JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מבוסס מכניקה כדי לשבש את צומת הפער קונשין 43 ולמדוד את ההשפעה הבאה זה יש על ביומכניקה של אנדותל באמצעות התבוננות של מעקב ומדגיש התרבות.

Abstract

תאי האנדותל הוקמו כדי ליצור מתחים ומלחצים בין-סלולאריים, אך הצמתים הפערים בתפקיד משחקים במתח הבינתאי וביצירת המתיחה כרגע לא ידוע. לכן, אנו מציגים כאן פרוטוקול מבוסס מכניקה כדי לחקור את ההשפעה של הצומת הפער קונשין 43 (Cx43) יש על ביומכניקה אנדותל על ידי חשיפת confluent אנדותל מונולאיירס מCx43 הידוע 2, 5-דיהידרוטסטוסטרון (chalחרוט) ו מדידת ההשפעה המדכא הזה יש על מדידות ומדגיש התרבות. אנו מציגים תוצאות הנציג, אשר מראים ירידה הן מעקב ומדגיש בין התאים תחת מינון כלקון גבוה (2 μg/mL) בהשוואה לשליטה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק Cx43, אלא גם מצמתי פער אחרים, בהנחה שניתן להשתמש במדכא המתאים. אנו מאמינים שפרוטוקול זה יהיה שימושי בתחומים של מחקר כללי וכלי דם ומכניאוביולוגיה.

Introduction

השדה המתייחס לחקר ההשפעות של הכוחות הפיזיים והתכונות המכאניות של הפיזיולוגיה והפתולוגיה של רקמות הסלולר והרקמה מכונה בביולוגיה מכנית1. מספר טכניקות שימושיות שנוצלו באמצעות מכניאולוגיה הן מיקרוסקופ מתח מונאולייר ומיקרוסקופ כוח גרירה. מיקרוסקופ כוח גרירה מאפשר מיחשוב של מסקות שנוצרו בממשק התא-מצע, בעוד מיקרוסקופ הלחץ דופלקס מאפשר מיחשוב של מתחים בין תאיים שנוצר בין תאים סמוכים בתוך מונאולייר2 ,3,4,5,6 תוצאות הניבו מהשיטות הקודמות הציעו כי מדגיש מכני סלולרי לשחק תפקיד מכריע בקביעת גורלם של שורה של תהליכים סלולריים3,4,5. לדוגמה, בעת חשיפה לכוח מכני חיצוני, קבוצה של תאים העוברים כקולקטיב יכולה לשנות את המבנה שלהם ואת הצורה שלהם כדי ליישר ולהעביר לאורך כיוון הכוח המוחל על ידי, בין השאר, הפקת מעקב7, שמונה. Tractions מספקים מדד שניתן להשתמש בו להערכת כושר התאים ומחושבים באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM). מיקרוסקופ כוח המתיחה (tfm) מתחיל עם הנחישות של המצע המושרה תאים דפורמציות ואחריו את החישוב של שדה המתיחה באמצעות מתמטית קפדנית, מכניקה מבוססי גישה חישובית. מאז היכולת לחשב תיחות כבר סביב די הרבה זמן, החוקרים משתמשים tfm לחשוף את תיחות ההשפעה יש על שורה של תהליכים, כולל סרטן9, פצע ריפוי10 והערכה של הלב מהונדסים . רקמה11

