שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

Summary

שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.

Abstract

הארגון והמבנה של תחומי כרומטין הם ייחודיים לתאי תאים נפרדים. הטעות שלהם עלולה לגרום לאובדן זהות תאית ו/או מחלה. למרות מאמצים עצומים, ההבנה שלנו על היווצרות והתפשטות של תחומים כרומטין עדיין מוגבלת. תחומים כרומטין נחקרו בתנאים יציבים, אשר אינם מסייעות לעקוב אחר האירועים הראשוניים במהלך הקמתה. כאן, אנו מציגים שיטה ליצור מחדש תחומים כרומטין לשחזר ולעקוב אחר היווצרות שלהם כפונקציה של זמן. למרות, לראשונה מיושם על המקרה של PRC2-תיווך כרומטין היווצרות התחום, זה יכול להיות מותאם בקלות לתחומים אחרים כרומטין. שינוי ו/או שילוב של שיטה זו עם טכנולוגיות גנומיקה והדמיה יספק כלים יקרי ערך ללמוד את הקמתה של תחומים כרומטין בפירוט רב. אנו מאמינים ששיטה זו מהפכה את ההבנה שלנו לגבי אופן הפעולה של תחומים כרומטין ואינטראקציה זה עם זה.

Introduction

הגנום eukaryotic הם מאורגנים מאוד ושינויים בנגישות כרומטין ישירות שולטת בתמלול גנים¹. הגנום מכיל סוגים שונים של תחומים כרומטין, אשר מתאם עם הפעילות הטרנססקריפט ושכפול עיתוי^2,3. תחומים אלה כרומותין טווח בגודל של קילוסים מספר (kb) ליותר מ 100 kb והם מאופיינים על ידי העשרה שינויים ברורים ההיסטון⁴. השאלות המרכזיות הן: כיצד נוצרים תחומים אלה וכיצד הם מופצים?

אחד מתחומי כרומטין המאופיינת ביותר הוא מאומץ באמצעות הפעילות של קומפלקס הדיכוי הרב פוליקומב 2 (PRC2). PRC2 הוא קומפלקס רב ממדי subunit המורכב מקבוצת משנה של קבוצת פולימסרק (pcg) של חלבונים^5,6, ו לזרז את מונו-, di-ו טריתילציה של ליזין 27 של היסטון H3 (H3K27me1/me2/me3)^{7,8, 9,10}. H3K27me2/me3 משויכים למצב כרומטין דכאני, אך תפקידה של H3K27me1 אינו ברור^6,11. אחד המרכיבים המרכזיים של PRC2, פיתוח אאקטודרם עובריים (שלוש), נקשר למוצר הסופי של PRC2 זרז, H3K27me3, דרך הכלוב הארומטי שלה ותכונה זו מביא לגירוי אלוסטריה של PRC2^12,13. הפעילות הPRC2 אנזימטית חיונית לשימור הזהות התאית במהלך הפיתוח כביטוי בלתי הולם של גנים מסוימים התפתחותיים, כי הם התווית עבור שושלת מסוימת, יהיה מזיק^5,6 . לפיכך, להתיר את המנגנונים שבהם PRC2 מטפחת היווצרות של תחומים כרומטין דכאניים ביונקים היא בעלת חשיבות יסודית להבנת הזהות התאית.

כל המערכות הנסיוניות האחרונות שתוכננו לחקור היווצרות דומיין כרומטין כולל תחומים PRC2-תיווך כרומטין, בוצעו בתנאים יציבים, אשר אינם יכולים לעקוב אחר אירועי התפתחות של היווצרות תחום של כרומטין ב תאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור מערכת סלולרית inducible העוקבת אחר גיוס והפצה ראשונית של תחומים כרומטין. באופן ספציפי, אנו מתמקדים מעקב אחר היווצרות של תחומים כרומטין PRC2 מתווכת המהווים H3K27me2/3. מערכת זו שיכולה ללכוד את הפרטים המכניים של היווצרות דומיין כרומטין, יכול להיות מותאם לשלב תחומים כרומטין אחרים, כגון תחומים למדו נרחב הכוללת או H2AK119ub או H3K9me. בשילוב עם טכנולוגיות גנומיקה והדמיה, לגישה זו יש את הפוטנציאל לטפל בהצלחה בשאלות מרכזיות שונות בביולוגיה כרומטין.

