Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Spaltknoten-Anschluss 43 zu stören und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die endotheliale Biomechanik durch Beobachtung von Traktionen und interzellulären Spannungen zu messen.

Zusammenfassung

Endothelzellen wurden etabliert, um interzelluläre Spannungen und Traktionen zu erzeugen, aber die Rolle, die Lückenknoten bei endothelialen interzellulären Spannungen und Traktionsgenerierung spielen, ist derzeit nicht bekannt. Daher stellen wir hier ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Einfluss des Spaltknotens Connexin 43 (Cx43) auf die endotheliale Biomechanik zu untersuchen, indem konfluente endotheliale Monolayer einem bekannten Cx43-Inhibitor 2,5-Dihydroxychalcon (Chalcon) und Messung der Auswirkungen dieses Inhibitors auf Traktionen und interzelluläre Spannungen. Wir präsentieren repräsentative Ergebnisse, die eine Abnahme sowohl der Traktionen als auch der interzellulären Spannungen unter einer hohen Chalcon-Dosierung (2 g/ml) im Vergleich zur Kontrolle zeigen. Dieses Protokoll kann nicht nur auf Cx43 angewendet werden, sondern auch auf andere Spaltknoten, vorausgesetzt, der entsprechende Inhibitor wird verwendet. Wir glauben, dass dieses Protokoll in den Bereichen kardiovaskuläre und mechanobiologische Forschung nützlich sein wird.

Einleitung

Das Feld, das sich auf die Untersuchung der Auswirkungen physikalischer Kräfte und mechanischer Eigenschaften auf die Zell- und Gewebephysiologie und Pathologie bezieht, ist als Mechanobiologie¹bekannt. Ein paar nützliche Techniken, die in der Mechanobiologie verwendet wurden, sind Monolayer-Stressmikroskopie und Traktionskraftmikroskopie. Die Traktionskraftmikroskopie ermöglicht die Berechnung von Traktionen, die an der Zell-Substrat-Schnittstelle erzeugt werden, während die monoschichtige Spannungsmikroskopie die Berechnung interzellulärer Spannungen ermöglicht, die zwischen benachbarten Zellen innerhalb einer Monoschicht erzeugt werden^{2 ,3,4,5,6}. Die Ergebnisse früherer Methoden deuten darauf hin, dass zellabgeleitete mechanische Spannungen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Schicksals einer Vielzahl zellulärer Prozesse^{spielen 3,4,5}. Wenn z. B. eine externe mechanische Kraft ausgesetzt wird, kann eine Gruppe von Zellen, die als Kollektiv migrieren, ihre Morphologie verändern und ihre Form polarisieren, um die Richtung der angewendeten Kraft auszurichten und zu migrieren, indem sie teilweise Traktionen erzeugen^{7, 8}. Traktionen bieten eine Metrik, die zur Bewertung der Zellkontraktilität verwendet werden kann und mittels Traktionskraftmikroskopie (TFM) berechnet wird. Die Traktionskraftmikroskopie (TFM) beginnt mit der Bestimmung zellinduzierter Substratverformungen, gefolgt von der Berechnung des Traktionsfeldes unter Verwendung eines mathematisch strengen, mechanikbasierten Berechnungsansatzes. Da die Fähigkeit, Traktionen zu berechnen, schon seit geraumer Zeit besteht, haben Forscher TFM genutzt, um die Auswirkungen von Traktionen auf eine Vielzahl von Prozessen zu offenbaren, einschließlich Krebs^9,Wundheilung¹⁰ und Bewertung von technischen Herz Gewebe¹¹.