ניתן לחלק את יישום TFM ו-MSM ביחד לשלושה צעדים חיוניים שיש לבצע בסדר הבא: הראשון, הידרוג'ל דפורמציות המיוצרים על ידי התאים נקבעים; שנית, העקבות משוחזרים מתוך דפורמציות הידרוג'ל; ושלישית, גישה לאלמנט סופי משמשת לחישוב מתחים נורמליים ולהטיה בין-תאיים בתוך המונאולייר כולו. כדי לחשב את ג'ל displacements, תמונות הזריחה חרוז עם תאים הושוו עם תמונה חרוז התייחסות (ללא תאים) באמצעות מותאם אישית כתוב חלקיקים התמונה (PIV) השגרה. הקשר בין גודל חלון מתאם חפיפה עבור ניתוח PIV נבחרו להיות 32 x 32 פיקסלים ו 0.5, בהתאמה. בשלב זה, משמרות פיקסל הומרו מיקרון על ידי הכפלת עם מקדם פיקסל מיקרון המרה (עבור המיקרוסקופ שלנו, גורם ההמרה הזה הוא 0.65) כדי להשיג displacements המטוס. שגיאות המשויכות להתעלמות מdisplacements מחוץ למישור הן12,13. לאחר חישוב של ג'ל displacements, ישנם שני סוגים של מדידות המתיחה שיכול להיות מנוצל, הפרשות מוגבלו תיחות בלתימוגבל 8,14. תיחות לא מוגבל לספק את שדה המתיחה עבור השדה כולו של התצוגה (כולל אזורים עם וללא תאים), בעוד תיחות מוגבלת לספק את שדה המתיחה רק עבור אזורים הכוללים תאים14. לאחר מכן, הלחצים הבין-סלולאריים מחושבים באמצעות מיקרוסקופ לחץ מונאולייר (MSM), שהוא הרחבה של מיקרוסקופ כוח המתיחה. יישום ה-MSM מבוסס על ההנחה כי הפרשות המקומיות שהופעלו על ידי מונאולייר של תאים בממשק התא-מצע חייבים להיות מאוזנים על ידי כוחות מכניים ששודרו בין תאים בממשק תא התא כפי שדרש חוקי ניוטון7 ,12,13. ההנחה המפתח כאן היא כי המונרוייר התא יכול להיות מטופל כמו סדין אלסטי דק כי התפלגות המתיחה במונאולייר ידוע ומאזן הכוח אינו תלוי במאפייני חומר התא. ההנחה המפתח הנוסף היא כי כוחות המתיחה מאוזנים על ידי מדגיש בין הסלולר המקומי בתוך השדה האופטי של השקפה (בתוך המונאולייר) ואת ההשפעה של מאזן כוח זה הוא מינימלי באזור המרוחק (מחוץ המונאולייר)13. לכן, תנאי הגבול שהוגדרו על-ידי הלחצים הבינתאיים, הdisplacements, או שילוב של שניהם בגבול המונאולייר הינם חיוניים לביצוע MSM-13. בהתחשב במידע הנ ל, אנו משתמשים ב-MSM כדי לבצע ניתוח אלמנט סופי (פמ) כדי לשחזר את המתח העיקרי המקסימלי (σmax) והלחץ העיקרי מינימלי (σmin) על ידי סיבוב מטוס הלחץ בכל נקודה בתוך ה דופלקס. מדגיש אלה משמשים לאחר מכן כדי לחשב את ממוצע 2d המתח הבין-סלולארי נורמלי [(σmax + σmin)/2] ו-2d להטות מקסימום מתח התרבות [(σmax -σmin)/2] בתוך כל המונאולייר כולו 12,13. הליך זה מתואר ביתר פירוט על-ידי tambe et al.12,13

מיקרוסקופ מונאולייר לחץ (MSM) מאפשר חישוב של מדגיש תאי תא בתא שנוצר בתוך מונאולייר6,7,8,12,13. אלה מדגיש התרבות הוצעו להיות חשובים לצמיחה רקמות ותיקון, הפצע ריפוי, סרטן גרורות12,15,16,17. בנוסף, הוצעו מתחים בין-סלולאריים להיות חשובים גם בהעברת תאים אנדותל ובפונקציית המכשול האנדותל17,18. בעוד שצמתים בתאי תא כגון צמתים הדוקים וצמתים מדומה, שניהם הוצעו לשחק תפקיד קריטי ביצירת מתח בין התאים הבינתאיים ושידור, התפקיד של צמתי הפער נשאר חמקמק. הפער בצמתים לחבר את התאים הסמוכים ולספק מסלול עבור זרם חשמלי ומולקולות (ב< 1 kda) לעבור בין תאים שכנים19,20,21. למרות התאים האנדותל אקספרס Cx37, Cx40, ו Cx43 הפער צמתים19,22, Cx43 הוא ללא ספק החשוב ביותר במונחים של התקדמות המחלה23. ראיות של חשיבות Cx43's ניתן למצוא בעובדה כי מחיקה גנטית של Cx43 בעכברים תוצאות לחץ דם24 ויש לו השפעות שליליות על אנגיוגנזה25. בנוסף, Cx43 תועד להיות חשוב עבור הגירה תא והתפשטות ובהתקדמות של טרשת עורקים18,22,23,24,25 .

