую in vivo оценивать опухолевый потенциал манипулируемых опухолевых нейтрофилов (TANs). Вскоре, про-ангиогенных опухолевых опухолей связанных нейтрофилов могут быть изолированы от опухолевых интерферон-дефицит мышей и повторно поляризованы в анти-ангиогенный фенотип путем блокирования NAMPT сигнализации. Ангиогенная активность этих клеток может быть впоследствии оценена с помощью аортического кольца. Антиангиогенные TANs могут быть переданы в опухолевых диких получателей типа и рост опухоли должны контролироваться в течение 14 дней. На день 14 мышей приносятся в жертву, опухоли удаляются и разрезаются с их васкуляризацией. В целом, наш протокол предоставляет новый инструмент для in vivo оценки ангиогенной способности первичных клеток, таких как опухолевые нейтрофилы, без необходимости использования искусственных моделей линии нейтрофилов. Vc

Введение

Интерфероны типа I (IFNs) играют важную роль в стимуляции реакции хозяев на неоплазию, так какотсутствие сигнализации типа I IFN приводит к значительно повышенному росту опухоли 1. Одним из механизмов, участвующих в этом процессе является регуляция опухолевой активности опухолевых нейтрофилов, которая контролируется колони-стимулирующим фактором 3-го рецептора (CSF3R) вниз по течению сигнализации2. Колония-стимулирующий фактор 3 (CSF3), или гранулоцит колонии стимулирующий фактор, было показано, чтобы активировать сигнализации с участием никотинамида фосфорибозилтрансферазы (NAMPT)3,4. NAMPT является ограничение скорости ферментдля никотинамидад аденин динуклеотид синтез, который повышает гликолиза и регулирует ремонт ДНК, экспрессия генов, и стресс ответ содействия выживанию раковых клеток и пролиферации5. NAMPT является overexpressed в нескольких типах рака, в том числе колоректального, яичников, молочной железы, желудка, рака предстательной железы и глиомы6. NAMPT имеет важное значение не только для опухолевых клеток, но и для широкого спектра других типов клеток, которые присутствуют в опухолях, таких как миелоидные клетки - это диски их дифференциации4, ингибирует апоптоз и стимулирует выражение нескольких цитокинов или матричных деградирующих ферментов у макрофагов7.

Связанные с опухолями нейтрофилы представляют собой важные модуляторы роста опухоли. Функции TAN сильно зависят от типа I IFN доступности, так как эти цитокины премьер противоопухолевой активности нейтрофилов. Напротив, отсутствие IFNs поддерживает опухолевую активацию этих клеток, особенно их проангиогенные свойства. В согласии с этим, мыши, дефицит которых в IFNs развиваются значительно больше и лучше васкуляризированных опухолей, которые сильно проникли с про-опухолевых / про-ангиогенных нейтрофилов1,2,8, 9,10. Важно отметить, что такие проангиогенные TANs показывают повышенную активность NAMPT, предлагая свою существенную роль в про-опухолевой поляризации нейтрофилов.

Истощение нейтрофилов с использованием антител Ly6G или ингибирование их миграции (CXCR2 антитела) приводит к снижению ангиогенеза опухоли, роста и метастазов1,8. Тем не менее, генерируемые моноклональные антитела иммуногенны, а их введение связано с целым рядом опасных для жизни побочных эффектов11. Лечение с помощью небольших молекул, таких как ингибитор NAMPT FK866, который модулирует нейтрофил опухолевого генетики, может помочь избежать таких осложнений. К сожалению, фармакологическое системное ингибирование NAMPT, рядом с его терапевтическим воздействием на рост опухоли, приводит к тяжелым побочным эффектам, включая желудочно-кишечную токсичность и тромбоцитопению. Таким образом, системное применение ингибиторов NAMPT не представляется возможным12,13,14.

