שיפור הדיוק של הערכה להערכת הזרימה של הפוטנציאל לממברנה מיטוכונדריאלי בתאי המטפאות ובתאים באמצעות עיכוב של משאבות אפלוקס

Summary

משאבות xenoביוטיקה פעילים מאוד בתאי גזע ומחולל קדמון (HSPCs) ולגרום שחול TMRM, קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאל לצבוע פלורסנט. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במדויק פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי ב HSPCs על ידי TMRM בנוכחות Verapamil, מדכא משאבת משאבה.

Abstract

כמו חילוף החומרים הסלולר הוא וסת המפתח של תא גזע המטבית (HSC) התחדשות עצמית, התפקידים השונים שיחק על ידי המיטואיטין הומאוסטזיס ההטיות כבר נחקרו בהרחבה על ידי חוקרים HSC. רמות פעילות מיטוכונדריאלי משתקפות בפוטנציאל הממברנה שלהם (ΔΨm), שניתן למדוד אותם על-ידי שלבים העלולים להיות מיועדים לצבעים כגון TMRM (טטרמתיל, מתיל אסתר). היכולת של משאבות אפלוקס להבלטת צבעים אלה מתאים יכולים להגביל את התועלת שלהם, עם זאת. הטיית המדידה המתקבלת היא קריטית במיוחד בעת הערכת HSCs, כשטרנספורטי מובילים מציגים רמות גבוהות יותר של ביטוי ופעילות ב-HSCs מאשר בתאים המובחנים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ניצול Verapamil, מעכב משאבת משאבה, כדי למדוד במדויק ΔΨm על פני אוכלוסיות מרובות מח עצם. העיכוב כתוצאה של פעילות המשאבה מוצג כדי להגביר את עוצמת TMRM בתוך המטפאות גזע ומחולל קדמון (HSPCs), תוך השארת אותו ללא שינוי יחסית בשברים בוגרים. פעולה זו מדגישה את תשומת הלב הקרובה לפעילות צבען-אפלוקס הדרושה כאשר משתמשים בצבעים תלויי-ΔΨm, וכמו שכתוב ודמיינו, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי להשוות בין אוכלוסיות שונות בתוך מח העצם, או באותה אוכלוסייה על-פני דגמים ניסיוניים שונים.

Introduction

תאי גזע המטפאות (HSCs) מחדשים את עצמם, רב-עוצמה, ומסוגלים להצמיח את כל תאי הדם^1,2. מטבוליזם הסלולר הוא וסת מפתח של תחזוקה hsc, יחד עם גורמים transcript, אותות פנימיים ומיקרואקולוגיה^3,4,5. השליטה הנכונה של תפקוד מיטוכונדריאלי ואיכות הוא אפוא קריטי לתחזוקת hsc^6,7.

פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ΔΨm) הוא פרמטר מפתח להערכת המיטו, כפי שהוא משקף ישירות את הפונקציונליות שלהם, אשר נובעת משיווי משקל של פעילות שאיבה פרוטון בשרשרת התחבורה אלקטרון וזרימת פרוטון דרך F ₁/F_O ATP סטנדרטים. אלה הן נדרשות (בהתאם לביטוי הגנים וזמינות המצע) עבור זירחון תלוי-החמצן של ADP ל-ATP^8,9. לנצל את אלקטרושליליות של תא מיטוכונדריאלי, צבעים שונים בפוטנציאל פותחו כדי למדוד ΔΨm. אחד מהם הוא טטרמתיל מתיל (TMRM), אשר שימש בהרחבה כדי למדוד ΔΨm על ידי זרימה cy, לנסות במגוון של תאים¹⁰, כולל גזע המטפאות ובתאי מחולל¹¹.

צבעים מיטוכונדריאלי חייב להיות בשימוש עם כמה זהירות ב HSCs, עם זאת, מכיוון הפעילות הגבוהה של משאבות xenobiotic יוטי של תאים אלה יכול לגרום לצבוע שחול¹². אכן, שחול של צבעים מיטוכונדריאלי כגון Rhodamine 123 התיר לחוקרים לבודד HSCs¹³ או לזהות hsc "אוכלוסיות צד" על ידי ניצול ההבלטה הדיפרנציאלי של הצבעים כחול הכחול האדום^{14, 15}. כמו כן הוכח כי הג ג'ין, חוסם מסוים של ה-ATP-משפחה של הקלטת משנה G-חבר 2 (ABCG2) טרנספורטר, אינו משפיע על דפוס הצביעת של MitoTracker ב HSPCs¹⁶. לאחר פרסום של תוצאות אלה, מחקרים מרובים בוצעו באמצעות צבעים מיטוכונדריאלי בהעדר מעכבי משאבת xenobiotic יוטי, המוביל הרושם הנרחב כי HSCs יש רק מספר קטן של המיטולוגיה עם נמוך ΔΨm^{16 ,} מיכל ^{בן 17 ,} . ^{שמונה עשרה}

לאחרונה, זה הוכח, עם זאת, כי Verapamil, מעכב ספקטרום רחב של משאבות אפלוקס, משנה באופן משמעותי את דפוס הצביעת של מיטוכונדריאל מימעקב ירוק¹⁹. פער זה סביר בגלל העובדה כי FumitAbcg2 ג ' ין הוא סלקטיבי מאוד עבור, בעוד HSCs גם לבטא מובילים אחרים כגון Abcb1a (אשר רק רגיש חלש כדי Fumit, ג'ין ג)¹⁹. אנו דיווחו גם כי צבעים מיטוכונדריאלי אחרים, כגון TMRM, Nonyl כתומה כתום, ו Mitotracker אורנג ' (MTO) התערוכה דפוסים כמו מיטומו גרין. חשוב מכך, הבחנו בכך שדפוסי הזרימה של HSPCs משקפים את ΔΨm בנוסף למסה מיטוכונדריאלי¹¹.

צריכת הצבע TMRM תלוי בקפדנות על המטען השלילי של המיטומטר, אבל הצטברות של צבע כתוצאה מכך הוא באיזון תמידי בין צריכת והסיווג שלה על ידי משאבות אפלוקס²⁰. ההבדל בביטוי xenobiotic יוטי משאבת בין HSCs ואוכלוסיות תאים בוגרים משפיע על איזון זה יכול להוביל לתוצאות מוטה. השימוש של מעכבי ייעודי כגון Verapamil צריך להיחשב ניתוח של ΔΨm על ידי צבעים בעלי פוטנציאל ממטרי. כאן אנו מתארים פרוטוקול שונה עבור מדידה ΔΨm מדויקת על ידי מבוססי TMRM הזרימה cy try אשר מתקן עבור פעילות השיגור xenobiotic יוטי באמצעות מעכבי ייעודי.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה.

1. הכנת פתרונות

1. צביעת מאגר (מלוחים באגירה פוספט (PBS) + 2% סרום של שור עוברי (FBS)): להוסיף 10 מ ל של FBS 500 mL של פתרון PBS סטרילי.
   הערה: ניתן לאחסן פתרון זה ב -4 ° c למשך חודש אחד לפחות במצב סטרילי. לפני תחילת ההליכים הבאים, לשים סדרת מחלקים של הפתרון הזה (50 mL) על קרח.
2. ACK (אמוניום-כלוריד-אשלגן) לישיר מאגר: מניחים מאגר של ACK ליסינג (1 מ ל) על הקרח לפני תחילת ההליך.
   הערה: כדי להכין את אותו מאגר לא מסחרי, לפזר 8.02 g של NH₄Cl, 1 גרם של khco₃ ו 37.2 mg של Na₂Edta ב 1 L של H₂O. כוונן את ה-pH ל 7.2-7.4. חנות עד 6 חודשים בטמפרטורת החדר.
3. תרבות בינונית: להוסיף 50 ng/mL מארז הגזע (SCF) ו 50 ng/mL הטרובפיאה (TPO) למדיום ללא סרום לתרבות והתרחבות של התאים המטבטיים (ראה טבלת חומר עבור מסחרי בינוני מומלץ).
4. פתרון מניות TMRM: להכין את TMRM (1 μM) פתרון על ידי המסת 5 μg של אבקת TMRM ב 10 מ ל של אתנול. אחסן פתרון זה ב-20 ° c מוגן מפני האור.
5. פתרון מלאי verapamil: להכין Verapamil (50 מ"מ) פתרון על ידי דילול 24 מ ג של Verapamil ב 1 מ ל אתנול. אחסן פתרון זה ב-20 ° c.
6. הפתרון של מניות FCCP: להכין קרבונאנציאניד p-triflouromeהידרצילההידרטזון (FCCP) (1 M) פתרון על ידי המסת 254 mg ב 1 מ ל אתנול. אחסן פתרון זה ב-20 ° c מוגן מפני האור.

2. מח עצם בידוד

1. המתת חסד העכבר על ידי CO₂ אינהלציה בעקבות ההנחיות המוסדיים ולרסס את העכברים עם 70% אתנול.
   הערה: שלב זה מונע זיהום של תאי העניין מבלי להתפשר על תוצאות נסיוניות.
2. באמצעות זוג מלקחיים ומספריים חדים, לבצע חיתוך קטן בעור הגחוני של העכבר ולמתוח את העור.
3. לחלץ את עצם הירך ואת השוקה בזמן שאתה מטפל לא לעקור את ראשי הירך כפי שהם מכילים כמות גדולה של תאים מח עצם. מניחים את העצמות שהוסרו בצלחת 6-היטב מלא 1.5 mL של מאגר הצביעת.
   הערה: הליך זה אינו דורש אזור סטרילי.
4. להסיר את השרירים מן העצמות לחתוך את קצות העצמות המאפשר את היציאה של מח העצם (איור 1A). מניחים את העצמות הנקיות בבארות חדשות עם 1.5 mL של מאגר הצביעת.
   הערה: השרירים ורקמות אחרות יש להסיר בזהירות כדי למנוע סתימת מזרק בשלב הבא.
5. לרוקן את מח העצם באמצעות מזרק 3 מ ל עם מחט של 25 גרם.
   הערה: המשך לשטוף את מח העצם עד העצם הופך לבן (איור 1B).
6. לאסוף את כל התאים בצינור 1.5 mL, צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 180 x g ואז לבטל את supernatant (איור 1c).
7. להשעות מחדש את הגלולה ב 300 μL של קרח קר ACK ליטל מאגר מאוד בזהירות, לשים על קרח 1 דקות ומיד הליזה לא פעילה על ידי הוספת 1 מ ל של מאגר הצביעת. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 180 x g.
   הערה: גלולה התאים מופיע לבן (איור 1D). המספר הכולל של תאים מבודדים הוא כ 2-4 x 10⁷.
8. השהה מחדש את כדורי ב 1 מ ל של מאגר הצביעת והמסנן באמצעות כובע תא מסננת (12 x 75 מ"מ², 5 מ ל קיבולת) עם רשת הניילון 35 יקרומטר משולב כדי להשיג תאים mon, ברורים. לאחר חסימת, לשמור את הדגימה על קרח.

3. חיסוני זיהוי של HSC

1. הכנת קוקטייל שושלת יוחסין (Lin). ב 400 μL של מאגר כתמים, להוסיף 4 μL של נוגדנים biotinilated הבאים נגד CD3e, CD4, CD8, B220, CD11b, Gr1, Ter119, CD19, Nk 1.1, IgM ו-Il7Ra כדי להשיג דילול סופי 1:100.
2. להכין fluorophores מצופף-נוגדנים (Abs). ב 400 μL של מאגר כתמים, להוסיף 4 μL של Abs הבא כדי לקבל דילול סופי 1:100. Streptavidin-פסיפיק כחול, Sca1-PE/Cy7, c-kit-APC/Cy7, CD48-APC, CD150-PerCP/Cy 5.5 ו-CD34-FITC. . לשמור על קרח, מוגן מפני אור
3. צנטריפוגה את המדגם עבור 5 דקות ב 180 x g, ואז למחוק את supernatant.
4. הוסף 400 μL של תמיסת הקוקטייל לין לגלולה התאים. הוסף 4 μL של CD135-biotinilated Ab. מערבולת במהירות כדי לערבב ו דגירה עבור 30 דקות בקרח.
5. לשטוף את המדגם הוספת 3 מ ל של מאגר כתמים, ספין למטה עבור 5 דקות ב 180 x g ולהיפטר supernatant.
6. הוסף 400 μL של פתרון Abs. וורטקס במהירות כדי לערבב ו להדגירה עבור 30 דקות על הקרח.
7. לשטוף את הדגימות עם 3 מ ל של מאגר הצביעת, ספין למטה עבור 5 דקות ב 180 x g ולהיפטר supernatant.

4. מכתים TMRM

1. הכן פתרון לצביעת TMRM. הוסף 2.2 μL של פתרון מניות TMRM ו 1.1 μL של Verapamil (2 ננומטר ו 50 μM כריכוז סופי, בהתאמה) ב 1.1 mL של בינונית ללא סרום עבור תרבות והתרחבות של תאים המטדותיים (ראה טבלת חומר עבור בינוני מסחרי מומלץ) עם tmrm ו-SCF.
   הערה: . זה הצעד החשוב ביותר בפרוטוקול בנוסף verapamil הכרחי כדי לחסום את משאבות אפלוקס אשר מבוטא במידה רבה ב-HSCs והוא יכול הבלטת TMRM.
2. להשעות מחדש את מח העצם ב 1 מ ל של פתרון TMRM צביעת, מערבולת במהירות ו-דגירה של 1 h ב 37 ° c.
   הערה: אין לשטוף כתמים של TMRM. בקרת פיצוי מסור PE מושעית גם ב-100 μL של פתרון TMRM הצביעת, והוא נתון לדגירה של 1 h ב 37 ° צ' לאחר מערבולת מהירה.
3. לסנן את המדגם באמצעות כובע תא מסננת (12 x 75 מ"מ², 5 מ ל קיבולת) עם רשת משולבת 35 יקרומטר ניילון משולבים כדי למנוע סתימת של cytometer הזרימה.
   הערה: צביעת TMRM מגדילה את האפשרות להדביק את המבנה במדגם. סינון המדגם ממש לפני הזרמת מאמר מומלץ.
4. להוסיף 1 μL של 4, 6-diamidino-2-פנייילינדול (DAPI) כדי לא לכלול תאים מתים על ידי הזרמת cy, לנסות.

5. רכישה באמצעות ממיר זרימה

1. להריץ דגימת מח עצם ולרכוש לפחות 1 x 10 שישה אירועים.
2. הגדר את אסטרטגיית האיסוף כדי לזהות את האוכלוסיות המטפאות השונות (איור 2).
   1. להציג מח עצם חי מונו-תאים גרעיניים (BM-MNCs), dapi-שבר, בעלילה עבור האוקיינוס השקט הפסיפי כדי לזהות CD135-lin-(לין-י) ו-lin⁺ שברים.
   2. מגרש לין-שבר עבור APC/Cy7 (c-kit) לעומת PE/Cy7 (סקה -1) כדי לזהות השבר ושלתי רב עוצמה (MPP), כמו c-kit⁺ ו-סקה -1⁺.
   3. מגרש MPP שבר עבור APC (CD48) לעומת PerCP/Cy 5.5 (CD150) כדי לזהות שבר HSC, כמו CD150⁺ ו CD48-.
   4. הצגת שבר HSC עבור FITC (CD34) לחלקCD34-hsc ו CD34⁺-hsc.
3. השג את עוצמת TMRM (ערוץ PE) בכל אוכלוסיה.
4. לאחר הרכישה, להוסיף למדגם 1 μL של FCCP כדי לקבל את הריכוז הסופי של 1 מ"מ ו-דגירה ב 37 ° c עבור 5 דקות, לאחר מכן לרכוש 1 x 10⁶ אירועים.
   הערה: FCCP הוא מצמד מיטוכונדריאלי אשר משמש להפיג את ΔΨm. הוא משמש כפקד ניסיוני כדי לוודא שצביעת TMRM פועלת כהלכה. לאחר הממשל של FCCP ס, עוצמת TMRM צריכה להיות מצומצמת באופן דרסטי (איור 3A).
5. ניתוח נתונים מנרמל את העוצמה הממוצעת של PE של כל אוכלוסייה בעוצמת PE של כל מוניטור-MNCs.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר בידוד קל של BM-MNCs ממודל העכבר. איור 1 מסכם את השלבים העיקריים של הפרוטוקול: בידוד עצם, הריקון מתוך מח העצם, לפירוק תא דם אדום, וכתמים נוגדן ואחריו tmrm כתמים כדי למדוד פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי באוכלוסיה מסוימת המטתית .

BM-MNCs מכילים מ?...

Discussion

המדידה הפוטנציאלית של קרום מיטוכונדריאלי היא אבן פינה של ניתוח והערכה של המיטו, אשר הם קריטיים למצב המטבולית של התא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח של ΔΨm על ידי כתמים TMRM. TMRM הוא צבע הניאון האמור לצבוע אשר מצטבר פעיל המיטומטר בשל ΔΨm, ואת הרמות המתאימות שלה להישאר בשיווי משקל בין מסחטות, cytopl...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ACK lysing buffer	Life Technologies	A1049201
B220-biotin	BD Bioscience	553086
CD3e-biotin	Life Technologies	13-0031-85
CD4-biotin	Fischer Scientific	BDB553782
CD8-biotin	Life Technologies	13-0081-85
CD11b-biotin	BD Bioscience	553309
CD19-biotin	BD Bioscience	553784
CD34-FITC	eBioscience	11-0341-85
CD48-APC	eBioscience	17-0481-82
CD135-biotin	eBioscience	13-1351-82
CD150-PerCP/Cy5.5	Biolegend	115922
c-kit-APC/Cy7	Biolegend	105826
Cyclosporin H	Millipore Sigma	SML1575-1MG
DAPI solution (1 mg/mL)	Life Technologies	62248
Fetal Bovine Serum (FBS)	Denville	FB5001-H
FCCP	Millipore Sigma	C2920-10MG
Gr1-biotin	Biolegend	108404
IgM-biotin	Life Technologies	13-5790-85
Il7Rα-biotin	eBioscience	13-1271-85
Nk1.1-biotin	Fischer Scientific	BDB553163
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	10010023
Sca-1-PE/Cy7	eBioscience	25-5981-81
SCF murine	PEPROTECH	250-03-10UG
StemSpan SFEM medium	STEMCELL technologies	9605
Streptavidin-Pacific Blue	eBioscience	48-4317-82
Ter119-biotin	Fischer Scientific	BDB553672
TMRM	Millipore Sigma	T5428-25MG
TPO	PEPROTECH	315-14-10UG
Verapamil hydrochloride	Millipore Sigma	V4629-1G