בפרוטוקול זה, השתמשנו ב-TFM ו-MSM כדי לחקור אם המתיחה ויצירת הלחץ הבין-תאי בתוך הקשר, היתה מושפעים מהפרעה לצומת הפער האנדותל Cx43. אנחנו שיבשו Cx43 עם 2, 5-דיהידרוטסטוסטרון (chalחרוט), מולקולה מתועדת לעכב Cx43 ביטוי26. Chalcone שימש לשבש Cx43 במקום siRNA כמו chalcone כבר דיווחו בעבר על ידי לי et al. כדי לשבש את ביטוי Cx4326. בנוסף, התעניינו במיוחד בהשפעת הצ על האנדותל כפי שהיא גם דווחה כתרכובת אנטי-דלקתית ואנטי-טסיות שעלולה לשמש למניעה וטיפול בכלי דם שונים פתווגיות26. טיפולים chalcone בוצעו כשעה לאחר הופעת הניסוי, החלב שטופלו monolayers היו תמונות עבור סך של שש שעות, עיבוד תמונה בוצעה עם קוד מותאם אישית כתוב MATLAB כדי לקבוע מעקב ולאחר מכן התרבות דגיש. התוצאות שלנו הראו ירידה כוללת של מתחים והלחצים הבינתאיים, הרומז Cx43 ממלאת תפקיד מרכזי בביומכניקה של האנדותל.

Protocol

1. ייצור ג'לים פוליאקרילאמיד (פי אי)

  1. הכנת צלחת פטרי
    1. להכין את הפתרון לאגד silane על ידי ערבוב 200 mL המים אלקטרופורזה עם 80 μl חומצה אצטית 50 μl של 3-(טרימתאוקסיסילקסיל) פרופיל מתיונין. Bind silane הוא פתרון המשמש לתפקד בתחתית הזכוכית משטח צלחת פטרי עבור הידרוג'ל מצורף.
    2. מערבבים את הפתרון לאגד silane על צלחת מהומה עבור לפחות 1 h.
    3. לטפל היטב במרכז צלחת פטרי עם פתרון לאגד silane עבור 45 דקות.
    4. הסר את הפתרון bind silane ולשטוף את צלחת פטרי עם מים אולטרה טהור 2x-3x.
    5. נגב את משטח הצלחת פטרי ואחסן בטמפרטורת החדר לשימוש עתידי.
  2. הכנת תמיסת הידרוג'ל
    1. מערבבים מים אולטרה טהורים, 40% אקרילאמיד, ו 2% bis-אקרילאמיד ב 15 מ ל שפופרת צנטריפוגה לפי לוח 1.
    2. הוסף 80 μL של חרוזי פלורסנט לפתרון ההידרוג'ל.
    3. לטלטל בעדינות את הצינור כדי לערבב חרוזים עם התמיסה ג'ל.
    4. הדקו בקלילות את מכסה הצינור בשפופרת הצנטריפוגה והניחו בתוך תא ריק.
    5. דגה את הפתרון ג'ל עבור לפחות 45 דקות בחדר ואקום.
  3. הידרוג'ל פולימוניזציה
    1. ראשית, להוסיף 75 μl של 10% אמוניום פרסולפט (מומס במים אולטרה טהור) ולאחר מכן להוסיף 8 μl של temed (n, n, n ', n'-טטרמתיונין-1, 2-diamine) לפתרון הידרוג'ל.
    2. מניחים 24 μL של תמיסת הידרוג'ל במרכז צלחת פטרי (ראו טבלה 2).
    3. השתמש שמיכות 18 מ"מ כדי לשטח את ההידרוג'ל. זה ייתן גובה של ~ 100 μm.
    4. המתן לפחות 30-40 דקות עבור ג'ל פולימור.
    5. יש לטבול את ההידרוג'ל הפילמור במים טהורים במיוחד כדי למנוע התייבשות ג'ל.
    6. מכסים את צלחת פטרי עם רדיד אלומיניום כדי למנוע הלבנת של חרוזי פלורסנט ולאחסן ב -4 ° c.
      הערה: הידרולים ניתן לאחסן תקופה של עד 3 חודשים, אבל זה הציע כי ג'לים אלה להיות בשימוש לא יותר משבוע 1 לאחר הייצור כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.

