細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ

要約

機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。

要約

デュロタキシスは、細胞が緊張の勾配を感知し、応答するプロセスです。このプロセスをインビトロで研究するためには、細胞の下にある基板の剛性を操作する必要があります。等級付き剛性と長期移行アッセイを有するヒドロゲルは、デュロタキシス研究に有用であることが証明されているが、基板張力の局所的変化に対する即時かつ急性応答は、個々の細胞運動および細胞内シグナル伝達事象の集中的な研究を可能にする。細胞が基礎となる基板剛性を感知し応答する能力を繰り返しテストするために、変形可能なヒドロゲル上で培養された個々の細胞に対する高い張力の急性勾配を適用するための改変方法が使用され、リアルタイムを可能にする。問題の細胞に付与された剛性勾配の強さと方向の操作。さらに、マイクロピペットの形状や寸法、適用された勾配の相対的な位置、配置、方向など、アッセイの詳細とパラメータを微調整することにより、アッセイを機械的に任意の研究に最適化することができます。敏感な細胞のタイプおよびシステム。これらのパラメータは、適用された刺激を確実に変更し、アッセイの機能性および汎用性を拡張するように変更することができる。この方法は、剛性の変化に応じて、長期的なデュロタクティック運動だけでなく、細胞シグナル伝達と形態学的ダイナミクスのより即時の変化の両方を調べることができる。

概要

過去数十年にわたり、細胞環境の機械的特性の重要性は、細胞生物学における認知度を高めています。異なる組織と細胞外マトリックスは、異なる相対的な剛性を有し、細胞が体全体に移動するにつれて、これらの変化をナビゲートし、これらの機械的特性を使用して1、2、3を導く^,4,5,6,7.細胞は、発達、創傷治癒、癌転移などのプロセス中に、所定の組織の剛性を使用して、その動態を知らせます。しかし、これらの機械的入力に対する感覚および応答を可能にする分子機構は、ほとんど未知のまま^{である1,2,3,4},^5,6,7.

細胞が物理的な環境的手がかりに反応するメカニズムを研究するためには、付着細胞の下にある基板の剛性または剛性を操作する必要があります。2000年、Chun-Min Lo、Yu-Li Wangたちは、機械的手掛かりを変化させる個々の細胞の動体応答を、変形可能な細胞外マトリックス(ECM)コーティングされたポリアクリルアミドを伸ばすことによって直接試験することができる^{アッセイ8}を開発した。細胞がめっきされたヒドロゲル。細胞は、より硬い基板に向かって移動するための重要な好みを示す, 彼らは「デュロタキシス」と呼ばれる現象.

2000年の最初の報告以来、デュロタキシスの研究のために他の多くの技術が採用されています。急な剛性勾配は、ポリスチレンビーズ9や剛性ポリマーポスト10などの剛性特徴にゲルを鋳造するか、ガラスカバー^{スリップ11}の縁の周りの基板を重合することによって、機械的な'を作成することによって製造されています。ステップ境界'。あるいは、浅いが固定剛性勾配を持つヒドロゲルは、マイクロ流体デバイス12、13^または並んでヒドロゲル溶液液滴によって作成された架架カーの勾配などの様々な方法によって製造されている異なる剛性8、または線形剛性勾配14、15を作成するために等級付きUV光露光で処理された光反応性架リンカー^を有するヒドロゲル。これらの技術は、時間の経過とともに一斉に二次的に起因するデュロタクティック細胞運動を調査するために大きな効果を使用されてきた。しかし、通常、これらの特徴は細胞めっきの前に製造され、その特性は実験の過程で一貫したままであり、機械的勾配のサンプリングのためにランダムな細胞運動に依存します。これらの技術のいずれも、急性機械的刺激に応答して細胞行動の急速な変化を観察することは好適ではない。

機械的環境の急激な変化に対する細胞応答を観察するために、単細胞デュロタシスアッセイはいくつかの利点を提供する。これらのアッセイでは、個々の細胞は、ガラスマイクロピペットで細胞から基底基板を引き離すことによって急性の機械的刺激を与えられ、それによって細胞マトリックス張力の方向勾配を導入する。その後、移動の速度や方向などの動きの変化は、生細胞位相コントラスト顕微鏡によって観察されます。このアプローチは、機械的刺激と細胞移動との間の原因と効果の関係を直接観察することを容易にし、緊張勾配の方向と大きさの迅速かつ反復的な操作を可能にし、結果的に評価するリアルタイムで細胞応答。また、この方法は、蛍光融合タンパク質またはバイオセンサを発現する細胞を機械的に刺激し、機械化に関与していると疑われるタンパク質の量、活性、または細胞内局在の変化を可視化するためにも用いることができる。デュロタキシス。

この技術は、デュロタシス8、16を研究するグループによって採用されており、SKOV-3卵巣癌細胞の不作法挙動および分子機構を研究するためにハウ研究所によって適応されたとして、ここで説明されています。下デュロタシス¹⁷.さらに、細胞培養表面の近くに蛍光微小球の単一の層を有するヒドロゲルの製造のための修飾方法が記載されている。これはマイクロピペットによって発生した株の勾配の視覚化および最適化を促進し、牽引力顕微鏡による細胞収縮性の評価を可能にするかもしれない。

プロトコル

1. 埋め込み蛍光微小球を用いた変形性ポリアクリルアミドヒドロゲルの製造

注:方向は、直径22μm、厚さ約66μmの25kPaヒドロゲルの重合を表します。これらのパラメータのそれぞれまたはすべてが変更でき、そのための指示は表 1およびノート¹⁷にあります。

1. ガラス底皿またはカバースリップの活性化
   1. ガラス底イメージング皿またはライブセルイメージングチャンバに収まるカバースリップの活性化のためのバインドシラン作業溶液を準備します。950 μLの950 μL、氷河酢酸の50μL、および5μLの結合シラン(y-メタクリルキキシプロピルトリムトキシシラン)を混合します。
      注:トップカバースリップと比較して大きなボトムカバースリップを使用すると、ゲルを準備する際に作業する余地が追加され、後の手順でガラスマイクロピペットの位置を容易にします。また、ガラス底面撮像皿ではなくカバースリップを使用する場合は、次のセクションで説明するようにカバースリップを清掃してください。
   2. コロナの杖でガラスの表面を20sに活性化し、直ちにバインドシラン作業液の50 μLをオーバーレイします。溶液を10分間乾燥させます。
   3. 95%エタノールで2回、イソプロパノールで2回、カバースリップを約20分間エアドライにします。
      注:活性ガラスは、デシケータで最大1週間保存することができます。
2. クリーニングトップカバースリップ
   1. 22mmのトップカバーを70°Cで2%HClで30分間インキュベートし、ddH₂Oで10分間2回洗浄します。
   2. カバースリップを2%のクベット洗浄濃縮物の溶液中で30分間50°Cで50°Cでインキュベートし、その後ddH₂Oで10分間2回洗浄する。
   3. dH2 Oでカバーリップを90°Cで30分間インキュベートし、70°Cで70°Cで10分間、その後60°Cで空気乾燥を2時間以上行います。
      注:きれいなカバーリップはきれいなデシケーターで無期限に貯えることができる。
3. 蛍光微小球/ビーズの上のカバースリップ
   1. 超音波水浴で1時間の蛍光微小球のストック溶液を超音波処理します。ビーズストック1:200を100%エタノールで希釈し、1時間再び超音波処理することにより、働くビーズ溶液を作ります。
   2. ビーズ溶液が超音波処理を終了する15分前に、セラミックカバースリップホルダーに垂直に置き、卓上プラズマクリーナーで3分間ルームエアプラズマで処理することにより、カバースリップを徹底的にきれいにします。
   3. 取り扱いを容易にし、後続のステップの間にカバースリップの滑りを防ぐために、60 mmペトリ皿のふたまたは同様の容器にパラフィルムの一部を置きます。カバースリップをスタビライザーに入れ、軽く下にタップし、パラフィルムとカバースリップの間に良好な接触を確保します。
   4. 22 mm カバースリップの場合は、作業ビーズ溶液の 150 μL をカバースリップの上部に追加します。直ちにカバースリップの側面からエタノール溶液を吸引し、ビーズをカバースリップに残します。カバースリップをエアドライにします。
      注:追加された作業ビーズ溶液の量は〜4 μL/cm²で、任意のサイズのカバースリップに対応するようにスケーリングできます。
4. 埋め込み蛍光ビーズを使用したヒドロゲルの鋳造
   1. アクリルアミド及びビスアクリルアミドのヒドロゲル溶液を調製する。表 1に従って溶液を混合し、10% APS の 2.5 μL と TEMED の 0.5 μL を追加します。よく混ぜる。直ちに次のステップに進みます。
      注:ヒドロゲル溶液混合物は、表1に示すようにアクリルアミドとビスアクリルアミドの比率を変化することにより、ヒドロゲルのヤングの係数、または剛性を変化させるために変更することができる。これらの値は、原子間力顕微鏡を用いたハウ研究室での使用が確認されているが、施設内で確認されるべきである。
   2. ヒドロゲル溶液を作った直後に、ガラス底皿または底面スリップの活性側に25μL滴を加え、直ちにビーズコーティングされたカバースリップを溶液の上に置き、ビーズ側を下に置きます。カバースリップの反対側にドロップを接触させ、その後にゆっくりと下げると、ヒドロゲル内の気泡を捕捉するのを避けるのに役立ちます。
      注:ヒドロゲルの高さは、後の実験で使用する対物レンズの作業距離内に十分にあるべきである。66 μmのヒドロゲルの高さはほとんどのシステムのためによく働く。ヒドロゲルの大きさは、カバースリップの大きさに応じて多かれ少なかれヒドロゲル溶液を添加することによってスケーリングすることができる。ヒドロゲル溶液の適切な体積を計算するには、シリンダの体積の方程式を使用し、V = πr2hを使用して、rがカバースリップ半径であり、hが所望のヒドロゲル高さである。 通常、この計算は、上部と下部の両方にビーズコーティングされたカバーリップを持つゲルを調製し、共焦点顕微鏡を使用して2つのビーズ平面間の距離を測定することによって測定されるヒドロゲルの実際の高さを公正な精度で予測します。しかし、ヒドロゲルの実際の高さは±20μm(例えば、トップガラスカバースリップの厚さと製造元によって異なります)によってこの計算から逸脱する可能性が観察されています。上記の方法を用いてゲル高さを直接測定することを推奨する。
   3. ゲルを30分間重合させ、鉗子でトップカバースリップをそっと取り除きます。皿に50 mM HEPES pH 8.5を加えることは取り外しを容易にできる。50 mM HEPES pH 8.5を3回5分間洗浄します。
5. ヒドロゲル活性化および細胞外マトリックスコーティング
   1. 0.4mMスルフォ-SANPAH(スルホシュチニミジル6-(4'-azido-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエートでインキュベートしてヒドロゲル表面を活性化します。囲まれた領域の UV アーク ランプに直ちに公開します。
      注:活動化前にスルフォ-SANPAHを光から保護します。400 W ランプの場合は、電球から 10 cm 離れた場所にゲルを配置し、100 s に点灯します。Sulfo-SANPAH ソリューションは、明るいオレンジ色から濃い茶色に変わります。
   2. 50 mM HEPES pH 8.5を3回5分間洗浄します。
      注:水和ゲルは、最大1週間4°Cで保存することができる。
   3. 活性化ヒドロゲルを20 μg/mLフィブロネクチンで50mM HEPES pH 8.5で37°Cで1時間インキュベートします。
   4. フィブロネクチン溶液を吸引し、リン酸緩衝生理食べ物(PBS)で5分間洗浄する。PBSの少量の組織培養フードでUV光の下で15分間ヒドロゲルと皿の蓋を殺菌します。無菌のPBSで一度洗います。
      注:他のタイプのECMタンパク質は、コラーゲンおよびラミニンを含むヒドロゲルをコーティングするために使用することができる。

2. めっき細胞

1. 21,000個を含む培地を3mL加え、60mm皿を充填し、最終的な細胞密度を〜1000セル/cm2にする。必要に応じてシード密度を調整して、混雑を防ぎ、個々の細胞の自由な移動を可能にします。
2. 細胞が少なくとも4時間、イメージング前に最大18時間37°Cで回復できるようにします。イメージング メディアを追加する前に、イメージング メディアを 2 回すすいでイメージングの準備をします。細胞がイメージングの前に少なくとも30分間平衡化できるようにします。
   注: あらかじめメディアの状態をスクリーニングして、使用しているセルラインのマイグレーションを最適化する条件を決定します。SKOV-3細胞の場合、フェノール赤色を含まないDMEMは、20mM HEPESおよび12.5 ng/mL表皮増殖因子を含有し、最も多くの移動を刺激する。Ref52細胞の最適な条件は、10%の胎児ウシ血清(FBS)および25 ng/mL血小板由来成長因子を持つリンガーのバッファーである。

3.ガラスマイクロピペットの調製:ピペット引っ張りと鍛造

1. 100 mm の長いホウケイ酸塩ガラスマイクロピペットを 2 段階のプロセスで 1.0 mm の外部と 0.58 mm の内部直径を 2 段階のプロセスで引き出し、最初のミリメートルで約 50 μm に減少し、最後のミリメートルで長く平行な 10 μm の直径チューブまで伸びる 2 mm 以上のテーパを取得します。
2. 引っ張ったピペをマイクロフォージに積み込みます。ピペットをシェイプして、250 μm セクションの最後に囲まれた 15 μm の鈍い先端を、ピペットの残りの部分から約 35° の角度で曲げます。曲げでおおよその直径は、先端に強度を貸すために約30 μmでなければなりません。
   注:テーパと先端の寸法は、必要な力を適切に適用するように調整できます(手順 5 を参照)。3 mm の最初のステップで 65 °C でマイクロピペットを引っ張り、2 番目のステップでは 60 °C はステップ 3.1 で説明する寸法を生成します。異なるピペトプーラーを使用した結果は異なる場合があります。
3. 使用前に70%エタノールでマイクロピペットを殺菌してください。

4. マイクロマニピュレータとマイクロピペットの位置決め

1. 皿のふたを取り外し、皿を顕微鏡の段階と中央にロードします。10倍または同様に低倍率の目的を使用します。メディアの蒸発を防ぐために、メディアを鉱物油で覆います。
2. プルピペを挿入する
   1. 引っ張られたピペットをマイクロピペットシースに挿入し、フックを皿に向けます。フックの先端は、ゲルに下げると最も低い点になります。
   2. シースをマイクロマニピュレータに挿入し、ピペットの先端がX方向とY方向の両方の対物レンズの上に中央に配置されるまで調整します。
   3. 粗いマニピュレータを使用してピペを下にして、液体の表面に触れるまで下げます。
3. 位相コントラストまたはブライトフィールドを使用して、ゲル上部のビーズ層に顕微鏡を集中します。これは参照面になります。
4. 目的がサンプルまたは段階に当たる危険がないことを確認し、焦点面に影を落とすためにXおよびY方向の粗いマニピタの小さな調節を使用して、マイクロピペットの先端を見つけるためにゲルの上に焦点を合わせます。ピペットの先端が視野にあることが確実な場合にのみ、マイクロピペットを下げます。
5. マイクロピペットの鈍い先端が、シースでピペを回転させるか、先端が焦点面に垂直になるまでマイクロマニピュレータでシースを回転させることによって、下向きであることを確認します。必要に応じて、手順 4.4 と 4.5 を繰り返します。ピペットの先端に焦点を合わせます。
6. ゲルの一番上のビーズ層に焦点を合わせ、ピペがゲル表面からどれくらい離れているかを測定します。ゲルとピペットの先端の間の途中にある平面にフォーカスを合わせます。中間焦点面に到達するためにピペをゆっくりと下げます。
7. マイクロピペットの先端からの非常にかすかな影がヒドロゲルに焦点を当てるときに理解できるまでステップ4.6を繰り返す。次の最高倍率に増加します。
8. マイクロピペットの非常に先端の影および屈折がビーズ層の焦点面内で理解されるまでマイクロマニピュレータを下げる。
9. 実験で使用する倍率を上げます。ヒドロゲルの表面のすぐ上に置くまでピペを下げます。

5. マイクロマニピュレータとフォース生成のキャリブレーション

1. 位相または明るい分野で、ホバリングマイクロピペットを下げ、ヒドロゲルの表面に触れる。ピペがヒドロゲルとの接触をどのように見えるかを観察します。XとYの調整がそれらの方向にヒドロゲルの引っ張りおよび偏向を引き起こすまで、Zのマイクロピペットを下げ続ける。微小球または近くの細胞を受託者マークとして使用します。
   注:マイクロマニピュレータがサンプルステージ自体ではなく位相コンデンサーアームまたはベンチに取り付けられている場合は、ピペや不穏な細胞を壊さないようにステージを動かす前に必ずゲルを外します。ピペが壊れた場合は、ステップ 3 に戻り、ステップ 4に戻ります。
2. ゲルを係合する細胞を欠いている領域を見つけます。すべての方向にそれを引っ張り、マイクロマニピュレーションがゲルの変形に変換する方法で快適に取得します。
3. 操作なしでビーズフィールドの蛍光画像を撮り、ピペがゲルを係合し、従事したピペがゲルを引っ張ります。マイクロマニピュレータの目盛り、ピペットの先端が引っ張りの各段階で位相または明るいフィールドに見える方法、およびその操作を使用して先端が移動する距離に関する良いメモを取って、これを何度か繰り返します。
4. 前述の ImageJを^{使用して、}ピペ状の係合のないビード フィールド、ビード フィールドとゲルを係合して比較することにより、ビードに適用される相対的なビーズ変位と力を計算します。引っ張られたゲル。
5. 張力刺激を微調整するには、異なるマイクロピペット先端寸法、セルからの距離、またはマイクロマニピュレータがタッチダウンの初期点から引っ張った距離を使用して力の適用を比較します。力の適用にマイクロピペットの先端次元の効果はユーザーに大きい柔軟性を与えるが、次元および形が以前に校正された先端によく似ていても、新しいマイクロピペットのための力マップを生成する必要性を示す。

6. デュロタシスアッセイの実施

1. 実験を行う前に、セルの近くでゲルを係合し、マイクロマニピュレータの位置を変更したときにセルの変形を観察します。
2. 明確な極性を持ち、30分間動いているように見える細胞のグループを監視し、方向的に移動している細胞を特定します。
3. 単一の明確な方向に移動しているセルを選択し、さらに30分間、所望のフレームレートでそれを監視します。
4. 細胞に及ぼす力または細胞によって作用する張力の決定が望ましい場合は、各集録時にビーズフィールド画像を捕捉する。細胞がモニタリング中に方向転換を行う場合は、刺激の効果を判断するのが難しくなりますので、監視する別のセルを選択します。
5. ヒドロゲルをセルから約50μm離します。ピペを先端の近辺の前方に配置し、マイクロマニピュレータを動かして、ゲルがセルの移動方向に直交するように動かします。急激な局所的な剛性の勾配に応答するセルを時間の経過とき継ぎください。
   注:ここで提供されるタイミングは、SKOV3またはRef52線維芽細胞を監視する場合に有効ですが、観察される細胞タイプおよび生物学的事象に合わせて間隔および全体的な時間経過を調整する必要があります。蛍光顕微鏡と組み合わせれば、ステップ6.5の直前に蛍光集録を一時停止し、位相コントラストまたはブライトフィールドを使用してマイクロピペットを配置して引き出し、その直後に蛍光集録を再開する。
6. ピペが滑る場合、またはグラデーションが緩和または解放されている場合は、手順 6.2 と 6.3 を繰り返して新しいセルを見つけます。

7. デュロタクティック移行応答の決定

1. ImageJ¹⁹または別の画像解析プログラムを使用して、セルの先頭エッジの中央の間に 0 分と 30 分のポスト モニタ (セルの元の軌道を反映する) と中央の間の別の線の間に線を描画して回転角度を計算します。刺激とこれらの2つのライン間の角度を測定した後、直前と80分の最先端。

結果

マイクロピペット(図1)を調製し、上述したようにプルの力発生を正規化することにより(図2および図3)、複数の細胞株に対して最適なデュロタクティック条件が同定された。この技術を用いて、図4に概説したように、SKOV-3卵巣癌^細胞17およびRef52ラット胚線維芽細胞(図5)<...

ディスカッション

ここで実証されているのは、急性機械的手がかりに応じて細胞の移動挙動を変化させる能力の評価を可能にする、反復可能な単細胞デュロタシスアッセイです。この技術はまた、蛍光顕微鏡および適切な融合タンパク質またはバイオセンサと組み合わせて、機械的刺激の数秒以内に、またはより長いタイムスケールの間に細胞内シグナル伝達および細胞骨格イベントを調べるために使用する?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylamide 40 %	National Diagnostic	EC-810
Ammonium Persulfate	Fisher	BP179-25
BD20A High frequency generator	Electro Technic Products	12011A	115 V - Handheld Corona Wand
Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) (	Sigma Aldrich	M6514
Bis-acrylamide 2%	National Diagnostic	EC-820
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner	Bransonic		40 kHz frequency
Coarse Manipulator	Narshige	MC35A
DMEM	Corning	10-013-CV
DMEM without phenol red	Sigma Aldrich	D5030
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narshige	PC-10
Epidermal Growth Factor	Peprotech	AF-100-15
Ethanol	Pharmco-aaper	111000200
Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot)	Gibco	A31606-02
Fibronectin	EMD Millipore	FC010
Fluospheres Carboxylate 0.2 um	Invitrogen	F8810, F8807, F8811
Fugene 6	Roche	1815091	1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish
Glacial Acetic Acid	Fisher Chemical	A38SI-212
Glass Bottom Dish	CellVis	D60-60-1.5-N
Glass Coverslip	Electron Microscopy Sciences	72224-01	22 mm, #1.5
HCl	JT Baker	9535-03
Hellmanex III Special cleaning concentrate	Sigma Aldrich	Z805939	Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips
HEPES powder	Sigma Aldrich	H3375	Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5
Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light	Uviton International	UV0338
Isopropanol	Fisher Chemical	A417-4
Microforge	Narshige	MF900
Micromanipulator	Narshige	MHW3
Mineral Oil	Sigma Aldrich	M5904
Nanopure Life Science UV/UF System	Barnstead	D11931	ddH2O
Nikon Eclipse Ti	Nikon
OptiMEM	Invitrogen	31985062
Parafilm M	Bemis Company, Inc	PM-992
PBS			139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4
Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB)	Sigma Aldrich	P4056
Ref52			Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS
Ringer's Buffer			134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4
SKOV-3	American Type Culture Collection		Culture in DMEM + 10% FBS
Sulfo-SANPAH	Covachem	12414-1
Tabletop Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-50