Protocol

דור של inducible הצלה mESCs

1. תרבית תאים

1. השתמש ללא מאכיל C57BL/6 בתאי גזע עובריים של העכבר (mESCs) בעל משולב באופן בלתי נשכח CreERT2 טרנזגנטי, אשר ניתן לאתר את הגרעין על הממשל של 4-הידרוקסיטמוקסיפן (4-OHT)¹³.
2. לגדול mESCs ב-בינונית ESC קונבנציונאלי^14,15, בתוספת עם 1000 U/mL בחיי, 1 μm טיפשה מעכב PD0325901 ו 3 μm GSK3 מעכב CHIR99021. עבור מדיום הרגיל ESC, השתמש בנוק-אאוט המכיל 15% סרום של שור עוברי (FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין ו 0.1 mM 2-mercaptoethanol.
3. להשתמש לוחות מצופה עם 0.1% הג פתרון עבור culturing mESCs.

2. הדור של נוקאאוט שבטים (KO) mESCs

1. מדריך עיצוב RNAs (gRNAs) כדי למחוק Exon 10 ו Exon 11 של עותק אנדוגני של mESCs באמצעות כלי העיצוב CRISPR בספסל¹⁶. הרובוט-ko-grna-1 מטרות אינטרון מיד הזרם של אקסון 10 ו--KO-grna-2 מטרות אינטרון מיד במורד הזרם אקסון 11. היישום הסימולטני של gRNAs האלה מוחק הן Exon 10 ו-Exon 11 על ידי הצטרפות לא הומוולוגי (NHEJ).
2. שיבוט gRNAs לתוך pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) באמצעות הוראות רן et al., 2013¹⁷.
3. בפורמט 6-היטב, transfect 2 x 10⁵ mESCs עם 1 מ ג של כל ד. ל. Ko-grna-1 ו-שולחן ה-Ko-grna-2 (ראה טבלה של חומרים) באמצעות הזיהום מגיב על ידי ביצוע הוראות היצרן. שינוי התקשורת 24 שעות לאחר הזיהום.
4. יומיים לאחר ההעברה, לבודד את התאים החיוביים GFP באמצעות מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS). צפו ליעילות השינוי בסביבות 10-30%. למיין סביב 5 x 10⁵ תאים כדי ללכוד מספיק תאים gfp חיוביים לציפוי.
5. צלחת מבודדת GFP חיובי mESCs לתוך 15 ס מ מצופה מראש עם 0.1% ג'לטין (10-20 x10³ תאים לכל צלחת) עבור קטיף המושבה.
6. הגדל את התאים באמצעי ESC במשך שבוע עד שמושבות בודדות יהיו גלויות. . להחליף את התקשורת כל יומיים
7. בחר מינימום של 48 מושבות באמצעות 20 μL מיקרופיפטה טיפ. מגרדים את המושבה בזמן. שאתה מוריד את המיקרופיפטה אל תשבור את המושבה. לתאים בודדים להעביר את המושבה לתוך המאהאז (20 mL) 96 צלחת היטב.
8. מודקון את המושבות במשך 10 דקות ב 37 ° c עד כל התאים מנוכה.
9. הוסף 200 mL של מדיית ESC לתוך כל טוב באמצעות הצינורות רב-ערוצי.
10. מערבבים היטב את התאים לתוך שני 96 בנפרד לוחות היטב באמצעות צינורות רב-ערוצי.
11. השתמש באחד הצלחות 96 היטב עבור הגנוקלדה ולשמור על השני גדל עד המסקנה הגנוזה. השתמש בפתרון החילוץ DNA כדי לחלץ דנ א מ 96 צלחת הבאר על ידי ביצוע הוראות היצרן.
12. השתמש ב-גנוהקלדה התחל Gnt_EED-KO-up ו -Gnt_EED-KO_down, אשר לאורך האתר נמחק ולבצע את ה-PCR הגנוזה עם taq DNA פולימראז בעקבות הוראות היצרן.
    הערה: סוגים אחרים של השימוש בדנ א יכול לשמש גם עבור הגנוטיפים, עם זאת, Taq DNA פולימראז מציע נוחות כמו תגובת ה-PCR יכול ישירות להיות טעון על ג'ל כאשר מאגר התגובה שלה בצבע משמש.
    1. צפו במוצר ה-DNA של משקל מולקולרי נמוך בתאים עם מחיקה homozygous יחסית למקרה פראי (WT).
       הערה: כדי ליצור תאים PRC2 null, homozygous מחיקה של exons 10 ו -11 היא הכרחית לערער ולבזות, יחידת משנה חיונית של ליבה PRC2¹³. היעילות של המטרה היא. כ -10%
13. לאמת את מחיקת ה-בסיס 10 ו -11 ואובדן של חלבון ה-, באמצעות רצפי הרצף של סאנגר והמערב המערבי, בהתאמה.
14. לאשר את דלדול של ה-H3K27me2/me3 מ כרומטין בתאי ה-, באמצעות שבב-seq באמצעות נוגדנים נגד H3K27me2/me3 ו-. השתמש בפרוטוקול שניתן ב Oksuz et al., 2017¹⁵ עבור ניסויי שבב-seq.