2. תרבית תאים

  1. תרבות הטבור האנושית תאים אנדותל (HUVECs) בתרבות התא בינונית 200 (ראה טבלת חומרים) שיושלם עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין על 0.1% ג'לטין מצופה מבחנות ב 37 ° צ' ו 5% CO2.

3. הכנה לסטנסיל מיקרותבנית

  1. לרפא שכבה דקה של polydiמתיל siloxane (PDMS) בצלחת פטרי 100 מ"מ על ידי ערבוב בסיס הסיליקון עם הסוכן לריפוי סיליקון ביחס של 20:1 (בסיס: ריפוי הסוכן).
    הערה: ניתן להשתמש בבסיס אחר כדי לרפא יחסי סוכן (ex. 10:1 או 30:1). עם זאת, בסיס נמוך יותר לריפוי יחס הסוכן תניב דפוס התפר, בעוד בסיס גבוה יותר לריפוי יחס הסוכן יפיק דפוס רך יותר.
  2. הכינו 20:1 (בסיס: ריפוי הסוכן) PDMS פתרון ולערבב בקפידה בתוך שפופרת צנטריפוגה mL 50. הפוך את הצינור הפוך וטלטל מספר פעמים במרץ כדי להבטיח ערבוב נכון של פתרון PDMS, כמו ערבוב לא אחיד יגרום לפילמור שלמים.
  3. הסרת בועות שהוצגו מהשלב שלעיל על ידי תפרידו הפתרון PDMS עבור 1 דקות ב 190 x g.
  4. יוצקים 5-6 mL של פתרון PDMS במרכז של 100 מ"מ צלחת פטרי מתפרעים את המנה עד הפתרון PDMS מכסה את פני השטח של צלחת פטרי כולה.
  5. לרפא את פתרון PDMS לילה ב 50-60 ° c. ניתן גם לרפא את PDMS בטמפרטורת החדר.
  6. הסר מעגלי, 16 בקוטר מילימטר PDMS עם מנקב חור.
  7. השתמש בניקוב ביופסיה כדי ליצור חורים קטנים בסטנסיל של PDMS. פרוטוקול זה משתמש בפונץ ' ביופסיה בקוטר 1.25 מ"מ.
  8. לחטא סטנסילים pdms על ידי הראשון שוקע יזוג אותם ב 70% אתנול עבור 2-3 דקות, להוריד את האתנול עודף ולאחר מכן הצבת תחת אור UV עבור 5 דקות.

4. כיסוי קולגן-I הידרוג'ל

  1. הסירו את הכיסויים מההידרוג'ל. והוציאו נוזלים מכל נוזל עודף
  2. הצב את הסטנסיל של PDMS על משטח ההידרוג'ל.
    הערה: ניתן להשתמש בפינצטה כדי להחיל לחץ קל על סטנסיל PDMS כדי להבטיח חותמת מים הדוקה בין הסטנסיל של PDMS לבין משטח הידרוג'ל. הסטנסילים שלנו PDMS הם מים הדוקים ובכך למנוע גישה למים בין המשטח ג'ל העליון ו-PDMS משטח התחתון של הסטנסיל. כמו כן, אין צורך לכוונן את קשיות ההידרוג'ל ביחס לנוקשות של PDMS.
  3. לכסות את משטח ההידרוג'ל עם sulfoסוכות-6-(4-azido-2-ניטרופנימימינו) הקסאנואט (sulfo-SANPAH) הומס a 0.1 M PES (4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazineethfonic חומצה) מאגר פתרון בריכוז של 1:1000 ומקום תחת UV מנורה (power 36 W) עבור 8 דקות.
  4. משטיפות את sulfo-sanpah ואת הפתרון hepes ולשטוף את ההידרוג'ל פעמיים עם 0.1 M hepes ואחריו שני טיפות נוספים עם מים אולטרה טהורים.
  5. מנושף את עודפי המים האולטרה-טהורים והידרו-מעילים עם 0.1 מ"ג/mL קולגן-אני לילה ב 4 ° c.
  6. כסו את הכלים והגנו על חרוזי פלורסנט מתוך פוטוהלבנה.
    הערה: סטנסילים מסוימים של PDMS משמשים ליצירת מונואולאיירס מיקרותבנית. מיקרופולנה monolayers מנוצלים כפי שהם מאפשרים monolayers מרובים של הגיאומטריה ומימדים זהה להיות נצפה בו זמנית במהלך כל ניסוי. עם זאת, מיקרודפוסים לא להיות רצוי השלבים לעיל יכול להיות בעקבות למעט שלב 4.2.

5. יצירת HUVEC monolayers על הידרוג'לים

  1. השתמש ב-1x טריפסין כדי לנתק תאים מצלוחיות של תרבית רקמות עבור 3-5 דקות בחממה.
  2. לאחר טריזיסיזציה, הוסיפו את מדיית תרבות התא לטריפסין והוסיפו לצינור הצנטריפוגה של 15 מ"ל.
  3. צנטריפוגה את פתרון התא עבור 3 דקות ב 1710 x g. קטן, גלולה לבנה של תאים צריך להיות גלוי בתחתית הצינורית צנטריפוגה.
  4. מזף את הסופר ומשהה את התאים החוזרים במדיה לריכוז של 50 x 104 תאים/mL.
  5. הסרת קולגן-I מן ההידרוג'ל ולשטוף 1x עם PBS.
  6. הוסף 75 x 103 תאים לחלק העליון של הסטנסיל pdms ולאפשר לתאים לצרף למשטח ההידרוג'ל עבור לפחות 1 h בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  7. הסר את סטנסיל PDMS והוסף לפחות 2 מ ל של מדיה לצלחת פטרי. להטביע את הסטנסיל PDMS ב-10x טריפסין כדי להסיר את כל התאים המחוברים ולעקר על ידי ריסוס עם 70% אתנול ולאחר מכן הצבת תחת אור UV עבור 5 דקות.
  8. מניחים את צלחת פטרי בחממה ולחכות לפחות 36 h או עד מונאולייר שוטפת נצפתה.

6.2, 5 הטיפול הדהידרוקסילקונוס לשיבוש Cx43

  1. התמוססות 2, 5 דיהידרוטסטוסטרון (chalחרוט) ב dimethylsulfoxide (DMSO) כדי לבצע פתרון מניות 0.1875 mg/mL.
  2. לדלל את הפתרון מניות עם מדיה תרבות התא כדי להפוך ריכוז chalcone נמוך (0.2 μg/ml) סדרת מחלקים ו ריכוז chalcone גבוה (2 μg/ml) סדרת מחלקים.

7. רכישת נתונים

  1. אתר את איי התאים עם מיקרוסקופ.
  2. לרכוש ניגודיות שלב ותמונות חרוז למבנה התא התמונה הידרוג'ל displacements, בהתאמה.
    הערה: פרוטוקול זה השתמש במטרה 10x לרכישת נתונים.
  3. בסוף הניסוי, ניתוק תאים בעזרת טריפסין 10x ולרכוש תמונה של משטח ג'ל ללא תאים (תמונת ייחוס).

8. כתמים חיסוני

  1. תקן monolayers עם 4% פורמלדהיד ו-דגירה ב 37 ° c עבור 15 דקות.
  2. להסיר 4% פורמלדהיד ולהוסיף 0.2% טריטון X-100 עבור 5 דקות ב 37 ° צ' כדי לחדור תאים.
  3. הסר 0.2% טריטון X-100 ולשטוף monolayers עם PBS 2x-3x.
  4. כיסוי מונאולייר עם 2% בסרום (BSA) פתרון עבור 45 דקות ב 37 ° c.
  5. הסר את הפתרון 2% BSA ולשטוף monolayers עם PBS 2x-3x.
  6. הוספת נוגדן Cx43 עיקרי בריכוז של 1:400 למדגם ו-הדגירה הלילה ב 4 ° c.
  7. להסיר את הנוגדן הראשוני לשטוף את המדגם עם PBS 2x-3x.
  8. הוסף נוגדן משני בריכוז של 3:200 ו-דגירה של 2 h ב 37 ° c.
    הערה: יש לכסות דגימות כדי למנוע הלבנה.
  9. להסיר את הנוגדן המשני ולשטוף עם PBS 2x-3x.
  10. מדגם כיסוי עם הרכבה בינונית (פלוררומנט-G DAPI) וחותם עם תגית כיסוי של 18 מ"מ.

9. יישום של מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM) ומיקרוסקופ מונאולייר לחץ (MSM)

  1. חישוב דפורמציה של הידרוג'ל
    הערה: שגרת חישוב של הזחה צעד אחר צעד באמצעות MATLAB ניתנת להלן.
    1. פתח את הקובץ הראשי של המתיחה. m ב- MATLAB (עבור כל רוטינות MATLAB ראה חומרים משלימים).
      הערה: בצע את ההוראות המופיעות בקוד כדי להגדיר את הספריה MATLAB.
    2. הגדירו את המשתנים הבאים: תבנית תמונה, המרת פיקסל למייקרון, המודולולוס של יאנג, יחס פואסון ומטרת המיקרוסקופ.
    3. אתר את התמונה חרוז, טריפסין ותמונת פאזה באמצעות שיגרת המשנה Openfiles .
      הערה: עבור ערכות נתונים גדולות, מומלץ לקרוא לקבצים בסדר רציף. לדוגמה, על הקבצים להיות מקבלים את השם "filename1. tif", "filename2. tif" וכו '.
    4. הגדר ROI מרובע (אזור מעניין) סביב תא מונאולייר והפעל את רוטינת הcell_cropper כדי לחתוך את התמונה המקורית.
    5. בצע את רוטינת הdisplacement_finder כדי לחשב את displacements.
    6. לבצע את רוטינת Dedrift כדי להסיר כל displacements נוספים שאינם סלולריים שעשויים לנבוע מיקרוסקופ שלב הסחף.
  2. חישוב העקבות
    הערה: כאן, מעקב בלתי מוגבל מחושבים באמצעות שגרת MATLAB כתובה אישית שלנו. צעד אחר צעד המתיחה חישוב באמצעות שגרת MATLAB שהוזכרו בעבר הוא נתון להלן.
    1. הגדר את המשתנים הבאים בתוך שגרת הגרירה. m : תנאי גבול, עובי ג'ל, גובה ג'ל, ו dedrift.
    2. בצע את רוטינת הtraction_finder כדי לחשב מטרייסי ולבצע את רוטינת הplot_traction להתוויה. כל העקבות ב-x-כיוון (Tx) ו-y כיוון (טיי) יחד עם מיקומי הפיקסל המתאימים שלהם ניתן למצוא בקובץ המתיחה. dat שיופק על ידי הקוד.
  3. חישוב הלחצים הבינתאיים
    הערה: צעד אחר צעד הוראות לחישוב מאמץ אינטרתאי באמצעות שגרת MATLAB שהוזכרה קודם לכן מקבלים להלן.
    1. בצע את רוטינת הmark_circular_domain כדי לציין את גבול המונאולייר. שגרה זו תנחה את כל התמונות בשלב החתוך ברציפות כדי שהמשתמש יצייר באופן ידני את הגבול סביב המונאולייר. שמור את הפתק של nXPts שנוצר בחלון הפקודה והשתמש בהם מאוחר יותר כפרמטרי רשת בציר X ובציר Y עבור ניתוח של פמ (ראה שלב 9.3.2).
    2. בצע Run_StressCode כדי לחשב מתחים בין-סלולאריים. רוטינת משגרה זו קוראת ישירות את הפרמטרים מהקובץ "model.in" ומפעילה את "island. exe" כדי לבצע ניתוח של פמ. לפני הפעלת שגרה זו, ודא שכל הפרמטרים בקובץ model.in , כלומר פרמטרי רשת ב-X ו-Y, פיקסל מיקרון המרה, מודול הג של יאנג של הג, היחס של פואסון, גובה מונאולייר, ודפוס מונאולייר (רצועה או חור), נערכים כראוי.
    3. התווה את כל תוצאות ה-פמ באמצעות שיגרת הplot_FEM_results .
      הערה: כל התוצאות שייווצרו יאוחסנו באופן אוטומטי בתיקיית התוצאות בספריה MATLAB.

תוצאות

חדות הפאזה תמונות של שליטה, 0.2 μg/mL, ו 2 μg/mL chalcone טופלו monolayers נלקחו 30 דקות לפני הטיפול chalcone (איור 1א-ג) ו 2 שעות לאחר טיפול chalcone (איור 1D-F). המושרה displacements חרוז (μm) נצפו כדי להקטין את שניהם חלב במינון נמוך ומינון גבוה התנאים chalcone (<...

Discussion

הקבוצה שלנו, כמו גם אחרים, כבר בהצלחה באמצעות tfm ו MSM כדי לחקור את ההשפעה של צמתים תא תא בתהליכים הסלולריים הפתולוגיים והפיסיולוגיים שונים בתוך מבחנה7,15,18,27 . לדוגמה, הארדין ואח ' הציג מחקר תובנה מאוד המציעה מדריכים העברת מ...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת מרכז פלורידה הסטארט-up ואת הלב הלאומי, ריאות, ובדם המכון של המכון הלאומי לבריאות תחת הפרס K25HL132098.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
18 mm coverslipThermoFisher18CIR-1Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamideBIO-RAD1610143Component of polyacrylamide gel
2′,5′-DihydroxychalconeSIGMAIDF00046To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateSIGMA2530-85-0Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% AcrylamideBIO-RAD1610140Component of polyacrylamide gel
Acetic acidFisher-Sceintific64-19-7Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;ThermoFisherCatalog # A-11001Secondary antibody
Ammonium persulfateBIO-RAD1610700Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA)SIGMA9048-46-8To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mLAdvance Biomatrix5005-100MLUse as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)Fisher-Sceintific21040CVBuffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagentsFisher-Sceintific67-68-5To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPIThermoFisher00-4959-52Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beadsThermoFisherF88120.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 MSIGMA7365-45-9Essential to
LVESThermoFisherA1460801Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200ThermoFisherM200500Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)ThermoFisherCatalog #13-8300Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia)CellVisD35-20-1.5H35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mgProteochem102568-43-4Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer KitDOW corning2646340Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMEDBIO-RAD1610801Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100SIGMA9002-93-1To permeabilize cells
Trypsin -EDTAThermoFisher25300054Used to detach cells

References

  1. Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
  2. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  3. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  4. Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
  5. Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
  6. Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
  7. Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
  8. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
  9. Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
  10. Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
  11. Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
  12. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  13. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
  14. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  15. Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
  16. Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
  17. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
  18. Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
  19. Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
  20. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  21. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  22. Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
  23. Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
  24. Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
  25. Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
  26. Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
  27. Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
  28. Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152Cx43

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved