JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כוחות מכניים חשובים לשליטה בהעברת תאים. פרוטוקול זה מדגים את השימוש של הידרוג'לים אלסטיים שיכולים להיות מעוותים באמצעות מיקרופיפטה זכוכית מיקרומניפולציה כדי לגרות תאים עם מעבר קשיות מקומי כדי לעורר שינויים במבנה התא והגירה.

Abstract

Durotaxis היא התהליך שבו התאים חשים ולהגיב מעברי מדרגות של מתח. כדי ללמוד את התהליך הזה בתוך מבחנה, הנוקשות של המצע שבבסיס תא חייב להיות מניפולציות. בעוד הידרוג'לים עם נוקשות מדורגת הגירה ארוכת טווח הוכיחה הוכיחו שימושי במחקרים durotaxis, מיידית, התגובות אקוטי שינויים מקומיים במתח המצע לאפשר מחקר ממוקד של תנועות תאים בודדים ו subcellular האירועים איתות. כדי לבחון באופן מובן מאליו את היכולת של תאים לחוש ולהגיב קשיות המצע הבסיסי, שיטה שונה עבור יישום של מעברי צבע חריפה של מתח מוגבר לתאים בודדים תרבותי על deformable הידרוג'לים משמש אשר מאפשר בזמן אמת מניפולציה של כוח וכיוון של מעברי צבע נוקשות הנחיתעל התאים המדובר. בנוסף, בסדר כוונון הפרטים והפרמטרים של המילוי, כגון הצורה והממדים של המיקרופיפטה או המיקום היחסי, המיקום והכיוון של הדרגתי המוחל, ניתן למטב את האפשרות למחקר של כל מכני סוג תא ומערכת רגישים. פרמטרים אלה ניתנים לשינוי כדי לשנות באופן אמין את הגירוי שהוחל ולהרחיב את הפונקציונליות ואת הרב-תכליתיות של התיקון. שיטה זו מאפשרת בדיקה של תנועת durotactic ארוכת טווח, כמו גם שינויים מיידיים יותר של איתות סלולרי ודינמיקה מורפולוגית בתגובה נוקשות שינוי.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, חשיבותו של התכונות המכאניות של סביבת התא צברה הכרה גוברת בביולוגיה של התא. רקמות שונות מטריצות מסחטות יש מאפיינים שונים היחסיים, כמו תאים להעביר ברחבי הגוף, הם מנווטים שינויים אלה, באמצעות תכונות מכניות אלה כדי להנחות אותם1,2,3 , ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. תאים להשתמש הנוקשות של רקמה נתונה כדי להודיע על התנהגות נעים שלהם במהלך תהליכים כגון פיתוח, פצע ריפוי, סרטן גרורות. עם זאת, המנגנונים המולקולריים המאפשרים תחושת ותגובה לתשומות המכאניות הללו נותרו בעיקר בלתי ידועים1,2,3,4,5, מיכל בן 6 , 7. לאחר מכן

על מנת ללמוד את המנגנונים שדרכם תאים להגיב לרמזים סביבתיים פיזיים, קשיחות או נוקשות של המצע התאים המשמשים לטיפול בתאי מטופל חייב להיות מניפולציות. בשנת 2000, Chun-Min Lo, יו-לי וואנג ועמיתיו פיתחו שיטת הפעולה8 לפיה התגובה של תא בודד מורצפת לשינוי רמזים מכניים יכול להיבדק ישירות על ידי מתיחת מטריצה deformable המגולוון (ecm) מצופה אלקטרופורזה הידרוג'לים שבהם התאים היו מצופים. התאים מוצגים בהעדפה משמעותית למעבר לכיוון מצעים של סטיפר, תופעה שכונתה "דורוקמוניות".