Die Implementierung von TFM und MSM kann in drei wesentliche Schritte unterteilt werden, die in der folgenden Reihenfolge ausgeführt werden müssen: Erstens werden die von den Zellen erzeugten Hydrogelverformungen bestimmt; zweitens werden Traktionen aus Hydrogelverformungen zurückgewonnen; und drittens wird ein Finite-Elemente-Ansatz verwendet, um normale und scherende interzelluläre Spannungen innerhalb der gesamten Monolayer zu berechnen. Um Gelverschiebungen zu berechnen, wurden Fluoreszenzperlenbilder mit Zellen mit dem Referenzperlenbild (ohne Zellen) verglichen, indem eine benutzerdefinierte Partikelbild-Velocimetrie (PIV)-Routine verwendet wurde. Die Kreuzkorrelationsfenstergröße und -überlappung für die PIV-Analyse wurden für 32 x 32 Pixel bzw. 0,5 ausgewählt. Zu diesem Zeitpunkt wurden Pixelverschiebungen in Mikrometer umgewandelt, indem sie mit einem Pixel-zu-Mikron-Umrechnungsfaktor multipliziert wurden (für unser Mikroskop beträgt dieser Umrechnungsfaktor 0,65), um Verschiebungen in der Ebene zu erhalten. Fehler, die mit dem Ignorieren von Verschiebungen a-ebener Weise verbunden sind, sind vernachlässigbar^12,13. Nach der Berechnung von Gelverschiebungen gibt es zwei Arten von Traktionsmessungen, die verwendet werden können, eingeschränkte Traktionen und uneingeschränkte Traktionen^8,14. Unbeschränkte Traktionen stellen das Traktionsfeld für das gesamte Sichtfeld (einschließlich Regionen mit und ohne Zellen) bereit, während eingeschränkte Traktionen das Traktionsfeld nur für Regionen bereitstellen, die Zellen¹⁴enthalten. Anschließend werden interzelluläre Spannungen mittels Monolayer-Stressmikroskopie (MSM) berechnet, was eine Erweiterung der Traktionskraftmikroskopie darstellt. Die Implementierung von MSM basiert auf der Annahme, dass lokale Traktionen, die von einer Monoschicht von Zellen an der Zell-Substrat-Schnittstelle ausgeübt werden, durch mechanische Kräfte ausgeglichen werden müssen, die zwischen den Zellen an der Zell-Zell-Schnittstelle übertragen werden, wie es in Newtons Gesetzen gefordert wird^{7 ,12,13}. Eine wichtige Annahme ist dabei, dass die Zellmonoschicht als dünnes elastisches Blatt behandelt werden kann, da die Traktionsverteilung in der Monoschicht bekannt ist und die Kraftbalance nicht von den Zellmaterialeigenschaften abhängt. Eine weitere wichtige Annahme ist, dass die Zugkräfte durch lokale interzelluläre Spannungen innerhalb des optischen Sichtfeldes (innerhalb der Monoschicht) ausgeglichen werden und der Einfluss dieses Kraftgleichgewichts im distalen Bereich (außerhalb der Monolayer) minimal ist¹³. Daher sind die Randbedingungen, die durch interzelluläre Spannungen, Verschiebungen oder eine Kombination aus beidem an der Einschichtgrenze definiert sind, entscheidend für die Ausführung von MSM¹³. Unter Berücksichtigung der oben genannten Informationen verwenden wir MSM, um eine Finite-Elemente-Analyse (FEM) durchzuführen, um die maximale Hauptspannung_(max.) und die minimale Hauptspannung_(min) durch Drehen der Spannungsebene an jedem Punkt innerhalb des Monolayer. Diese Hauptspannungen werden anschließend verwendet, um die durchschnittliche durchschnittliche normale interzelluläre Spannung von 2D [(max +_min) /2] und die maximale 2D-Scherspannung_[(max -_min) /2] innerhalb der gesamten Monolayer zu berechnen. ^12,13. Dieses Verfahren wird von Tambe et al.^12,13 näher beschrieben.

Die Monolayer-Stressmikroskopie (MSM) ermöglicht die Berechnung von zellzellulären Spannungen, die in einer Monoschicht^6,7,^8,12,13erzeugt werden. Diese interzellulären Spannungen wurden vorgeschlagen, wichtig für Gewebewachstum und -reparatur, Wundheilung und Krebsmetastasen^12,15,16,17zu sein. Darüber hinaus wurden interzelluläre Spannungen vorgeschlagen, auch bei der Endothelzellmigration und endotheliale Barrierefunktion^17,18wichtig zu sein. Während Zell-Zell-Kreuzungen wie enge Kreuzungen und Adhäsivverbindungen beide als eine entscheidende Rolle bei der erzeugung und Transmission von endothelialen interzellulären Spannungen vorgeschlagen wurden, bleibt die Rolle von Spaltknoten schwer fassbar. Lückenknoten verbinden benachbarte Zellen physisch und bieten einen Weg für elektrischen Strom und Moleküle (<1 KDa), um zwischen benachbarten Zellen^19,20,21zu passieren. Obwohl Endothelzellen Cx37, Cx40 und Cx43 Spaltknoten^19,22ausdrücken, ist Cx43 wohl die wichtigste in Bezug auf die Krankheitsprogression²³. Ein Beweis für die Bedeutung von Cx43 kann in der Tatsache gefunden werden, dass die genetische Deletion von Cx43 bei Mäusen zu Hypotonie²⁴ führt und nachteilige Auswirkungen auf die Angiogenese²⁵hat. Darüber hinaus wurde cx43 als wichtig für die Zellmigration und Proliferation und im Fortschreiten der Arteriosklerose^{18,22,23,24,25} .

In diesem Protokoll untersuchten wir mit TFM und MSM, ob Traktion und interzelluläre Spannungserzeugung innerhalb der konfluenten, endotheliaalen Monolayer durch die Störung der endotheliale Spaltkreuzung Cx43 beeinträchtigt würden. Wir störten Cx43 mit 2,5-Dihydroxychalcon (Chalcon), einem Molekül, das dokumentiert ist, um die Cx43-Expression²⁶zu hemmen. Chalcone wurde verwendet, um Cx43 anstelle von siRNA zu stören, da Chalcone zuvor von Lee et al. berichtet wurde, um cx43 Expression²⁶zu stören. Darüber hinaus waren wir besonders an chalcones Einfluss auf das Endothel interessiert, da es auch als entzündungshemmende und thromboplättliche Verbindung berichtet wurde, die potenziell zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener Pathologien²⁶. Chalcone-Behandlungen wurden eine Stunde nach Beginn des Experiments durchgeführt, mit Chalcone behandelte Monolayer wurden insgesamt sechs Stunden lang abgebildet, und die Bildverarbeitung wurde mit einem kundenspezifischen MATLAB-Code durchgeführt, um Traktionen und anschließend interzelluläre Betont. Unsere Ergebnisse zeigten eine allgemeine Abnahme der Traktionen und interzellulären Spannungen, was darauf hindeutet, dass Cx43 eine Schlüsselrolle in der endothelialen Biomechanik spielt.

Protokoll

1. Herstellung von Polyacrylamid (PA) Gelen

1. Zubereitung der Petrischale
   1. Bereiten Sie die Silanlösung bereit, indem Sie 200 ml Reinstwasser mit 80 l Essigsäure und 50 l 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat mischen. Bind Silan ist eine Lösung zur Funktionalisierung der Glasboden Petrischale Oberfläche für Hydrogel-Befestigung.
   2. Die Bindesilanlösung mindestens 1 h auf einer Rührplatte rühren.
   3. Behandeln Sie die Mitte gut der Petrischale mit Bindung Silanlösung für 45 min.
   4. Entfernen Sie die Silanlösung binden und spülen Sie die Petrischale mit ultrareinem Wasser 2x-3x ab.
   5. Trocknen Sie die Petrischale Oberfläche und lagern Sie bei Raumtemperatur für die zukünftige Verwendung.
2. Aufbereitung einer Hydrogellösung
   1. Mischen Sie ultrareines Wasser, 40% Acrylamid und 2% Bisacrylamid in einem 15 ml Zentrifugenrohr gemäß Tabelle 1.
   2. Fügen Sie der Hydrogellösung 80 L fluoreszierende Perlen hinzu.
   3. Schütteln Sie das Rohr vorsichtig, um Perlen mit der Gellösung zu mischen.
   4. Ziehen Sie die Rohrkappe am Zentrifugenrohr leicht fest und legen Sie sie in eine Vakuumkammer.
   5. Entgasen Sie die Gellösung für mindestens 45 min in der Vakuumkammer.
3. Hydrogelpolymerisation
   1. Zuerst 75 l 10% Ammoniumpersulfat (in reinem Reinstwasser gelöst) und dann 8 l TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethan-1,2-diamine) in die Hydrogellösung geben.
   2. Platzieren Sie 24 L Hydrogellösung in der Mitte der Petrischale (siehe Tabelle 2).
   3. Verwenden Sie einen 18 mm Deckelschlupf, um das Hydrogel abzuflachen. Dadurch wird eine Höhe von 100 m erreicht.
   4. Warten Sie mindestens 30-40 min auf die Gelpolymerisation.
   5. Tauchen Sie das polymerisierte Hydrogel in reines Reinstwasser ein, um eine Gelaustrocknung zu verhindern.
   6. Bedecken Sie die Petrischale mit Aluminiumfolie, um das Photobleichen von fluoreszierenden Perlen zu verhindern und bei 4 °C aufzubewahren.
      HINWEIS: Hydrogele können einen Zeitraum von bis zu 3 Monaten gelagert werden, aber es wird vorgeschlagen, dass diese Gele nicht länger als 1 Woche nach der Herstellung verwendet werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen.

2. Zellkultur

1. Kultur menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) im Zellkulturmedium 200 (siehe Materialtabelle) ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin auf 0,1% gelatinebeschichteten Kolben bei 37 °C und 5%_CO2.

3. Mikromuster Schablonenvorbereitung

1. Eine dünne Schicht Aus polydimethylsiloxan (PDMS) in einer 100 mm Petrischale aushärten, indem sie die Silikonbasis mit dem Silikonhärtungsmittel im Verhältnis 20:1 (Basis: Härtungsmittel) mischen.
   HINWEIS: Es ist möglich, andere Basis-zu-Härtungsmittel-Verhältnisse zu verwenden (z. B. 10:1 oder 30:1). Ein niedrigeres Verhältnis zwischen Basis zu Härtungsmittel ergibt jedoch ein steiferes Muster, während ein höheres Verhältnis zwischen Basis- und Härtungsmittel zu einem weicheren Muster führt.
2. Bereiten Sie eine 20:1 (Base:curing Agent) PDMS-Lösung vor und mischen Sie sie sorgfältig in einem 50 ml Zentrifugenrohr. Invertieren Sie das Rohr auf den Kopf und schütteln Sie kräftig mehrmals, um eine ordnungsgemäße Durchmischung der PDMS-Lösung zu gewährleisten, da eine ungleichmäßige Vermischung zu einer unvollständigen Polymerisation führt.
3. Entfernen Sie Blasen, die aus dem obigen Schritt durch Zentrifugieren der PDMS-Lösung für 1 min bei 190 x geingeführt wurden.
4. 5-6 ml PDMS-Lösung in die Mitte einer 100 mm Petrischale gießen und die Schale aufregen, bis die PDMS-Lösung die gesamte Petrischalenoberfläche abdeckt.
5. Härten Sie die PDMS-Lösung über Nacht bei 50-60 °C. PDMS kann auch bei Raumtemperatur ausgehärtet werden.
6. Entfernen Sie eine kreisförmige PDMS-Schablone mit 16 mm Durchmesser mit einem Lochstanzer.
7. Verwenden Sie einen Biopsiespunsch, um kleine Löcher in der PDMS-Schablone zu erstellen. Dieses Protokoll verwendet einen Biopsie-Punch mit einem Durchmesser von 1,25 mm.
8. Sterilisieren Sie PDMS-Schablonen, indem Sie sie zunächst in 70% Ethanol für 2-3 min tauchen, überschüssiges Ethanol absanieren und dann 5 min unter UV-Licht stellen.

4. Kollagen-I Hydrogelbeschichtung

1. Entfernen Sie den Deckelrutsch vom Hydrogel und saugen Sie überschüssige Flüssigkeit an.
2. Legen Sie die PDMS-Schablone auf die Hydrogeloberfläche.
   HINWEIS: Pinzette kann verwendet werden, um leichten Druck auf PDMS Schablone anzuwenden, um eine wasserdichte Abdichtung zwischen der PDMS-Schablone und der Hydrogeloberfläche zu gewährleisten. Unsere PDMS-Schablonen sind wasserdicht und verhindern so den Wasserzugang zwischen der Gel-Oberfläche und der PDMS-Schablonenbodenoberfläche. Auch die Hydrogelsteifigkeit muss in Bezug auf die PDMS-Steifigkeit nicht angepasst werden.
3. Die Hydrogeloberfläche mit Sulfosuccinimidyl-6-(4-Azido-2-nitrophenylamino)-Hexanoat (Sulfo-SANPAH) in einer 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinesulfonsäure) gelösten Pufferlösung in einer Konzentration von 1 : 1000 Lampe (Leistung 36 W) für 8 min.
4. Die überschüssige Sulfo-SANPAH- und HEPES-Lösung ansaugen und das Hydrogel zweimal mit 0,1 M HEPES abspülen, gefolgt von zwei zusätzlichen Spülungen mit reinem Reinen.
5. Überschüssiges reines Wasser ansaugen und Hydrogele mit 0,1 mg/ml Kollagen-I über Nacht bei 4 °C beschichten.
6. Bedecken Sie die Gerichte und schützen Sie fluoreszierende Perlen vor Photobleichmittel.
   HINWEIS: PDMS-Schablonen werden verwendet, um mikrogemusterte Monolayer zu erstellen. Mikrogemusterte Monolayer werden verwendet, da sie es ermöglichen, mehrere Monolayer derselben Geometrie und Abmessungen gleichzeitig während jedes Experiments zu beobachten. Sollten jedoch Mikromuster nicht gewünscht werden, können die oben genannten Schritte mit Ausnahme von Schritt 4.2 befolgt werden.

5. Erstellen von HUVEC-Monolayern auf Hydrogelen

1. Verwenden Sie 1x Trypsin, um Zellen von Gewebekulturkolben für 3-5 min im Inkubator zu lösen.
2. Fügen Sie der Trypsin-Lösung nach der Trypsinisierung Zellkulturmedien hinzu und fügen Sie das 15 ml Zentrifugenrohr hinzu.
3. Zentrifugieren Sie die Zelllösung für 3 min bei 1710 x g. Ein kleines, weißes Zellpellet sollte an der Unterseite des Zentrifugenrohrs sichtbar sein.
4. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie Zellen in Medien auf eine Konzentration von 50 x 10⁴ Zellen/ml aus.
5. Entfernen Sie Kollagen-I vom Hydrogel und spülen Sie 1x mit PBS ab.
6. Fügen Sie 75 x 10³ Zellen an die Oberseite der PDMS-Schablone und lassen Sie Zellen an der Hydrogeloberfläche für mindestens 1 h im Inkubator bei 37 °C und 5%_CO2anhaften.
7. Entfernen Sie die PDMS-Schablone, und fügen Sie der Petrischale mindestens 2 ML Medien hinzu. Tauchen Sie die PDMS-Schablone in 10x Trypsin ein, um alle angeschlossenen Zellen zu entfernen und durch Sprühen mit 70% Ethanol zu sterilisieren und dann 5 min unter das UV-Licht zu stellen.
8. Legen Sie die Petrischale in den Inkubator und warten Sie mindestens 36 h oder bis eine konfluente Monoschicht beobachtet wird.

6. 2,5 Dihydroxychalcon-Behandlung bei Cx43-Störung

1. 2,5 Dihydroxychalcon (Chalcon) in Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen, um eine 0,1875 mg/ml-Stammlösung herzustellen.
2. Verdünnen Sie die Stammlösung mit Zellkulturmedien, um eine niedrige Chalconkonzentration (0,2 g/ml) aliquot und eine hohe Chalconkonzentration (2 g/ml) aliquot zu bilden.

7. Datenerfassung

1. Suchen Sie Zellinseln mit einem Mikroskop.
2. Erfassen Sie Phasenkontrast- und Perlenbilder zur Bildzellmorphologie bzw. Hydrogelverschiebungen.
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendete ein 10-faches Ziel für die Datenerfassung.
3. Am Ende des Experiments lösen Sie Zellen mit 10x Trypsin und erfassen Sie ein Bild der Geloberfläche ohne Zellen (Referenzbild).

8. Immunostaining

1. Monolayer mit 4% Formaldehyd fixieren und 15 min bei 37 °C brüten.
2. Entfernen Sie 4% Formaldehyd und fügen Sie 0,2% Triton X-100 für 5 min bei 37 °C, um Zellen zu permeabilisieren.
3. Entfernen Sie 0.2% Triton X-100 und spülen Monolayer mit PBS 2x-3x.
4. Cover Monolayer mit 2% Rinderserumalbumin (BSA) Lösung für 45 min bei 37 °C.
5. Entfernen Sie die 2% BSA-Lösung und spülen Sie Monolayer mit PBS 2x-3x.
6. Primären Cx43-Antikörper in einer Konzentration von 1:400 in die Probe geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
7. Entfernen Sie primärer Antikörper und spülen Sie die Probe mit PBS 2x-3x.
8. Sekundärantikörper in einer Konzentration von 3:200 hinzufügen und 2 h bei 37 °C brüten.
   HINWEIS: Proben sollten abgedeckt werden, um Photobleichungen zu verhindern.
9. Sekundären Antikörper entfernen und mit PBS 2x-3x ausspülen.
10. Abdeckmuster mit Montagemedium (Fluromount-G DAPI) und Dichtung mit 18 mm Abdeckschlupf.

9. Implementierung der Traktionskraftmikroskopie (TFM) und der Monolayer-Stressmikroskopie (MSM)

1. Hydrogel-Deformationsberechnung
   HINWEIS: Im Folgenden wird eine Schritt-für-Schritt-Verschiebungsberechnungsprozedur mit MATLAB beschrieben.
   1. Öffnen Sie die Hauptdatei traction.m in MATLAB (für alle MATLAB-Routinen siehe Ergänzende Materialien).
      HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen im Code, um das MATLAB-Verzeichnis festzulegen.
   2. Definieren Sie die folgenden Variablen: Bildformat, Pixel-zu-Mikron-Konvertierung, Young-Modul, Poissons Verhältnis und Mikroskopobjektiv.
   3. Suchen Sie die Perle, das Trypsin-Bild und das Phasenbild mit der OpenFiles-Unterroutine.
      HINWEIS: Bei großen Datensätzen ist es am besten, Dateien in sequenzieller Reihenfolge zu benennen. Beispielsweise sollten Dateien den Namen "filename1.tif", "filename2.tif" usw. haben.
   4. Definieren Sie einen quadratischen ROI (Interessenbereich) um die Zellmonolayer, und führen Sie die Cell_cropper-Unterroutine aus, um das Originalbild zuzuschneiden.
   5. Führen Sie die Unterroutine displacement_finder aus, um Verschiebungen zu berechnen.
   6. Führen Sie die Dedrift-Unterroutine aus, um zusätzliche nichtzelluläre Verschiebungen zu entfernen, die auf die Drift des Mikroskopstadiums zurückzuführen sein können.
2. Berechnung der Traktionen
   HINWEIS: Hier werden uneingeschränkte Traktionen mit unserer kundenspezifischen MATLAB-Routine berechnet. Schritt für Schritt wird die Traktionsberechnung mit der oben erwähnten MATLAB-Routine unten angegeben.
   1. Definieren Sie die folgenden Variablen innerhalb der traction.m-Routine: Randbedingung, Geldicke, Gelhöhe und Dedrift.
   2. Führen Sie die Unterroutine traction_finder aus, um Traktionen zu berechnen, und führen Sie die Unterroutine plot_traction aus, um Traktionen zu zeichnen. Alle Traktionen in x-Richtung (Tx) und y-Richtung (Ty) zusammen mit den entsprechenden Pixelpositionen finden Sie in einer traction.dat-Datei, die vom Code generiert wird.
3. Berechnung interzellulärer Spannungen
   HINWEIS: Schritt für Schritt Anweisungen für die interzelluläre Spannungsberechnung mit der matLAB-Routine, die bereits erwähnt wurde, sind unten aufgeführt.
   1. Führen Sie die Unterroutine mark_circular_domain aus, um die Einlayer-Grenze anzugeben. Diese Routine fordert alle zugeschnittenen Phasenbilder sequenziell auf, damit der Benutzer manuell eine Grenze um die Monolayer zeichnen kann. Notieren Sie sich die im Befehlsfenster generierten nXPts und verwenden Sie sie später als Rasterparameter in der X-Achse und der Y-Achse für die FEM-Analyse (siehe Schritt 9.3.2).
   2. Führen Sie Run_StressCode aus, um interzelluläre Spannungen zu berechnen. Diese Unterroutine liest direkt Parameter aus der Datei "model.in" und führt "island.exe" aus, um eine FEM-Analyse durchzuführen. Stellen Sie vor dem Ausführen dieser Routine sicher, dass alle Parameter in der model.in Datei, d. h. Rasterparameter in X und Y, Pixel-zu-Mikron-Konvertierung, Youngs Gelmodul, Poissons Verhältnis, Monolayer-Höhe und Monolayer-Muster (Streifen oder Loch), bearbeitet werden. richtig.
   3. Zeichnen Sie alle FEM-Ergebnisse mit der Unterroutine plot_FEM_results.
      HINWEIS: Alle generierten Ergebnisse werden automatisch im Ordner Ergebnisse im Verzeichnis MATLAB gespeichert.

Ergebnisse

Phasenkontrastbilder der Steuerung, 0,2 g/ml und 2 g/ml-Chalcone-behandelte Monolayer wurden 30 Minuten vor der Chalcon-Behandlung (Abbildung 1A-C) und 2 Stunden nach der Chalcon-Behandlung (Abbildung 1D-F) aufgenommen. Es wurden zellinduzierte Perlenverschiebungen (m) beobachtet, die sowohl bei niedrig dosierten Chalcone- als auch bei hochdosierten Chalcon-Bedingungen abnehmen (

Diskussion

Unsere Gruppe, wie auch andere, hat erfolgreich TFM und MSM verwendet, um den Einfluss von Zell-Zell-Verbindungen in verschiedenen pathologischen und physiologischen zellulären Prozessen in vitro^{7,15,18,27 zu untersuchen} . Zum Beispiel präsentierten Hardin et al. eine sehr aufschlussreiche Studie, die interzelluläre Spannungsübertragung schlägt parazelluläre Spaltbildung in Endothelzellen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
18 mm coverslip	ThermoFisher	18CIR-1	Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide	BIO-RAD	1610143	Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone	SIGMA	IDF00046	To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate	SIGMA	2530-85-0	Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide	BIO-RAD	1610140	Component of polyacrylamide gel
Acetic acid	Fisher-Sceintific	64-19-7	Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG;	ThermoFisher	Catalog # A-11001	Secondary antibody
Ammonium persulfate	BIO-RAD	1610700	Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA	9048-46-8	To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL	Advance Biomatrix	5005-100ML	Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x)	Fisher-Sceintific	21040CV	Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents	Fisher-Sceintific	67-68-5	To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI	ThermoFisher	00-4959-52	Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads	ThermoFisher	F8812	0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M	SIGMA	7365-45-9	Essential to
LVES	ThermoFisher	A1460801	Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200	ThermoFisher	M200500	Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1)	ThermoFisher	Catalog #13-8300	Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia)	CellVis	D35-20-1.5H	35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg	Proteochem	102568-43-4	Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	DOW corning	2646340	Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED	BIO-RAD	1610801	Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100	SIGMA	9002-93-1	To permeabilize cells
Trypsin -EDTA	ThermoFisher	25300054	Used to detach cells