CAS9 단백질-gRNA 복합체의 전기 포출을 통해 악소로틀 척수 신경 줄기 세포의 직접 유전자 녹아웃

요약

여기에 제시된 프로토콜은 CAS9-gRNA 복합체를 척수 중앙 운하에 주입하고 전기 포공에 의해 액소로틀 척수에서 시간 및 공간 제한 유전자 녹아웃을 수행하는 프로토콜입니다.

초록

액소로틀은 척수를 완전히 재생할 수 있는 독특한 능력을 가지고 있습니다. 이것은 주로 신경 줄기 세포로 남아 있는 ependymal 세포 때문 (NSC) 일생 내내, 이는 ependymal 관을 개혁하고 척수 손상 후에 분실한 신경으로 분화하기 위하여 증식합니다. 이러한 NSC가 개발 후 다능성을 유지하고 정확한 사전 손상 구조를 개혁하기 위해 척수 손상 시 증식하는 방법을 해독하면 포유류 척수가 재생되는 방법과 잠재적인 치료 옵션에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 제한된 기간 내에 NSC의 특정 하위 집합에서 유전자 녹아웃을 수행하면 개발 교란 효과에 의해 혼동되지 않고 이러한 재생 프로세스 뒤에 분자 메커니즘을 연구 할 수 있습니다. 여기서 설명된 것은 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 축색척수 NSC에서 유전자 녹아웃을 수행하는 방법이다. CAS9-gRNA 복합체를 척수 중앙 운하에 주입하고 전기 천공에 이어 표적 유전자는 원하는 시점에서 척수의 특정 영역 내의 NSC에서 기절하여 척수 NSC의 분자 연구를 가능하게 합니다. 재생.

서문

대부분의 척추동물의 척수는 상해를 입고 재생할 수 없으므로 영구적인 장애를 초래합니다. 액소로틀과 같은 몇몇 도롱뇽은 주목할 만한 예외입니다. 액소로틀은 구조적으로 동일한 척수를 완전히 재생하고 척수 기능을 완전히 회복시킬 수 있습니다. 액소로틀 척수의 재생 능력의 대부분은 형형세포에 기인한다. 이 세포는 중앙 운하를 일렬로 세게하고, 포유동물에 있는 것과는 달리, axolotl ependymal 세포는 신경 줄기 세포로 남아 (NSC) 배아 후 발달. 척수 손상 후 (예를 들어, 꼬리 절단에서), 이러한 NSCs는 ependymal 관을 재성장하고 잃어버린 뉴런을 대체하기 위해 분화증^1,2,3. axolotl 척수 NSC가 다능성으로 남아 있고 부상 후에 활성화되는 방법을 밝히는 것은 인간 환자를 위한 새로운 치료 전략 개발에 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다.

CRISPR-Cas9 유전자 녹아웃 기술의 발전으로 인해 유전자 기능을 해독하기 위한 녹아웃 을 수행하는 것이 더 쉬워졌으며 액소로톨 ^4,5를포함한 다양한 종에서 광범위한 적용 가능성을 가지고 있는 것으로 나타났습니다. ^{6개 , 7명 , 8}. 전체 액소로틀 게놈 및 전사체의 최근 릴리스는 이제 모든 게놈 궤적을 표적으로 하고오프 타겟 효과에 더 나은 평가를 위해 9,^10,11,12를 허용합니다 ^{, 13세 , 14}. CRISPR-Cas9 시스템^15를사용하여 축삭에서 녹아웃 및 녹아웃을 위해 최적화 된 프로토콜이 개발되었습니다. CAS9 단백질-gRNA 리보뉴클레오프로테인트(RNP)의 형태로 CRISPR-Cas9 기계류의 전달은 Cas9 및 gRNA-인코딩 플라스미드^4를사용하는 것보다 더 효율적인 것으로 나타났다. 이것은 RNP가 플라스미드 벡터보다 크기가 작고, DNA 를 즉시 생성하는 능력, RNA 분해로부터 gRNA를 보호하기 때문입니다. 또한, RNP를 사용하여 전사 및 번역을 우회; 따라서, 플라스미드 원소가 다른 종으로부터 유래될 때 프로모터 강도 및 최적의 코돈 사용과 같은 문제를 방지한다.

기능 상실 연구는 관심 있는 유전자의 잠재적인 기능을 조사하는 일반적인 접근법 중 하나입니다. 재생 중에 유전자 기능을 연구하기 위해, 녹아웃이상적으로 개발에 미치는 영향을 피하기 위해 부상 직전에 수행해야합니다. 또한 녹아웃은 NSC와 재생 영역 모두에 국한되어야 합니다. 모든 NSCs에서 표적 유전자의 녹아웃(Cre-LoxP 시스템의 경우인 뇌의 유전자 포함)은 결과의 해석을 혼동할 수 있는 재생과 관련이 없는 효과를 생성할 수 있습니다. 다행히도, 액소로틀 척수의 구조는 NSC에서 시간 및 공간 제한 녹아웃을위한 독특한 기회를 제공합니다. 척수 의 대부분은 중앙 운하와 접촉하고 중앙 운하와 접촉하는 세포의 대다수를^{구성합니다 16,17.} 따라서 CAS9-gRNA 복합체를 중앙 운하로 주입한 다음 전기 포출을 한 후 특정 시간 4,^18,19에서원하는 부위의 척수 NSC로 전달할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이것이 어떻게 수행되는지 를 보여 주며, 표적 척수 NSC에서 고도로 관통하는 녹아웃으로 이어집니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 동물 실험에 대한 지역 및 국가 규정에 따라 관련 기관 검토 위원회의 승인을 받아 수행되어야 합니다.

1. CAS9-gRNA RNP 믹스 준비

1. gRNA를 설계하고 합성합니다.
   참고 : axolotls^15,20,21,^22에관한 것을 포함하여 gRNA를 디자인하고 합성하기위한 다른 출판물을 참조하십시오.
2. 사내에서 준비하거나 상업적으로 구입하여 CAS9-NLS 단백질을 획득하십시오.
3. CAS9-gRNA 혼합물을 5 μg의 CAS9-NLS 단백질, 4 μg의 gRNA, 0.9 μL의 10x CAS9 완충액을 혼합하여 준비하고, 뉴클레아제 없는_H2O. Aliquot로 부피를 10 μL까지 채우고 즉시 사용하지 않을 경우 -80°C에서 보관한다.

2. 전기화용 아가로즈 플레이트 준비

1. 1x DPBS에서 2%(wt/vol) 아가로즈 용액 200mL를 준비합니다. 용액을 전자 레인지에 가열하여 용해시키고 약 10mm 깊이 (전체 동물을 덮을 만큼 깊이)에 10cm 페트리 접시에 붓습니다.
2. 접시가 실온에서 고체화되도록 하십시오. 즉시 사용하지 않을 경우 플레이트를 4°C로 보관하십시오.
3. 외과용 메스를 사용하여 아가로즈 플레이트를 잘라 꼬리를 똑바로 잡기 위한 슬릿을 만들고, 동물의 몸에 잘 끼우고, 전극을 배치하기 위한 2개의 여분의 우물(도1E)을 만든다.
4. 얼음 위에 접시를 놓고 얼음 차가운 1x DPBS로 가장자리까지 채웁니다. 셋업에서 일관된 전기 전도성을 보장하기 위해 플레이트를 만들기 위해 동일한 DPBS 솔루션을 사용하십시오.

3. 전기 포더 구성

1. 전기포더기 구성. 포링 펄스를 70V의 양극성 펄스 1개로 구성하고 지속 시간은 5ms, 간격은 50ms이며 전압 감쇠는 없습니다. 전송 펄스를 40V의 4개의 양극성 펄스를 가지도록 설정하고, 50ms의 지속 시간, 999ms의 간격 및 10% 전압 감쇠를 갖습니다.
2. 전극을 전기 포더레이터에 연결하고 핀셋을 7mm 간격으로 조정합니다. 전극을 DPBS의 비커에 담그고 전기 포공 사이를 침수시합니다.

4. 미세 사출 유리 모세 혈관 준비 및 적재

1. 열 값을 결정하기 위해 제조업체의 지침에 따라 불타는 / 갈색 마이크로 파이펫 풀러에서 램프 테스트를 수행하십시오.
2. 다음 매개 변수를 사용하여 테이퍼 끝으로 사출 모세 혈관을 당깁니다 : 열 = 램프 테스트 값, 당김 = 100, 속도 = 100, 시간 = 100.
3. 입체 현미경으로 바늘을 관찰하십시오. 미세 한 집게를 사용 하 여 비스듬한 팁이 되도록 모세관을 비스듬히 부수. 피부를 관통할 수 있을 만큼 강하면서 중앙 운하를 겨냥할 수 있을 만큼 얇은 위치에서 휴식을 취하십시오.
   참고: 직경이 척수 직경의 약 20 μm 또는 약 50%에 있는 지점은 좋은 출발점입니다. 최적의 끊기를 얻으려면 여러 번 시도해야 할 수 있습니다.
4. 1:30의 비율로 RNP 믹스에 Fast Green FCF 솔루션을 추가하고 마이크로 로더 파이펫 팁으로 약 5 μL의 사출 믹스를 모세관에 적재합니다.
5. 기울어진 팁이 아래쪽을 향하여 공압 펌프에 모세관을 장착합니다.

5. 공압 펌프 구성

1. 공압 펌프를 구성합니다. 홀드를 평방 인치(psi)당 0.5파운드로 설정하고, 2psi 홀드로 배출하고, 게이트에 지속 시간을 가합니다.
2. 모세관을 물 한 방울에 담그고 발 페달을 눌러 주입하여 모세관 및 공압 펌프 설정을 테스트합니다. 사출 믹스가 느리지만 꾸준한 스트림에서 나오는지 확인하십시오.
3. 사출 믹스가 자발적으로 누출되거나 물이 모세관으로 빨려 들어오면 보류 압력을 조절합니다. 주입 혼합이 너무 느리게 나오는 경우 배출 압력을 증가하거나 모세관의 더 많은 휴식. 주사가 너무 빨리 나오는 경우 배출 압력을 줄입니다.

6. 척수에 RNP 혼합물주입

1. 적어도 10 분 동안 0.03 % 벤조카인 용액으로 축색을 마취하십시오.
2. 반지 집게가있는 동물을 데리러 실리콘 침대에 놓고 동물의 왼쪽이 위를 향하고 꼬리가 오른쪽을 향합니다. 주사 부위를 입체 현미경의 시야 중간에 위치시다(도1A).
3. 모세관이 시야의 오른쪽에서 60°로 들어오게 되도록 미세 조작기조정(그림1B).
4. 척수와 중앙 운하를 식별합니다(그림1C).
   참고 : 척수는 노토 코드 위의 관 구조입니다.
5. 중앙 운하를 조준하고 모세관을 앞으로 이동하여 피부와 근육을 척수의 중앙 운하로 부드럽게 관통합니다. 척수는 꼬리 근육 바로 아래에 있기 때문에 모세관의 움직임을 작은 단계로 제한하십시오.
6. 풋 페달을 누르고 누를 때 믹스를 중앙 운하에 주입합니다. RNP 혼합이 모세관이 올바르게 위치되었음을 보여주는 양방향으로 파란색 선으로 중앙 운하를 따라 퍼지는지 관찰하십시오 (그림1D).
7. 이런 일이 일어나지 않으면 RNP 믹스가 들어올 때까지 모세관을 약간 안팎으로 움직이면서 발 페달을 누른 상태로 유지하십시오. 모세관이 조직에 의해 막히게되면 더 높은 압력에서 물로 배출하여 치웁히 지웁습니다.
8. RNP 혼합이 중앙 운하에 퍼지도록 충분히 배출 압력을 조정하지만 구조를 불면 너무 많이 하지 는 않습니다.
9. 주사 혼합이 뇌의 척수와 심실의 끝에 말단 소포에 도달 할 때까지, 중앙 운하를 따라 더 확산 되도록 발 페달을 누르고 계속.
   참고: 동물의 크기에 따라 최대 2분이 소요될 수 있습니다. RNP 혼합이 뇌실을 입력하는 원인이 되기 위하여 얼마 후에 압력을 증가시킬 필요가 있을 지도 모릅니다.
10. 성공적인 주입 후 가능한 한 빨리 전기 로 진행하십시오.

7. 전기 화기

1. 얼음 위에 준비된 아가로즈 전기화 판(그림1E)에 고리 집게로 동물을 옮니다. 꼬리를 슬릿 안에 놓아 아가로즈에 끼우게 합니다(그림1F).
2. 전극을 꼬리 의 양쪽에 있는 우물에 넣습니다. 전체 동물과 전극이 얼음으로 차가운 PBS로 덮여 있는지 확인하십시오.
3. 풋 스위치를 눌러 전기 개공을 시작합니다.
4. 전기 천공이 완료되면 동물을 물로 되돌리시고.
5. 필요한 경우 더 많은 동물을 주입 진행하십시오.
6. 마취가 벗겨진 후 전기 동물이 건강한지, 꼬리에 손상이 없는지 확인하십시오.

8. 녹아웃 효율성 평가

1. 전기 가판 된 동물의 꼬리를 고정합니다. 단백질 수준에서 녹아웃의 효율성을 평가하기 위해 면역 성 화학 적 염색 다음에 꼬리의 단면을 확인하십시오.
   참고 : 전기 천공 후 꼬리 절단을 수행 할 경우, 절단 꼬리는이 목적을 위해 사용될 수있다. Gfp 또는 티로시나아제에 대하여 gRNAs로 전기화된 동물은,예를 들면, 음성 대조군 4로 사용될 수 있다.
2. 양자택일로, 전기 배척은 DNA를 위해 추출되고 용해될 수 있었습니다. 편집된 유전성층의 백분율을 평가하기 위해 Sanger 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱에 이어 유전형 분석 PCR을 수행한다 15.
   참고: 생성된 편집 효율성은 중앙 루멘에 정점 접촉이 없고 따라서 RNP 혼합을 수신하지 않을 것이다 비 전기 세포 및 뉴런의 포함으로 인해 NSC에 대한 실제 편집 효율을 과소평가할 것입니다.

결과

Sox2에 대한 CAS9-gRNA 복합체의 주입 및 전기 천공은 축색선 척수 중앙 운하로 SOX2 면역 반응성의 대규모 손실을 주도, 대조군으로 gRNA와 척수 NSCs의 대부분에 (Tyr) 대조군으로 (그림2 A). B3-tubulin (TUJ1로 염색)은 뉴런에 대한 마커이며 NSC에서 발현되지 않았으며, 중앙 운하를 둘러싼 SOX2-TUJ1 세포는 Sox2 삭제를 수용하는 세포로 간주되었다. 정량화는 CAS9-So...

토론

기술된 프로토콜은 액소로틀 척수에 있는 NSC에 있는 시간 및 공간 제한한 유전자 녹아웃을 허용합니다. 현재 프로토콜은 높은 침투와 정의 된 시간과 위치에 NSC의 특정 타겟팅을 할 수 있습니다. 그것은 Cre-LoxP 시스템을 사용할 때 발생하는 뇌와 같은 다른 지역의 CS에서 유전자 녹아웃에서 발생하는 잠재적 인 원치 않는 효과를 방지 할 수 있습니다. 그것은 또한 지속적인 녹아웃에서 유래 하는 개...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501-100G
Benzocaine 0.03 % (wt/vol)	Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Benzocaine 10 % (wt/vol)	Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months.
Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D.	Stutter Instrument	BF120-94-8
CaCl2·2H2O	Merck	102382
CAS9 buffer, 10x	Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months
CAS9-NLS protein	PNA Bio	CP03
Cell culture dishes, 10cm	Falcon	351029
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Scientific Instruments	11254-20
Electroporator	Nepa Gene	NEPA21
	BEX	Pulse Generator CUY21EDIT II
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G
Fast Green FCF Solution, 5x	Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS.
Flaming/Brown Micropipette Puller	Stutter Instrument	P-97
Holtfreter’s solution 400% (wt/vol)	Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
KCl	Merck	104936
MgSO4·7H2O	Merck	105886
Microloader pipette tips	Eppendorf	5242956003
Micromanipulator	Narishige	MN-153
NaCl	Merck	106404
Pneumatic PicoPump	World Precision Instruments	SYS-PV830
Ring Forceps	Fine Scientific Instruments	11103-09
Stereomicroscope	Olympus	SZX10
Tris base	Sigma-Aldrich	T6066
Tris-buffered saline, 10x	Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months.
Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter	Nepa Gene	CUY650P10