По этой причине мы предлагаем здесь протокол, в котором деятельность NAMPT блокируется непосредственно в изолированных TANs. Такие противоопухолевые нейтрофилы затем приемные передаются в опухолевый хозяин. Этот протокол поможет избежать системных токсических побочных эффектов соединений, в то время как его влияние на клетки-мишени будет устойчивым.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры, в том числе и животные, были одобрены регулирующими органами: LANUV (Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW) и Regierungspr'sidium Тюбинген, Германия. Все манипуляции следует проводить в стерильных условиях (под ламинарным капотом) с использованием стерильных реагентов и инструментов (шприцы, ножницы, щипцы, одноразовые скальпели, блюда Петри).

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая схема протокола отображается на рисунке 1.

1. Подготовка линии клеток меланомы B16F10

  1. Подготовка mycoplasma-отрицательных клеток, выращенных до 90% конфлюентного монослойного (примерно 10 х 106 клеток / T75 колба) в полном Iscove в модифицированных Dulbecco в среднем (IMDMc: IMDM 10% плода сыворотки крупного рогатого скота (FBS) 1% пенициллин-стрептомицин).
  2. Удалить среду, и промыть клетки с фосфатами буферного сольятого раствора (PBS). Нанесите 6 мл раствора отслоения клеток, содержащего протеолитические и коллагенолитические ферменты (см. таблицуматериалов), и инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 2 мин.
  3. Стучите колбу осторожно, чтобы мобилизовать оставшиеся клетки адепта снизу. Соберите клеточную подвеску в трубках 15 мл и центрифугу при 300 х г в течение 7 мин и 20 градусов по Цельсию.
  4. Удалите супернатант, и повторно гранулы хорошо в 1 мл PBS. Добавьте 14 мл PBS и центрифуги (300 х г и 20 градусов по Цельсию в течение 7 мин).
  5. Удалите супернатант и resuspend гранулы в 1 мл PBS.
  6. Подсчитайте клетки, и повторно их концентрации 3 х 106/мл PBS (для шага 2) или 6 х 106/мл PBS (для шага 6) для инъекции. Держите клетки на льду максимум 30 мин.

2. Аллогенная модель опухоли у мышей

  1. Используйте 10 самок Ifnar1-/- мышей 8-12 недель, которые хранятся в специфических патогенных условиях (SPF).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши женского пола предпочтительнее в подкожной модели роста опухоли, так как мужчины более агрессивны и, таким образом, склонны к нарушениям опухолевого участка, который влияет на рост опухоли.
  2. Бритькожу мыши на фланге с помощью электрической бритвы и дезинфицировать кожу тканью, влажной с 70% этанолом.
  3. Соберите подготовленные клетки меланомы B16F10 в концентрации 3 х 106/мл PBS (см. шаг 1) в шприц 1 мл и 0,4 х 19 мм иглы. Впрысните 100 мл подвески подкожно.
    1. Смешайте клетки задолго до каждой инъекции. Используйте иглы диаметром не менее 0,4 мм, чтобы не беспокоить опухолевые клетки.
  4. Поместите до 5 мышей в одну клетку и контролируйте размер опухоли (длина, ширина и глубина) с помощью калипера в течение 14 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно правилам животных, размер опухоли не должен превышать 15 мм в диаметре, мышей с большими или некротические / открытые опухоли должны быть принесены в жертву заранее.
  5. На 14-й день жертвуйте мышами в камере CO 2.
  6. Дезинфекция кожи с 70% этанола и удалить опухоли с ножницами и щипками в стерильной чашке Петри. Храните опухоли в трубке 50 мл в полной модифицированной орел Медиум Dulbecco (DMEMc: DMEM 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина) на льду.

3. Изоляция TAN

  1. Поместите опухоли в стерильные 6-колодные пластины, 5 опухолей на скважину. Вырезать опухоли на 2-3 мм кусочки стерильными ножницами.
    1. Дайджест с 1 мл диспаса / коллагеназа D/DNase I раствор (0,2 мг/ 0,2 мг/100 мг в 1 мл DMEMc) на опухоль. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 во влажном инкубаторе, и смешать с 10 мл шприца без иглы каждые 15 минут 3 раза.
  2. Чтобы удалить непереваренные волокна, сетка клетки через 100 мкм фильтры в 15 мл труб (один хорошо на фильтр на трубку). Добавьте PBS до 15 мл, центрифуги труб на 460 х г, 4 КК в течение 5 минут, и удалить супернатант.
  3. Лизе эритроциты с буфером лизиса (NH4Cl 150 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 0.1 mM, pH 7.3, 20 c) путем добавления 1 мл в каждую трубку. Хорошо перемешать и объединить раствор из всех трубв в одну. Остановите реакцию через 2 минуты с 11 мл ледяного (4 кВ) DMEMc.
  4. Центрифуга при 460 х г,4 кв кв 5 мин, и удалить супернатант. Отрежь гранулы с 15 мл холодного PBS. Центрифуга при 460 х г,4 кв кв 5 мин, и удалить супернатант.
  5. Приостановите гранулы в 1 мл PBS. Добавьте 3 мл антител Fc-block (CD16/CD32, бульон 0,5 мг/мл) и инкубируйте на льду 15 мин.
  6. Добавить антитела: 10 мл Ly6G-PE (запас 0,2 мг/мл) и 10 мл CD11b-APC (запас 0,2 мг/мл). Добавьте 20 мл 6-диамидина-2-фенилолдола viability красителя (DAPI, бульон 5 мг/мл) и инкубировать на льду в темноте в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Еще одна комбинация жизнеспособности красителей и флуоресцентных конъюгатов антител могут быть использованы.
  7. Добавьте PBS до 15 мл, центрифугу при 460 х г, 4 кв. м в течение 5 мин, и удалите супернатант.
  8. Приостановите гранулы в DMEMc до концентрации примерно 10 х 106/мл, и держать на льду.
  9. Сортировать CD11b- Ly6Gпривет жив (DAPI-отрицательный) нейтрофилов с флуоресценции активированных сортировки клеток (стратегия см. Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите трубку с клеточной подвеской и трубку с DMEMc для отсортированных клеток при 4 градусах Цельсия. Используйте следующие оптимальные настройки сортировки: 70-мм сопло, пороговая скорость максимальных 22 000 событий в секунду и скорость потока 1-3.
  10. Проверьте чистоту отсортированных нейтрофилов с помощью цитометра для рекомендуемой чистоты в размере 95%.
  11. Центрифуга отсортированы нейтрофилы на 460 х г, 4 кв кв в течение 5 мин, и удалить супернатант. Отрежь отсортированные клетки в DMEMc до концентрации 1 х 106/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемое количество нейтрофилов в одной 14-дневной опухоли B16F10 (диаметр 10 мм) составляет примерно 3 х 104 клетки.

4. Ингибирование NAMPT в TANs in vitro

  1. Подготовка fK866 (ингибитор NAMPT) в диметилсульфокид (DMSO) при конечной концентрации 100 мМ.
  2. Семена отсортированы нейтрофилы (шаг 3,11) в 2 скважины 96-хорошо U-дно пластины (1,5 х 105 нейтрофилов / хорошо). Добавить FK866 в интервенции хорошо (окончательная концентрация 100 нм), и равное количество DMEMc с DMSO в контроль хорошо. Инкубировать 2 ч при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 во влажном инкубаторе.
  3. Центрифуга при 460 х г,4 кв кв 5 мин, и удалить супернатант. Resuspend в 200 мл PBS в каждой скважине. Повторите 2 раза.
  4. Центрифуга при 460 х г,4 кв кв 5 мин, и удалить супернатант. Resuspend в коммерческих эндотелиальных клеток среды роста (дополнено 4 Л /мЛ эндотелиальной добавки роста клеток, 0,1 нг/мл рекомбинантный фактор эпидермального роста человека, 1 нг/мл рекомбинантных основных факторов роста фибробластов человека, 90 мкг/мл гепарин и 1 мкг/мл гидрокортизон) до конечной концентрации 0,2 х 106 клеток/мл (в 0,75 мл) (для шага 5) или в PBS до конечной концентрации 0,6 х 106 клеток/мл (в 0,25 мл) (для шага 6).

5. Оценка ангиогенных свойств TANs с использованием аортического кольца

  1. Вскрыть грудной аорты от мужского Пола C57BL/6J (WT) мыши. Очистите и нарежьте кольца шириной 0,5 мм. Поместите все кольца в колодец 24-хорошо пластины с 1 мл дополненной эндотелиальной среды роста клеток. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 во влажном инкубаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование молодых (младше 8 недель) мышей мужского пола для вскрытия аорты предпочтительнее, так как они дают более надежный ангиогенный ответ15.
  2. Заполните скважины 96-хорошо плоской нижней пластины с 50 л растворило подвалм мембранной матрицы, пусть гель набор в течение 30 минут в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 влажный инкубатор, чтобы матрица полимеризации. Подготовьте не менее 3 скважин на состояние.
  3. Вложите кольца в растворимый подвал мембранной матрицы, поместив аортального кольца на верхней части твердого слоя матрицы, 1 кольцо в центре каждого колодца. Добавьте еще 50 л растворитой мембранной матрицы подвала, чтобы покрыть каждое кольцо.
    1. Поместите пластину в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 влажный инкубатор еще на 30 минут, чтобы полимеризация второго слоя матрицы.
  4. Добавьте 150 мл/ну дополненной эндотелиальной среды роста клеток и 2x104Ifnar1-/- TANs (контроль и FK866-обработанный) (шаг 4.4).
  5. Инкубировать тарелку в течение 14 дней при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 во влажном инкубаторе.
  6. Изображение с помощью стандартного фазово-контрастного микроскопа и оценки эндотелиального ветвления. Количественная оценка морфометрических и пространственных параметров сосуда, включая ветвящий индекс, может быть выполнена автоматически с помощью программы обработки изображений, предназначенной для научных изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты представительи изображены на рисунке 3.

6. Приемная передача обработанных нейтрофилов в аллогенной модели опухоли

  1. Подготовка B16F10 клетки меланомы (шаг 1.6) в PBS в концентрации 6 х 106 клеток / мл.
  2. Подготовьте 2 типа нейтрофилов: FK866-обработанные нейтрофилы и контролируйте необработанные нейтрофилы (шаг 4.4) в PBS при концентрации 6 х 105 клеток/мл. Смешайте нейтрофилы с клетками меланомы B16F10 (окончательное отношение нейтрофилов к опухолевым клеткам 1:10), чтобы иметь 2 типа клеточных смесей.
  3. Возьмите 10 самок wT мышей 8-12 недель, 5 в каждой группе. Побрить кожу на фланге с электрической бритвой, и дезинфицировать с 70% этанола.
  4. Вводят обеим группам мышей 100 л клеточной суспензии (шаг 6.2) с инсулиновым шприцем и иглой диаметром 0,4 мм. Поместите 1-5 мышей из одной группы в одну клетку.
  5. На второй день подготовьте 2 типа нейтрофилов: FK866-обработанные нейтрофилы и контролируйте необработанные нейтрофилы (шаг 4.4) в PBS при концентрации 6 х 105 клеток/мл. Впрысните 100 кЛ клеточной суспензии (шаг 6.4) т.е. в хвостовую вену с инсулиновым шприцем и иглой диаметром 0,4 мм, обеим группам мышей. Поместите мышей обратно в клетку.