3. הנדסת mESCs לנמל הרבור הERT2 המבוסס על מinducible

1. עיצוב grna (-inducible) כדי להציג חתך בתוך אינטרון בעקבות אקסון 9 של באמצעות באמצעות כלי העיצוב crispr בספסל¹⁶ (ראה טבלת חומרים).
2. שיבוט gRNAs לתוך pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) באמצעות הוראות רן et al., 2013¹⁷.
3. עיצוב ה-DNA תבנית התורם הכוללת רצף של ה-dna לאחר אקסון 9 ו-C-טרמינל דגל-HA תג במעלה של רצף T2A-gfp, הכל בכיוון הפוך ביחס לרצף הגן אנדוסוגני.
   1. האגף את הקלטת עם אחוי-מסדר ורצף פוליאדלציה מקונן בין הטרוולוגי לאתרים loxP הפוכה (lox66 ו lox71)¹⁸.
   2. כלול לפחות 500 bp של זרועות הומולוגיה מכל קצה. פצל את תבנית התורם לתוך 2 מקטעים של שברי גנים gBlocks (ראה בלוק-1, Gblocks-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" ו-Gblocks-2-כלוב-מוטציה "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") ולהרכיב אותם לתוך וקטור בוטה באמצעות גיבסון שיבוט בעקבות הוראות היצרן.
      הערה: gblock-2 מכיל שאריות ארומטיים (Y365) בתוך כלוב המידע החשוב לאינטראקציה עם H3K27me3¹². gBlock-2-Wt מכיל שאריות סוג פראי, ואילו gblock-2-כלוב-מוטציה מכיל את כלוב-המוטציה של (Y365A), לא מסוגל לחייב את H3K27me3. ההצלה Inducible WT הצלה מסומן כמו i-WT-r ו Inducible כלוב-מוטציה הצלה ההצלה מסומן כמו i-MT-r לנוחות.
4. בתבנית 6-הבאר, transfect 2 x 10⁵ mESCs עם 1 מ ג של grna (אני-grna-inducible) ו 1 מ"ג של תבניות התורם (i-WT-r או i-MT-r) באמצעות מגיב לבידוד ובידוד בתאי gfp חיוביים באמצעות facs.
5. בצע את השלבים 2.3-2.11 כדי לבודד מושבות בודדות מוכן עבור מיקוד מוצלח.
6. השתמש הקלדה התחל Inducible_Genotype-FW -1 ו -Inducible_Genotype-REV-1, אשר לאורך הקלטת שנוספה ולבצע PCR הקלדה באמצעות taq DNA פולימראז.
   הערה: יעילות המיקוד עבור CRISPR היא בסביבות 10%.
   1. אשר שילוב נכון של הקלטת על-ידי ה-PCR באמצעות Inducible_Genotype-FW-2 ו -Inducible_Genotype-REV-2 התחל, אשר נמצאים מחוץ לזרועות הומולוגיה.
      הערה: שילוב Homozygous של הקלטת הוא הכרחי כדי לבצע הצלה יעילה של הצוות. שים לב כי תאים עם אינטגרציה homozygous יפיק מוצר אחד גדול DNA בהשוואה ל-WT, אשר יפיק מוצר קצר.
7. אשר את השילוב של הקלטת על-ידי רצף של סנגר.
8. לאשר היפוך של הקלטת ואת הביטוי של PRC2 ורכיבי ליבה אחרים (למשל, EZH2 ו SUZ12) על ממשל 4-OHT על ידי המערב המערבי.
9. לאשר את הביטוי של T2A-GFP ואחוז של להעיף ידי cy try זרימה. שים לב כי הביטוי של GFP הוא מעיד על היפוך של הקלטת ואת הביטוי של ה-משפט.

4. בעקבות התגררות והפצת פעילות PRC2 על כרומטין

1. ודא כי i-WT-r ו-i-MT-r mESCs אין ביטוי דולף של GFP על ידי הזרמת cy, לנסות. במקרה של ביטוי דולף של GFP, לבודד תאים GFP-שליליים על ידי FACS לפני תחילת הניסוי.
2. הרחב את i-WT-r ואני-MT-r mESCs לתוך 5 15 ס"מ לוחות (5x 10⁶ תאים לכל צלחת).
3. לגרום הבעה של WT או כלוב-מוטציה באמצעות מינהל של 0.5 mM 4-OHT עבור 0 h, 12 h, 24 שעות, 36 h ו 8 ימים (1 15 ס מ לתנאי). שנה את המדיה לאחר 12 h עבור טיפולים ארוכים יותר מ-12 שעות. בודד את התאים המשולבים מחדש בהצלחה על-ידי FACS באמצעות GFP. כוונן את זמן הטיפולים כך שכל התנאים ייאספו בו.
4. בצע שבב-seq עבור H3K27me2, H3K27me3 לחקור את התצהיר הזמני שלהם כרומטין בתגובה לביטוי מחדש של WT או כלוב-מוטציה ב. השתמש בפרוטוקול שבב-seq כולל הכנה לספריה המפורטת ב-Oksuz et al., 2017¹⁵.
5. השתמש בבקרת הדקר בכל מדגם כדי לאפשר השוואה כמותית בין נקודות זמן שונות¹⁹.
   1. עבור שליטה ספייק, השימוש כרומטין מדרוסופילה מלאנוסטר (ביחס 1:50 לכרוטין הנגזרת מהsc), כמו גם לדרוזוהילה H2Av נוגדן ספציפי (1 μl של נוגדן H2Av לכל 4 μg של דרוזוהילה כרומטין על פי הוראות היצרן) בכל דוגמה.
   2. הכינו את הכרוטין מדרוסופילה באופן דומה לזה מmESCs באמצעות הפרוטוקול המפורט Oksuz et al., 2017¹⁵.
6. מפה את הרצף קורא עבור שבב-seq כדי mm10 הגנום עם Bowtie 2 באמצעות פרמטרים ברירת המחדל²⁰.
7. לנרמל את העכבר שבב-seq קורא לדקר ב Drosophila ילה לקרוא ספירות²¹. חשב את פקטור הנורמליזציה של הדקר באמצעות הנוסחה הבאה: 1 x 10⁶/מיוחד של דרוזוהילה הקורא ספירות. מצפים לקבל בערך 1 x 10⁶דרוזוהילה לקרוא ספירות ו 20 x 10⁶ העכבר סופר לכל ניסוי.
   1. כאשר אתה מסדר את דגימות הקלט, אל תכלול את הכרומטותין .
8. השתמש בכלי genomecov מכלי המיטה כדי להמיר קובץ bam לתוך bedtools²². בשלב הבא, המירו את המיטה לקובץ הפאה הגדולה בעזרת הכלי מיטה מUSCS^23,24. עיין בקובץ ה-script הבא:
   gen = "הנתיב אל mm10 הגנום"
   chr = "נתיב לגודל כרומוזום mm10"
   inp_bam = "הנתיב אל קלט bam הקובץ"
   הכפל = "חישוב פקטור הנורמליזציה של הדקר"
   כלים למיטה genomecov-bg-$multiply-ibam $inp-g $gen > פלט. בדפורגרף
   מיון-k1, 1-k2, 2n פלט. בדפורגרף > output_sorted.
   בoutput_sorted ביגרפיטופאה. ב$chr output.bw
9. להמחיש את הצפיפות שבב-seq לקרוא על ידי העלאת קבצים פורסמים בדפדפן USCS הגנום²⁴.

5. ניטור הופעתה וצמיחה של H3K27me3 וקדי בגרעין mESCs

1. צלחת 1x 10⁴ mESCs לתוך 8-היטב שקופיות קאמרית מצופה מראש עם 0.1% ג'לטין.
2. למחרת, להתחיל לבצע ברציפות 4-OHT (0.5 מ"מ) השראות לאסוף את התאים ביטוי ד. א. עבור נקודות הזמן שצוין (0 h, 12 h, 24 h ו 36 h). שנה את המדיה לאחר 12 h עבור טיפולים ארוכים יותר מ-12 שעות.
3. תקן את mESCs עם 4% פאראמפורמלדהיד בתמיסת מלח (PBS) בטמפרטורת החדר (RT) עבור 10 דקות.
4. החדירות התאים עם PBS/0.25% טריטון X-100 בשעה RT עבור 30 דקות.
5. לחסום את התאים עם ה-PBS/5% סרום חמור/0.1% טריטון X-100 (חסימת מאגר) ב RT עבור 30 דקות.
6. לדלל H3K27me3 נוגדן ראשי 1:500 במאגר חסימת ולהוסיף על התאים.
7. מודיית את התאים עם הנוגדן העיקרי לילה ב 4 ° c.
8. למחרת, לבצע 3 שוטף עם PBS/0.1% טריטון X-100.
9. לדלל נוגדן משני (אלקסה פלורינציה 595) 1:1000 במאגר חסימת ולהוסיף על תאים.
   1. בצע את כל הincubations בחושך בשלבים הבאים כמו נוגדנים משני מצועם אלקסה Fluor הם רגישים באור.
10. מודיית את הנוגדן המשני עבור 2 h ב RT.
11. לבצע 3 שוטף עם PBS/0.1% טריטון X-100.
12. לדלל DAPI (1 מ"ג/mL) 1:4000 עם PBS/0.1% טריטון X-100 ולהוסיף על תאים.
13. דגירה את התאים עם DAPI עבור 10 דקות ב RT.
14. הר את התאים עם הר אקווה.
15. התמונה התאים עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בהגדלה 63 x.
16. עיבוד וצבע מדומה לתמונות באמצעות התפלגות ImageJ, פיג'י²⁵.

תוצאות

תוכנית כללית של מערכת ההצלה המותנית
איור 1 מראה את התוכנית מיקוד כדי להציל באופן מותנה תאים מבוססי KO עם או WT או כלוב-המוטציות (Y365A) המתבטאת כי הוא מתבטא מתוך לוקוס מסוגני. לאחר הפסקת הפעולה של ה-PRC2, יחידת משנה של הליבה החיונית עבור היציבות והפעילות האנזימטית שלה, קל...

Discussion

גישה רבת עוצמה כלפי הבנת הפרטים המכניים במהלך היווצרות תחום כרומטין נתון, היא לשבש תחילה את התחום ולאחר מכן לעקוב אחר השיחזור שלה במהלך התאים. התהליך יכול להיות מושהה בכל עת במהלך השיקום כדי לנתח בפרוטרוט את האירועים המתבצעים. המחקרים הקודמים על תחומים כרומטין לא היו מסוגלים לפתור אירועי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg)	Sigma	H7904-5MG	For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml)	Electron Microscopy Sciences	15710	For immunofluorescence
2-mercaptoethanol	LifeTechnologies	21985-023	For mESCs culture
2% Gelatin Solution	Sigma	G1393-100ml	For mESCs culture
Accutase 500 ML	Innovative Cell Tech/FISHER	AT 104-500	For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresaerch	711-585-152	For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium	FISHER/VWR	41799-008	For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK	Fisher Sci	177445PK	For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg	Life Tech	D1306	For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901	Stemgent	04-0006	For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein	Millipore/Fisher	ESG1107	For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified	Atlanta	S10250	For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L	For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021	Stemgent	04-0004	For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB	Cell Signaling	9728S	Antibody for ChIP-seq
H3K27me3	Cell Signaling	9733S	Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb)	Active motif	39715	Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM	Invitrogen	10829-018	For mESCs culture
L-glutamine	Sigma	G7513	For mESCs culture
Lipofectamine 2000	LifeTech	11668019	For transfection
MangoTaq DNA Polymerase	Bioline	BIO-21079	For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma/Roche	P0781	For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution	Lucigen	QE0905T	For Genotyping PCR
Triton X-100	Sigma	T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K270020	For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1			Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2			Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible			Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor			https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible			Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor			https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1			Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1			Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1			Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1			Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2			Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2			Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.