מאז הדו ח המקורי ב 2000, טכניקות רבות אחרות המועסקים לחקר durotaxis. מעברי הקשיות הקשים מיוצרים על ידי השלכת ג'לים על תכונות נוקשות כגון פוליסטירן חרוזים9 או הודעות פולימר נוקשה10 או על ידי פולימריות המצע סביב הקצוות של שמיכות זכוכית11 כדי ליצור מכני ' צעד-גבולות '. לחילופין, הידרוג'לים עם רדודים אבל מעברי קשיות קבוע כבר מפוברק על ידי מגוון של שיטות כגון מעברי החוצה של crosslinker קשר שנוצר על ידי התקנים microfluidic12,13 או זה לצד-ידי צד הידרוג פתרון טיפות של נוקשות שונים8, או הידרוג ' ו עם פוטוראקטיבית crosslinker קשר מטופלים עם חשיפה אור UV מדורגים ליצור קשיות ליניארי מעבר הצבע14,15. טכניקות אלה שימשו השפעה רבה כדי לחקור את התנועה התאית durotactic en המסה לאורך זמן. עם זאת, בדרך כלל תכונות אלה מפוברק מראש של ציפוי התא המאפיינים שלהם נשארים עקביים במהלך הניסוי, הסתמכות על תנועה אקראית אקראי לדיגום של מעברי צבע מכניים. אף אחת מהשיטות הללו אינה קלה להתבוננות בשינויים מהירים בהתנהגות התאית בתגובה לגירוי מכני חריף.

כדי להתבונן בתגובות הסלולר לשינויים חריפים בסביבה המכנית, היחידה הניידת מציעה מספר יתרונות. בעלי התכונות האלה, תאים בודדים מקבלים גירוי מכני חריף על ידי משיכת המצע הבסיסי הרחק מתא עם מיקרופיפטה זכוכית, ובכך מציג מעבר כווני של מתח תא מטריקס. שינויים בהתנהגות המוליכה, כגון מהירות או כיוון הגירה, נצפו לאחר מכן על-ידי מיקרוסקופ ניגודיות בפאזה חיה. גישה זו מקלה על התבוננות ישירה של הגורם וההשפעה בין גירויים מכניים להעברת תאים, כיוון שהיא מאפשרת מניפולציה מהירה ואיטרטיבית של הכיוון והגודל של המתח הדרגתי והערכת הסוגר תגובות הסלולר בזמן אמת. יתר על כן, שיטה זו יכולה לשמש גם לעירור מכני התאים המבטא היתוך פלורסנט חלבונים או אנלייזרים להמחיש שינויים בכמות, פעילות, או לוקליזציה subcellular של חלבונים החשודים להיות מעורבים בתהליך המכונה ו . מונית מדבר

טכניקה זו הועסק על ידי קבוצות אשר לומדים durotaxis8,16 והוא מתואר כאן כפי שהוא הותאם על ידי המעבדה האו ללמוד את ההתנהגות durotaxis של סקוב-3 תאים סרטניים בשחלות ואת המנגנונים המולקולריים ש מוניות מתחתלגיל 17 בנוסף, שיטה ששונתה מתוארת לייצור הידרוג'לים עם שכבה אחת, אפילו של מיקרוספירות פלורסנט ליד פני השטח של תרבות התא; זה מקל על ויזואליזציה ואופטימיזציה של מיקרופיפטה שנוצר מעברי הלחץ והוא עשוי לאפשר הערכה של הקונקטיקות התא על ידי כוח המתיחה מיקרוסקופ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. ייצור פוליאקרילאמיד הידרולים עם מיקרוספירות פלורסנט מוטבעות

הערה: כיוונים מתארים פולימריזציה של 25 kPa הידרוג'ל כי הוא 22 יקרומטר קוטר ו כ 66 יקרומטר עבה. כל אחד או כל הפרמטרים האלה יכול להיות שונה והוראות לעשות זאת ניתן למצוא בטבלה 1 ובהערות17.

  1. הפעלת מנות בתחתית זכוכית או שמיכות
    1. הכן את פתרון העבודה לאגד silane להפעלה של צלחת הדמיה זכוכית התחתון או שמיכות המתאים לתוך תא חי הדמיה. לערבב 950 μL של 95% אתנול, 50 μL של חומצה אצטית קרחוני, ו 5 μL של איגוד silane (y-מתיונין מתיונין).
      הערה: באמצעות שמיכות תחתון גדול יותר בהשוואה coverslip העליון ייתן מקום נוסף לעבוד בעת הכנת ג'ל ויקל על מיקום מיקרופיפטה זכוכית בשלבים מאוחרים יותר. כמו כן, אם באמצעות שמיכות במקום צלחת הדמיה זכוכית בתחתית, לנקות את שמיכות כפי שמתואר בסעיף הבא.
    2. הפעל את פני השטח של הזכוכית עבור 20 s עם שרביט קורונה ומיד כיסוי 50 μL של פתרון העבודה לאגד silane. אפשר לפתרון להתייבש במשך 10 דקות.
    3. לשטוף פעמיים עם 95% אתנול, ולאחר מכן פעמיים עם איזופנול ולאחר מכן לאפשר את שמיכות כדי airdry עבור כ 20 דקות.
      הערה: ניתן לאחסן זכוכית מופעלת עד שבוע אחד בdesiccator.
  2. ניקוי כיסוי עליון
    1. נקיון 22 מ"מ שמיכות top על-ידי דגירה ב 2% HCl ב 70 ° c עבור 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף ב-ddH2O עבור 10 דקות שתי פעמים.
    2. דגירה הכיסויים בתמיסה של 2% קובט ניקוי הריכוז ב ddH2O ב 50 ° c עבור 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף ב-ddh2o עבור 10 דקות שתי פעמים.
    3. מודג את שמיכות ב ddH2O ב 90 ° c עבור 30 דקות, אז ב 70% אתנול ב 70 ° c עבור 10 דקות, ולאחר מכן האוויר יבש ב 60 ° c עבור מינימום של 2 h.
      הערה: שמיכות מנוקה ניתן לאחסן ללא הגבלה בdesiccator נקי.
  3. מיקרוספירה פלורסנט/התצהיר חרוז על שמיכות העליון
    1. Sonicate את פתרון המניה של מיקרוספירות פלורסנט עבור 1 h באמבט מים אולטרה סאונד. לעשות פתרון חרוז עובד על ידי דילול מלאי חרוז 1:200 ב 100% אתנול ו sonicate שוב עבור 1 h.
    2. 15 דקות לפני הפתרון חרוז סיים sonicating, ביסודיות לנקות את הכיסויים על ידי הצבת אותם אנכית במחזיק שמיכות קרמיקה לטפל עם האוויר החדר פלזמה עבור 3 דקות מנקה שולחן פלזמה.
    3. כדי להקל על הטיפול ולמנוע החלקה של שמיכות במהלך השלבים הבאים, מניחים פיסת parafilm במכסה צלחת פטרי 60 מ"מ או מכולה דומה. מניחים את הכיסויים במיצב ומקישים קלות למטה, ומבטיחים מגע טוב בין הפראפilm לבין הכיסויים.
    4. עבור שמיכות 22 מ"מ, להוסיף 150 μL של פתרון חרוז העבודה לחלק העליון של coverslip. מיד מוריד את פתרון האתנול מהצד של העטיפות, ומשאיר את החרוזים על שמיכות. . הניחו לכיסויים להתייבש
      הערה: כמות הפתרון חרוז עבודה שנוסף צריך להיות ~ 4 μl/cm2 ניתן לשנות את קנה המידה כדי להכיל שמיכות גודל.
  4. יציקת הידרו-ג'לים עם חרוזי פלורסנט מוטבעים
    1. הכינו את תמיסת ההידרוג'ל לאקרילאמיד ו-bis-אקרילאמיד. לערבב את הפתרון לפי טבלה 1, ולאחר מכן להוסיף 2.5 μl של 10% APS ו 0.5 μl של temed. . תערבב היטב . מייד מעבר לשלב הבא
      הערה: ניתן לשנות את תערובת ההידרוג'ל כדי לשנות את המודוללי של הצעירים, או נוקשות, של ההידרוג'ל, על ידי שינוי היחס של אקרילאמיד ל-bis-אקרילאמיד כפי שמוצג בטבלה 1. ערכים אלה אומתו לשימוש במעבדה האו באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, אך יש לאשרו במסגרת המוסד.
    2. מיד לאחר ביצוע הפתרון הידרוג'ל, להוסיף 25 μL ירידה אל הצד המופעל של הצלחת זכוכית תחתית או coverslip התחתון, ולאחר מכן מיד למקם את עטיפת מצופה חרוז על הפתרון, החרוז בצד למטה. יצירת קשר עם הירידה עם הצד הרחוק של שמיכות ואחריו הפחתת איטי מסייע למנוע השמנה בועות אוויר בתוך ההידרוג'ל.
      הערה: גובה ההידרוג'ל צריך להיות גם בטווח העבודה של העדשה האובייקטיבית לשימוש בניסוי המאוחר. גובה הידרוג'ל של 66 יקרומטר עובד היטב עבור רוב המערכות. ניתן לשנות את גודל ההידרוג'ל באמצעות הוספת תמיסת הידרוג'ל פחות או יותר בהתאם לגודל הכיסויים. כדי לחשב את הנפח המתאים של הידרוג'ל פתרון, השתמש במשוואה עבור נפח של גליל, V = πr2h שבו r הוא רדיוס coverslip ו- h הוא גובה ההידרוג'ל הרצוי. בדרך כלל, חישוב זה מנבא בדיוק הוגן את הגובה בפועל של הידרוג'ל, כפי שנמדד על ידי הכנת ג'ל עם חרוזים מצופה שמיכות על העליון והתחתון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד למדוד את המרחק בין שני מטוסי חרוז. עם זאת, זה כבר נצפתה כי הגובה בפועל של הידרוג'ל יכול לסטות מהחישוב זה על ידי ± 20 יקרומטר (למשל, בהתאם לעובי והיצרן של שמיכות זכוכית העליון). מומלץ למדידה ישירה של גובה ג'ל באמצעות השיטה המתוארת לעיל.
    3. לאפשר ג'ל פולימלזציה עבור 30 דקות, ולאחר מכן להסיר את שמיכות העליון בעדינות עם מלקחיים. הוספת 50 mM HEPES pH 8.5 התבשיל יכול להקל על ההסרה. לשטוף עבור 5 דקות ב 50 mM HEPES pH 8.5 שלוש פעמים.
  5. מטריצה הידרוג'ל וציפוי מטריצות
    1. הפעל את משטח ההידרוג'ל על-ידי דגירה ב 0.4 מ"מ Sulfo-SANPAH (sulfoסוכות cinimidyl 6-(4 '-azido-2'-ניטרופניאמינו) הקסאנואט ב 50 מ"מ HEPES pH 8.5. לחשוף מיד למנורת קשת UV באזור סגור.
      הערה: הגנה על SULFO-sanpah מאור לפני ההפעלה. עבור מנורת 400 W, מיקום ג'ל 10 ס מ מן הנורה בתוך תיבת האור ולהאיר עבור 100 s. הפתרון Sulfo-SANPAH ישתנה מכתום בהיר לחום כהה.
    2. לשטוף עבור 5 דקות ב 50 mM HEPES pH 8.5 שלוש פעמים.
      הערה: ניתן לאחסן ג'ל רטוב ב -4 ° c עד שבוע אחד.
    3. מודלת את ההידרוג'ל שהופעל ב -20 μg/mL fibronectin ב 50 mM HEPES pH 8.5 עבור 1 h ב 37 ° c.
    4. מפחית את תמיסת הפילברון ומכבסת 5 דקות בתמיסת מלח (PBS) שלוש פעמים. לחטא את ההידרוג'ל ואת המכסה של המנה עבור 15 דקות תחת אור UV במכסה של תרבות רקמה עם נפח נמוך של PBS. שטוף פעם אחת. בערוץ הPBS הסטרילי
      הערה: ניתן להשתמש בסוגים אחרים של חלבון ecm לתפירת ההידרוג'ל, כולל קולגן ומלמינציה.

2. ציפוי תאים

  1. הוסף 3 מ ל של מדיה המכילה 21,000 תאים כדי למלא צלחת 60 מ"מ עבור צפיפות התא הסופי של ~ 1000 תאים/cm2. התאימו את צפיפות הזריעה בהתאם לצורך, כדי למנוע את הצפיפות ולאפשר תנועה חופשית של תאים בודדים.
  2. אפשר לתאים להתאושש ב-37 מעלות צלזיוס ללפחות 4 שעות עד 18 שעות לפני ההדמיה. התכונן לדימות על ידי שטיפה עם מדיית דימות פעמיים לפני הוספת מדיית דימות. אפשר לתאי השפה לעבור לפחות 30 דקות לפני הדמיה.
    הערה: תנאי מדיית המסך מראש כדי לקבוע תנאים שימטב את ההעברה בתא התאים בשימוש. עבור התאים סקוב -3, DMEM זיכרון ללא פנול אדום, המכיל 20 מ"מ HEPES ו 12.5 ng/mL גורם גידול באפידרמיס מעוררת את ההגירה ביותר. תנאים אופטימליים עבור תאים Ref52 הם מאגר של המצלצל עם 10% סרום של שור עוברי (FBS) ו -25 ng/mL-גורם הגדילה הנגזר.

3. הכנת מיקרופיפטה מזכוכית: פיפטה מושך ומנפח

  1. משוך 100 מ"מ ארוך בורוסיליקט זכוכית מיקרופיפטות עם 1.0 מ"מ החיצוני, 0.58 מ"מ קוטר הפנים בתהליך של שני שלבים כדי לקבל להתחדד מעל 2 מ"מ שמפחית ל ~ 50 יקרומטר ב מילימטר הראשון ומרחיב לארוך, מקביל 10 יקרומטר קוטר צינור במילימטר האחרון.
  2. . העמסה משכה לתוך מיקרופורג הצורה pipet יש 15 יקרומטר טיפ הבלית כי הוא מוקף בקצה מאוד של 250 יקרומטר סעיף כפוף בזווית ~ 35 ° משאר pipet. הקוטר המשוער על העיקול צריך להיות סביב 30 יקרומטר כדי להלוות כוח לקצה.
    הערה: להתחדד ומידות עצה ניתן לכוונן כדי להחיל כראוי כוח רצוי (ראה שלב 5). משיכת מיקרופיפטות ב 65 ° c לצעד הראשון במשך 3 מ"מ, ו 60 ° c עבור השלב השני מייצרת את הממדים המתוארים בשלב 3.1. תוצאות באמצעות pipet שונים עשויים להשתנות.
  3. לחטא את המיקרופיפטה ב-70% אתנול לפני השימוש.

4. מיקום המיקרומניפולציה והמיקרופיפטה

  1. להסיר את מכסה הכלים ולטעון את הצלחת על הבמה מיקרוסקופ מרכז. השתמש ביעד הגדלה בגודל 10X או באופן דומה. לכסות את התקשורת עם שמן מינרלי כדי למנוע אידוי של התקשורת.
  2. הכנסת משכה בפיג
    1. הכניסו את הפטה המותפס למעטפת המיקרופיפטה, והצביעו על הקרס לכיוון המנה. קצה הקרס יהיה הנקודה הנמוכה ביותר כאשר הנמיך לג.
    2. הכנס נדן למיקרומניפולציה והתאם עד שהקצה של הפייפט ממורכז מעל העדשה האובייקטיבית בכיוונים של X ו-Y.
    3. הנמך את הדלי באמצעות מניפולטור גס עד שהוא נוגע במשטח הנוזל.
  3. שימוש בניגוד פאזה או ברייטפילד, למקד את המיקרוסקופ על שכבת חרוז בחלק העליון של ג'ל. . זה יהיה מטוס הייחוס
  4. להבטיח כי המטרה היא לא בסכנה להכות את המדגם או הבמה, להביא מיקוד מעל ג'ל כדי למצוא את קצה המיקרופיפטה, באמצעות התאמות קטנות של מניפולטור גס בכיוונים X ו-Y להטיל צללים על המטוס המוקד. רק הנמך את המיקרופיפטה כאשר בטוח שקצהו של הפיידפט נמצא בשדה הראייה.
  5. ודא כי הקצה הקהה של המיקרופיפטה מצביע למטה על-ידי סיבוב העוגה במעטפת או סיבוב הנדן במיקרומניפולציה עד שהקצה ניצב למישור המוקד. חזור על שלבים 4.4 ו-4.5 לפי הצורך. . תתמקד בקצה העוגה
  6. להתמקד בחזרה אל שכבת חרוז העליון של ג'ל כדי למדוד כמה רחוק pipet הוא משטח ג'ל. התמקד בחזרה למישור המהווה חלק בין הג והקצה של הפייפט. הורידו באיטיות את הפייפט כדי להגיע למישור התווך המתווך.
  7. חזור על השלב 4.6 עד שניתן יהיה להעריך את הצללים החלשים מקצה המיקרופיפטה בעת התמקדות בהידרוג'ל. הגדל להגדלה הגבוהה ביותר הבאה.
  8. הנמך את המיקרומניפולציה עד שהצללים והשברים של קצה מאוד של המיקרופיפטה יכולים להיות מוערכים בתוך מטוס מוקד של שכבת חרוז.
  9. הגדילו את ההגדלה לדבר שישמש בניסוי. הורידו את הפייפט עד שהוא מרחף מעל פני המים של ההידרוג'ל.

5. כיול המיקרומניפולציה ויצירת הכוח

  1. בשלב או ברייטפילד, הנמך את מיקרופיפטה הריחוף כדי לגעת במשטח של ההידרוג'ל. שים לב איך הפייפט מסתכל. על מגע עם ההידרוג'ל המשיכו להוריד את המיקרופיפטה ב-Z עד שהתאמות X ו-Y יגרמו למשיכת והטיה של ההידרוג'ל בכיוונים אלה. השתמש במיקרו-כדורים או בתאים הסמוכים כסימני נאמנות.
    הערה: אם המיקרומניפולציה מחוברת לזרוע העבה של השלב או לספסל ולא לשלב המדגם עצמו, יש לנתק תמיד את הג לפני הזזת הבמה כדי להימנע משבירת התאים המקבתיים או המטריד. , אם הפייפט ישבר. חזור לשלב 3 וצעד 4
  2. מצא אזור נטול תאים לעסוק ג'ל. משוך את זה לכל הכיוונים ולהרגיש בנוח עם הדרך מתרגמת המיקרומניפולציה לדפורמציה של ג'ל.
  3. לקחת תמונות פלורסנט של שדה חרוז ללא מניפולציה, עם pipet העוסקים ג'ל, עם pipet מעורב מושך את ג'ל. חזור על זה מספר פעמים לקחת הערות טובות לגבי סימוני השנתות על המיקרומניפולציה, הדרך שבה הקצה הפייפט נראה בשלב או ברייטפילד בכל שלב של משיכה, ומרחק הטיפ זז באמצעות מניפולציה זו.
  4. השתמש imagej כפי שתוארה בעבר16,17 כדי לחשב displacements חרוז יחסי כוח להחיל את החרוזים על ידי השוואת שדה החרוז null לשדה חרוז ללא התחייבות pipet, שדה חרוז עם ג'ל מעורב, ואת ה . משכתי ג'ל
  5. כדי לכוונן את הגירוי הטסטריתי, השוו את יישום הכוח באמצעות מידות עצה מיקרופיפטה שונות, מרחקים מתא, או מרחק שנשלפו על ידי המיקרומניפולציה מנקודת הנחיתה הראשונית. ההשפעה של ממד טיפ מיקרופיפטה ביישום הכוח מעניקה גמישות רבה למשתמש, אך גם ממחישה את הצורך ליצור מפות כוח עבור מיקרופיפטות חדשות, גם כאשר הממדים והצורה דומים מאוד לטיפים מכויל קודם לכן.

6. ניהול שיטת הדורוקוניות

  1. לפני ביצוע הניסוי, לתרגל לטפח את הג ליד תא ולראות את הדפורמציה של התא כאשר המיקרומניפולציה ממקם את מיקומן.
  2. נטר קבוצה של תאים בעלי קוטביות ברורה ונראה שהוא נע במשך 30 דקות כדי לזהות תאים הנעים באופן מונחה.
  3. בחר תא העובר בכיוון יחיד וברור ונטר אותו בקצב המסגרות הרצוי עבור 30 דקות נוספות.
  4. במידה וקביעת הכוחות המופעל על התא או המתח המופעל על ידי התא רצוי, לכידת תמונות שדה חרוז בכל רכישה. אם התא משנה את מסלול הכיוון שלו במהלך הניטור, לבחור תא אחר לפקח כמו זה יהיה קשה לקבוע את ההשפעה של גירוי.
  5. הפעילו את ההידרוג'ל כ-50 יקרומטר מהתא. הצב את המחיית מחמד לפני הצד הקרוב של הקצה המוביל והזז את המיקרומניפולציה כך שהג מעוות ומעוותים לכיוון התא של הנסיעה. לראות את התא לאורך זמן כפי שהוא מגיב הדרגתי, המעבר המקומי של נוקשות.
    הערה: התזמון המסופק כאן הוא יעיל כאשר ניטור SKOV3 או Ref52 פיברותקיעות, אולם, את המרווח ואת הזמן הכולל המסלול צריך להיות מותאם להתאים את סוג התא ואת האירוע הביולוגי להיות נצפתה. אם זיווג עם מיקרוסקופ ניאון, השהה את רכישת פלורסנט מיד לפני שלב 6.5., השתמש בניגוד פאזה או ברייטפילד למיקום מיקרופיפטה ומשוך, והפעל מחדש את רכישת פלורסנט מיד לאחר מכן.
  6. אם הפייפט מחליק או אם המעבר נינוח או משוחרר באופן אחר, מצא תא חדש על-ידי שלבים חוזרים 6.2 ו-6.3.

7. קביעת תגובת ההגירה הדוטוטקטיקה

  1. באמצעות ImageJ19 או תוכנית אחרת לניתוח תמונה, חשב את זווית הסיבוב על-ידי ציור קו בין אמצע הקצה המוביל של התא ב-0 דקות ובין שלושים דקות לצג (המשקף את הנתיב המקורי של התא) ושורה נוספת בין אמצע הקצה המוביל בדיוק לפני ו 80 דקות לאחר גירוי ומדידת הזווית בין שתי השורות האלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

על-ידי הכנת מיקרופיפטות (איור 1) ונרמול דור הכוח של מושך (איור 2 ואיור 3) כפי שמתואר לעיל, זוהו תנאים מיטביים של הדוטקטקטיקה לקווי תאים מרובים. באמצעות טכניקה זו, כפי שמתואר באיור 4, שניהם סקוב-3 בתאי סרטן השחלות17 ו Ref...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפגינו כאן היא מערכת הניתן לשחזור, תא בודד שיטת הפעולה המאפשרת הערכה של היכולת של התא לשנות את התנהגותו הגירה בתגובה רמזים מכניים חריפה. טכניקה זו יכולה לשמש גם בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטית וחלבונים היתוך המתאים או אנלייזרים לבחון את האותות הסלולריים והשלד האירועים בתוך שניות של גיר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

לא.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acrylamide 40 % National DiagnosticEC-810
Ammonium Persulfate FisherBP179-25
BD20A High frequency generatorElectro Technic Products12011A115 V - Handheld Corona Wand
Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (Sigma AldrichM6514
Bis-acrylamide 2% National DiagnosticEC-820
Borosilicate glass capillariesWorld Precision Instruments1B100-4
Branson 2510 Ultrasonic CleanerBransonic40 kHz frequency
Coarse ManipulatorNarshigeMC35A
DMEMCorning10-013-CV
DMEM without phenol redSigma AldrichD5030
Dual-Stage Glass Micropipette PullerNarshigePC-10
Epidermal Growth FactorPeprotechAF-100-15
EthanolPharmco-aaper111000200
Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)GibcoA31606-02
Fibronectin EMD MilliporeFC010
Fluospheres Carboxylate 0.2 um InvitrogenF8810, F8807, F8811
Fugene 6Roche18150911.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish
Glacial Acetic AcidFisher ChemicalA38SI-212
Glass Bottom DishCellVisD60-60-1.5-N
Glass CoverslipElectron Microscopy Sciences72224-0122 mm, #1.5
HClJT Baker9535-03
Hellmanex III Special cleaning concentrateSigma AldrichZ805939Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips
HEPES powderSigma AldrichH3375Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5
Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood LightUviton InternationalUV0338
IsopropanolFisher ChemicalA417-4
MicroforgeNarshigeMF900
MicromanipulatorNarshigeMHW3
Mineral OilSigma AldrichM5904
Nanopure Life Science UV/UF SystemBarnsteadD11931ddH2O
Nikon Eclipse TiNikon
OptiMEMInvitrogen31985062
Parafilm MBemis Company, IncPM-992
PBS139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4
Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)Sigma AldrichP4056
Ref52Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS
Ringer's Buffer134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4
SKOV-3American Type Culture CollectionCulture in DMEM + 10% FBS
Sulfo-SANPAH Covachem 12414-1
Tabletop Plasma CleanerHarrick PlasmaPDC-32G
TEMED Sigma AldrichT9281-50

References

  1. Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
  2. Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
  3. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  4. Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
  5. Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
  6. Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
  7. Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
  8. Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
  9. Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
  10. Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
  11. Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949(2015).
  12. Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
  13. Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
  14. Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107(2012).
  15. Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. 3rd Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
  16. Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
  17. McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228(2018).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  20. McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552(2011).
  21. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
  22. Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
  23. Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150durotaxis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved