גן ישיר לנקוש-החוצה של חוט השדרה בתאי גזע עצביים באמצעות אלקטרופורציה של CAS9 חלבון-gRNA מכלולי

Summary

הציג כאן הוא פרוטוקול לבצע זמן, שטח הגן מוגבל להוריד במיתרי השדרה על ידי הזרקת CAS9-gRNA מורכבות לתוך התעלה המרכזית חוט השדרה ואחריו electroporation.

Abstract

האקסון יש את היכולת הייחודית להתחדש באופן מלא בחוט השדרה שלה. זה בעיקר בשל התאים הependymal שנותרו כמו תאי גזע עצביים (NSCs) ברחבי החיים, אשר מתרבים לרפורמה הצינור ependymal ולהבדיל לתוך הנוירונים איבד לאחר פגיעה בחוט השדרה. פענוח כיצד NSCs אלה לשמור על העוצמה לאחר הפיתוח ומתרבים על הפגיעה בחוט השדרה לרפורמה מבנה טרום פציעה המדויק יכול לספק תובנה רבת ערך לגבי האופן שבו מיתרי השדרה יכול להתחדש כמו גם אפשרויות טיפול פוטנציאליות. ביצוע המנקוש גנים בקבוצות מערכות מסוימות של NSCs בתוך פרק זמן מוגבל יאפשר לימוד של מנגנונים מולקולריים מאחורי אלה תהליכי רגנרציה, מבלי להיות מבולבל על ידי פיתוח perturbing אפקטים. מתוארים כאן היא שיטה לבצע גנים מעלף בחוט השדרה NSCs באמצעות מערכת CRISPR-Cas9. על ידי הזרקת את קומפלקס CAS9-gRNA לתוך התעלה המרכזית חוט השדרה ואחריו electroporation, היעד גנים הם הפילו בתוך NSCs באזורים ספציפיים של חוט השדרה בנקודת זמן רצויה, המאפשר מחקרים מולקולריים של חוט השדרה NSCs במהלך תחדשות.

Introduction

חוט השדרה של רוב החוליות אינו מסוגל להתחדש בעקבות פציעה, המוביל נכות קבע. מספר מסלמנדרות, כגון האקאוסול, הם חריגים בולטים. האקסון יכול להתחדש באופן מלא בחוט השדרה זהה מבחינה מבנית ותפקוד שחזור לחלוטין חוט השדרה. הרבה יכולת ההתחדשות של חוט השדרה האקאולית היא בשל תאים ependymal. תאים אלה קו התעלה המרכזית, ובניגוד לאלה יונקים, התאים axoependymal l להישאר כתאי גזע עצביים (NSCs) לאחר ההתפתחות העובריים. לאחר פגיעה בחוט השדרה (למשל, מ קטיעה זנב), אלה NSCs מתרבים לגדול מחדש את צינור ependymal ולהבדיל להחליף נוירונים אבודים^1,2,3. חשיפת כיצד axoNSCs חוט השדרה להישאר pluripotent ולהיות מופעל לאחר הפציעה יכול לספק מידע חשוב על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות עבור חולים אנושיים.

בשל ההתקדמות ב-crispr-Cas9 gene הטכניקה, ביצוע טוק-אאוט כדי לפענח את הפונקציה גנטית הפכה קלה יותר, הוכח כי יש ישימות רחבה במינים שונים, כולל axo ls^4,5, מיכל בן ^{6 ,} מיכל ^{סבן , 8}. המהדורה האחרונה של הגנום axoלגמרי למלא וטראנסקריפט כעת מאפשר לכל מקום גנומית להיות ממוקד ולהעריך טוב יותר את ההשפעות מחוץ ליעד^{9,10,11,12 ,} מיכל ^{בן 13 , 14}. ממוטב הפרוטוקולים פותחו עבור לנקוש-out ו-in ב axoCas9 ls באמצעות CRISPR-מערכת¹⁵. משלוח של מכונות CRISPR-Cas9 בצורה של חלבון CAS9-gRNA ribonuאופאנפרוטאין (RNP) הוכח להיות יעיל יותר מאשר באמצעות Cas9 ו-gRNA-קידוד פלמידים⁴. זה סביר בגלל RNP להיות קטן יותר בגודל של וקטורים פלביניים, היכולת שלה ליצור הפסקות DNA מיד, והגנה על gRNA מ-RNA השפלה. בנוסף, באמצעות שימוש עוקף RNPs ותרגום; כך, הוא מונע בעיות כגון כוח היזם ושימוש אופטימלי השימוש כאשר אלמנטים פלביניים נגזרים ממינים שונים.

מחקרים באובדן התפקוד הם אחת הגישות הכלליות לחקירת פונקציות פוטנציאליות של גנים מעניינים. על מנת ללמוד פונקציה גנטית במהלך התחדשות, נוק אאוט צריך להתבצע באופן אידיאלי רק לפני פגיעה כדי למנוע השפעות על פיתוח. בנוסף, הדפיקה החוצה צריכה להיות מוגבלת הן לNSCs והן לאזור ההתחדשות. להפיל את הגן היעד של כל NSCs (כולל אלה במוח, שהוא המקרה במערכות מערכות לloxp), עשוי לייצר אפקטים לא קשור התחדשות שיכול לבלבל את הפרשנות של תוצאות. למרבה המזל, המבנה של חוט השדרה axol מספק הזדמנות ייחודית לזמן ומקום מוגבל לנקוש ב NSCs. רוב חוט השדרה NSCs במגע עם התעלה המרכזית ומהווים את הרוב המכריע של התאים במגע עם תעלת המרכזית^16,17. לכן, זריקה של קומפלקס CAS9-grna לתוך התעלה המרכזית, ואחריו electroporation, מאפשר מסירה NSCs חוט השדרה באזור הרצוי בשעה מסוימת^4,18,19. פרוטוקול זה מדגים כיצד זה מבוצע, המוביל לתוך חדירה מאוד החוצה בחוט השדרה NSCs. הניתוח שלאחר מכן מבוצעים כדי ללמוד את ההשפעות על התחדשות ועל התנהגות המועצה לבטחון לאומי.

Protocol

כל ניסויים בבעלי חיים חייבים להתבצע בהתאם לתקנות מקומיות ולאומיות בנושא ניסויים בבעלי חיים ובאישור לוח הסקירה המוסדי הרלוונטי.

1. הכנת התמהיל CAS9-gRNA RNP

1. עיצוב וסינתזה של gRNAs.
   הערה: עיין בפרסומים אחרים לעיצוב וסינתזה של grnas, כולל אחד באופן בלעדי על axofor^15,20,21,22.
2. השג CAS9-NLS חלבון על ידי הכנת הבית או לרכוש אותו באופן מסחרי.
3. להכין CAS9-gRNA לערבב על ידי ערבוב 5 μg של CAS9-NLS חלבון, 4 μg של gRNA, 0.9 μL של 10x CAS9 מאגר, ולמלא את עוצמת הקול ל 10 μL עם nuclease-H חינם₂O. aliquot את התערובת ואת החנות ב-80 ° צ' אם לא נעשה שימוש מיידי.

2. הכנת לוחות מעלה לאלקטרופורציה

1. הכינו 200 mL של 2% (wt/vol) פתרון ב 1x DPBS. מתמוסס על ידי חימום הפתרון במיקרוגל ויוצקים אותו על 10 ס מ מנות פטרי לעומק של כ 10 מ"מ (עמוק מספיק כדי לכסות את החיה כולה).
2. הניחו ללוחות להחזק בטמפרטורת החדר. חנות צלחות ב -4 ° c אם לא בשימוש מיידי.
3. שימוש באזמל כירורגי, לחתוך את הצלחת agarose לעשות סדק להחזקת הזנב ישר, טוב להתאמת הגוף של בעל החיים, ושתי בארות נוספות עבור הצבת אלקטרודות (איור 1E).
4. מניחים את הצלחת על הקרח וממלאים אותו עד הסוף עם קרח קר 1x DPBS. השתמש באותו פתרון DPBS להכנת צלחות כדי להבטיח conductibility חשמלי עקבי בהגדרת.

3. קביעת התצורה של האלקטרופורקטור

1. קבע את תצורת האלקטרופוראטור. הגדר את הדופק צפיה להכיל פולס דו קוטבית אחד של 70 V, עם משך של 5 אלפיות השנייה, מרווח של 50 ms, ואין ריקבון מתח. להגדיר את הדופק העברה יש ארבעה פולסים דו קוטבית של 40 V, עם משך של 50 ms, מרווח של 999 ms, ו 10% ניוון מתח.
2. חבר את האלקטרודות לאלקטרופורטור והתאם את הפינצטה להיות בהפרש של 7 מ"מ. השקיעו את האלקטרודות בגביע של DPBS לפני ובין האלקטרופורציה.

4. הכנת וטעינת נימי זכוכית מיקרוהזרקה

1. לבצע מבחן הרמפה על פולר בוער/חום מיקרופיפטה לפי הוראות היצרן כדי לקבוע את ערך החום.
2. משוך נימים הזרקה עם קצוות מחודדות באמצעות הפרמטרים הבאים: חום = ערך הבדיקה השיפוע, משוך = 100, מהירות = 100, זמן = 100.
3. . הביטו במחט מתחת לstereomicroscope באמצעות מלקחיים עדינים, לשבור את הנימים בזווית כך שיש לו טיפ משופע. לשבור בעמדה שבה הוא רזה מספיק כדי למקד את התעלה המרכזית, תוך היותו חזק מספיק כדי לחדור את העור.
   הערה: הנקודה בה הקוטר הוא בערך 20 יקרומטר או כ-50% מקוטר חוט השדרה הוא נקודת התחלה טובה. ייתכן שיהיה צורך בנסיונות מרובים כדי לקבל שבירת אופטימלית.
4. הוסף פתרון מהיר ירוק FCF לתמהיל RNP ביחס של 1:30 וטען על 5 μL של תערובת הזרקה לתוך נימי עם טיפ מיקרוטוען מיקרו.
5. הר הקפילר על המשאבה הפניאומטית, כשקצהו הנטוי פונה כלפי מטה.

5. קביעת התצורה של המשאבה הפניאומטית

1. הגדר את המשאבה הפניאומטית. הגדר את החסימה כדי 0.5 פאונד לאינץ ' מרובע (psi), להוציא כדי 2 psi להחזיק, ואת משך מגודרת.
2. מבחן קפיטים ופנאומטי הגדרות משאבה ידי לטבול את הנימים לתוך טיפת מים לחיצה על דוושת הרגל כדי להזריק. ודא שערבוב ההזרקה יוצא בזרם איטי אך יציב.
3. להתאים את הלחץ להחזיק אם ערבוב ההזרקה להתחיל דולף באופן ספונטני או מים הוא נשאב את הנימים. להגדיל את הלחץ הפליטה או לשבור יותר של נימי אם תערובת ההזרקה יוצאת לאט מדי. הפחת את הלחץ הפליטה אם הזריקה יוצאת מהר מדי.

6. הזרקת RNP לתוך חוט השדרה

1. בשנת 0.03% הפתרון בנזוקיין במשך 10 דקות לפחות. בדוק כי בעלי החיים אינם מגיבים על ידי היפוך אותם הפוך במים.
2. להרים בעל חיים עם מלקחיים הטבעת ולהניח אותו על מיטה של סיליקון, עם הצד השמאלי של החיה הפונה כלפי מעלה הזנב מצביע לכיוון ימין. הצב את אתר ההזרקה באמצע שדה התצוגה של הstereomicroscope (איור 1א).
3. כוונן את המיקרומניפולציה כך שהנימי יגיע ב-60 ° מצדו הימני של שדה התצוגה (איור 1ב).
4. זהה את חוט השדרה ואת התעלה המרכזית (איור 1ג).
   הערה: חוט השדרה הוא מבנה צינורי מעל notochord.
5. כיוון לתעלה המרכזית, הזז את הקפילר קדימה כדי לחדור בעדינות את העור ואת השריר לתוך התעלה המרכזית של חוט השדרה. הגבילו את תנועת הקפילר לצעדים קטנים, כאשר חוט השדרה נמצא ממש מתחת לשרירי הזנב.
6. לחץ והחזק את דוושת הרגל כדי להזריק את התערובת לתוך התעלה המרכזית. שים לב אם המיקס RNP מתפשט לאורך התעלה המרכזית כשורה כחולה בשני הכיוונים, אשר מראה כי הקפילר ממוקם כראוי (איור 1ד).
7. אם זה לא קורה, להשאיר את דוושת הרגל לחוץ תוך הזזת נימי קצת פנימה והחוצה עד המיקס RNP מתחיל ללכת. אם הנימים הופך סתומים על ידי רקמה, לנקות אותו על ידי הוצאת לתוך מים על לחצים גבוהים.
8. כוונן את הלחץ הפליטה כך שיהיה מספיק כדי לגרום למיקס ה-RNP להתפשט בתעלה המרכזית, אך לא עד כדי כך שהוא יפוצץ את המבנה.
9. המשך להחזיק את הדוושה ברגל כך ערבוב ההזרקה מתפשט לאורך התעלה המרכזית, עד שהוא מגיע הטרמינל שלפוחית בסוף חוט השדרה והחדרים במוח.
   הערה: הדבר עשוי להימשך עד 2 דקות בהתאם לגודל החיה. ייתכן שיהיה צורך להגביר את הלחץ לאחר זמן מה כדי לגרום לערבוב RNP להיכנס לחללי המוח.
10. המשך בהקדם האפשרי לאלקטרופורציה לאחר הזרקה מוצלחת.

7. אלקטרופורציה

1. להעביר את בעל החיים עם מלקחיים הטבעת על הצלחת המוכן מראש אלקטרופורציה (איור 1E) על הקרח. מניחים את הזנב בתוך החריץ כך שהוא דחוקה על ידי agarose (איור 1F).
2. מניחים את האלקטרודות לתוך הבארות משני צידי הזנב. ודא כי כל החיות והאלקטרודות מכוסות על-ידי PBS קר קרח.
3. לחץ על מתג הרגל כדי להתחיל את האלקטרופורציה.
4. לאחר השלמת האלקטרופורציה, החזר את החיה למים.
5. המשך להזריק בעלי חיים נוספים אם יש צורך בכך.
6. בדוק כי בעלי החיים electroporated הם בריאים לאחר ההרדמה מתפוגג וכי אין נזק שנגרם לזנב.

8. הערכת יעילות להוריד

1. . תקן את הזנב של החיה האלקטרו-מלאכותית לעשות צולבות סעיפים של הזנב ואחריו מכתים אימונוהיסטוכימיה כדי להעריך את היעילות של הנוק אאוט ברמת החלבון.
   הערה: אם יש לבצע כריתת זנב לאחר האלקטרופורציה, ניתן להשתמש בזנב החתוך למטרה זו. בעלי חיים החשמליים עם gRNAs נגד Gfp או Tyrosinase, למשל, יכול לשמש כפקד שלילי⁴.
2. לחילופין, חוט השדרה האלקטרו-מגנטי יכול להיות מחולץ ומיועד לבדיקת דנ א. בצע את ה-PCR בעקבות הערכת הרצף של Sanger או רצף הדור הבא כדי להעריך את אחוזי הסדר הגנטי הערוך¹⁵.
   הערה: יעילות העריכה המתקבלת תפחית את יעילות העריכה בפועל עבור NSCs, בשל הכללה של תאים שאינם אלקטרופורביים ונוירונים שחוסר הקשר האפיפיורי אל המרכז המרכזי ולכן לא יקבל את המיקס RNP.

תוצאות

הזרקה ואלקטרופורציה של קומפלקס CAS9-gRNA נגד Sox2 לתוך התעלה המרכזית לחוט השדרה המרכזי הוביל לאובדן מסיבי של Sox2 immunoreactivity ברוב של השדרה NSCs חוט, עם Grna נגד Tyrosinase (tyr) כפקד (איור 2 A). B3-טובולין (ויטראז ' עם TUJ1) הוא סמן לנוירונים ולא התבטא ב NSCs, ו SOX2-TUJ1-תאים סביב התעלה המרכזית ?...

Discussion

הפרוטוקול המתואר מאפשר הזמן והשטח הגן מוגבלת לנקוש ב NSCs בחוט השדרה axol. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר פילוח ספציפי של NSCs בזמן מוגדר מיקום עם החדירה גבוה. היא מונעת השפעות בלתי רצויות פוטנציאלי שמקורם הגן לנקוש ב NSCs באזורים אחרים כגון המוח המתרחשים בעת שימוש במערכת היצור-LoxP. זה גם מונע השפעות התפתח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501-100G
Benzocaine 0.03 % (wt/vol)	Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Benzocaine 10 % (wt/vol)	Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.
Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.	Stutter Instrument	BF120-94-8
CaCl2·2H2O	Merck	102382
CAS9 buffer, 10x	Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months
CAS9-NLS protein	PNA Bio	CP03
Cell culture dishes, 10cm	Falcon	351029
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Scientific Instruments	11254-20
Electroporator	Nepa Gene	NEPA21
	BEX	Pulse Generator CUY21EDIT II
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Fast Green FCF Solution, 5x	Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS.
Flaming/Brown Micropipette Puller	Stutter Instrument	P-97
Holtfreter’s solution 400% (wt/vol)	Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
KCl	Merck	104936
MgSO4·7H2O	Merck	105886
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MN-153
NaCl	Merck	106404
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV830
Ring Forceps	Fine Scientific Instruments	11103-09
Stereomicroscope	Olympus	SZX10
Tris base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-buffered saline, 10x	Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter	Nepa Gene	CUY650P10