7. Измерение роста опухоли, гистологическое обследование

  1. Мониторинг роста опухоли через день. Оцените размер опухоли с помощью калиперов и вычислите объем опухоли с помощью формулы V'4/3 "(h'w2)/8 (высота, ширина, ширина глубины).
  2. Пожертвование мышей в день 14 в камере CO 2. Удалить опухоли и измерить вес опухоли.
  3. Заморозить опухоли в оптимальном температурном соединении в жидком азоте, и хранить при -80 градусов по Цельсию.
  4. Оттапьте образцы до -20 градусов и подготовить 5 мм разделов с помощью криотоме. Дайте криокутам высохнуть в течение 30 мин при 20 градусах Цельсия. Исправьте секции в -20 градусов холодный ацетон в течение 2 мин и дайте им высохнуть в течение 30 мин при 20 градусах Цельсия.
  5. Блок с антителами Fc-блока (CD16/CD32, шток 0.5 мг/мл 1:500) в PBS для 1 ч при 20 c.
  6. Пятно с кроликом анти-мышь Laminin гамма антитела (1:1500 в PBS, 200 qL) для 1 ч при 20 градусов по Цельсию. Вымойте pbS три раза.
  7. Пятно со вторичным козьим антикливочным антителом (запас 0,5 мг/мл, 1:400 в PBS,), анти-мышь ЗСМА (1:500 в PBS) и 2 Зл DAPI (запас 5 мг/мл, 1:100 в PBS) в окончательном объеме 200 зл. антитела раствора. Инкубировать в течение 1 ч при 20 градусах по Цельсию в темноте. Вымойте pbS три раза.
  8. Сухие горки в течение 20 минут при 20 градусах по Цельсию в темноте. Гора с ангирусной монтажной средой для микроскопии и накрыта крышкой. Дайте ему высохнуть 1 ч в 37 градусов по Цельсию.
  9. Выполните микроскопическое обследование. Количественное выралакиализации путем подсчета общего числа (необязательно площадь) ламининаи сосудов и числа (области) SMAи развитых сосудов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения анализа изображений, возьмите все изображения в одинаковых условиях (свет, контрастность, увеличение). В этом случае параметры обработки фиксируются, а обработка изображений становится полностью автоматической. Результаты представительской работы изображены на рисунке 4 и рисунке 5.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя описанную здесь процедуру, Ifnar1-/- нейтрофилы были выделены из опухолей и обработаны ингибитором NAMPT FK866 за 2 ч. Необработанные Ifnar1-/- нейтрофилы были использованы в качестве контроля. Эффектность лечения оценивалась с помощью аортическог...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Несмотря на прогресс в хирургическом и фармакологическом лечении рака, успешная терапия остается проблемой. Поскольку иммунные клетки, как известно, играют важную роль в регуляции роста опухоли, новые методы, ингибирующие опухолевость таких клеток должны быть установлены. Здесь мы де?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Наша работа была поддержана грантами от Deutsche Krebshilfe, Грант номер: 111647, и Немецкий научно-исследовательский совет (DFG), Номер гранта: JA 2461»2-1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
15 ml tubesSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany62,554,502
50 ml tubesCellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany227261
5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipetteCellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany6006180 / 607180 / 760180
6 well flat-bottom cell culture platesSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany833,920
96 well flat-bottom cell culture platesCellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany655180
96 well U-bottom cell culture platesCellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany65018
AMG EVOS fl digital inverted microscopeAMG, Bothel, U.S.
anti-mouse CD11bBD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.553312clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL
anti-mouse Ly6GBioLegend, California, U.S.127608clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL
BD FACS AriaIIBD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.cell sorter
CaliperVogel Germany, Kevelaer, Germany
Casy cell counterInnovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany
Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filtersSysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany04-004-2327 / 04-004-2328
Centrifuge Rotina 420 RAndreas Hettich, Tuttlingen, Germany4706
Collagenase DSigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany11088858001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)BioLegend, California, U.S.422801Stock: 5mg/ml
Dispase ISigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, GermanyD4818-2MG
DMEMGibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.41966-029DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
DMSO (Dimethylsufoxide)WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, GermanyWAK-DMSO-10CryoSure-DMSO
DNase ISigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, GermanyDN25-100MG
DPBSGibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.14190-094
Endothelial cell growth mediumPromoCell, Heidelberg, Germanyc-22010
FBS (Fetal Bovine Serum)Biochrom, Berlin, GermanyS0115
Fc-block (Anti-mouse CD16/32)BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.553142clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL
FK 866 hydrochlorideAxon Medchem, Groningen, NetherlandsAxon 1546Stock: 100 mM
Goat Anti-Rabbit IgG H&LAbcam, Cambridge, U.K.ab97075Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL
Heracell 240i CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific, Waltham, U.S.51026334
IMDMGibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.12440-053IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin
Isis GT420 shaverB. Braun Asculap, Suhl, Germany90200714
Matrigel Matrix basement membraneCorning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands7205011
Microtome Cryostat Microm HM 505 NMicrom International GmbH, Walldorf, Germany
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth MuscleSigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, GermanyF3777FITC-conjugated, no information about stock concentration
Needles 0.4 mm x 16 mmBD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.302200
NeomountMerck, Darmstadt, GermanyHX67590916
Normal goat serumJackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S.005-000-121
Penicillin StreptomycinGibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.15140-122
Pipetus automatic pipetteHirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany9907200
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.P36935
rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chainImmundiagnostik, Bensheim, GermanyAP1001.1No information about stock concentration
StemPro AccutaseGibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S.A1105-01
Sterile disposal scalpel (no. 15)MedWare, Naples, U.S.120920
Syringes 1 mlBD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.303172
Syringes 10 mlBD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S.309110
T75 sterile cell culture flasksSarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany833,911,302
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek, Torrance, U.S.4583
Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical SectioningCarl Zeiss, Oberkochen, Germany

Ссылки

  1. Jablonska, J., Leschner, S., Westphal, K., Lienenklaus, S., Weiss, S. Neutrophils responsive to endogenous IFN-beta regulate tumor angiogenesis and growth in a mouse tumor model. Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1151-1164 (2010).
  2. Andzinski, L., Wu, C. F., Lienenklaus, S., Kröger, A., Weiss, S., Jablonska, J. Delayed apoptosis of tumor associated neutrophils in the absence of endogenous IFN-β. International Journal of Cancer. 136, 572-583 (2015).
  3. Rongvaux, A., et al. Pre-B-cell colony-enhancing factor, whose expression is upregulated in activated lymphocytes, is a nicotinamide phosphoribosyltransferase, a cytosolic enzyme involved in NAD biosynthesis. European Journal of Immunology. 32, 3225-3234 (2002).
  4. Skokowa, J., et al. NAMPT is essential for the G-CSF-induced myeloid differentiation via a NAD(+)-sirtuin-1-dependent pathway. Nature Medicine. 15, 151-158 (2009).
  5. Yaku, K., Okabe, K., Hikosaka, K., Nakagawa, T. NAD Metabolism in Cancer Therapeutics. Frontiers in Oncology. 8, 622(2018).
  6. Audrito, V., et al. Extracellular nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) promotes M2 macrophage polarization in chronic lymphocytic leukemia. Blood. 125, 111-123 (2015).
  7. Brentano, F., et al. Pre-B cell colony-enhancing factor/visfatin, a new marker of inflammation in rheumatoid arthritis with proinflammatory and matrix degrading activities. Arthritis & Rheumatology. 56, 2829-2839 (2007).
  8. Jablonska, J., Wu, C. -F., Andzinski, L., Leschner, S., Weiss, S. CXCR2-mediated tumor associated neutrophilrecruitment is regulated by IFN-beta. International Journal of Cancer. 134, 1346-1358 (2014).
  9. Andzinski, L., et al. Type I IFNs induce anti-tumor polarization of tumor associated neutrophils in mice and human. International Journal of Cancer. 138, 1982-1993 (2016).
  10. Wu, C. -F., et al. The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung. International Journal of Cancer. 137, 837-847 (2015).
  11. Hansel, T. T., Kropshofer, H., Singer, T., Mitchell, J. A., George, A. J. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (4), 325-338 (2010).
  12. Hasmann, M., Schemainda, I. FK866, a highly specific noncompetitive inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, represents a novel mechanism for induction of tumor cell apoptosis. Cancer Research. 63, 7436-7442 (2003).
  13. Holen, K., Saltz, L. B., Hollywood, E., Burk, K., Hanauske, A. R. The pharmacokinetics, toxicities, and biologic effects of FK866, a nicotinamide adenine dinucleotide biosynthesis inhibitor. Investigational New Drugs. 26, 45-51 (2008).
  14. von Heideman, A., Berglund, A., Larsson, R., Nygren, P. Safety and efficacy of NAD depleting cancer drugs: results of a phase I clinical trial of CHS 828 and overview of published data. Cancer Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 65, 1165-1172 (2010).
  15. De Rossi, G., Scotland, R., Whiteford, J. Critical Factors in Measuring Angiogenesis Using the Aortic Ring Model. Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 4 (5), (2013).
  16. Pylaeva, E., et al. NAMPT signaling is critical for the proangiogenic activity of tumor-associated neutrophils. International Journal of Cancer. 144 (1), 136-149 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

149NAMPT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены