שחפת מולקולרית העמסה בקטריאלי שיטת (TB-MBLA)

Summary

אנו מתארים שחפת בקטריאלי מולקולרית בדיקת שיטת העומס שבוצעה לאחר הפעלת החום של sputum. הפעלת החום מספקת דגימות רוק לא זיהומיות וברור את הצורך הבלימה ברמה 3 מעבדות לבדיקות מולקולריות של שחפת.

Abstract

שחפת נגרמת על ידי שחפת של פטרת (Mtb), פתוגן המסווגים על ידי האו ם (האו מ) כחומר ביולוגי B קטגוריה מסוכן. למען בטיחות העובדים, טיפול של כל הדגימות המשוער לשאת Mtb חייב להתבצע ברמת הבלימה (CL) 3 מעבדה. מבחן העומס חיידקי מולקולרי של TB (TB-MBLA) הבדיקה היא הפוכה הטרנסקריפטאז תגובת שרשרת פולימראז כמותית (RT-qPCR) מבחן כי כימות עומס Mtb הלסת באמצעות התחל ובדיקות כפולות כפול עבור שנות ה-16 rRNA. אנו מתארים את השימוש בחום הפעלה לעיבוד דגימות TB ללא זיהומיות תוך שמירה על RNA עבור TB-MBLA. 1 mL סדרת מחלקים של דגימת רוק סגור היטב 15 מ ל צינורות צנטריפוגה מבושלים 20 דקות ב 80 ° c, 85 ° c, או 95 ° צ' כדי להשבית Mtb bacilli. טיפוח החום מופעל ושליטה (חי) דגימות עבור 42 ימים אישר את מותו של שחפת. המדגם מופעל ואז מחודדים עם 100 μL של בקרת החילוץ RNA מופק בעקבות הליך רגיל בידוד RNA. לא נצפתה צמיחה בתרבויות הטיפול בחום. RNA מבודד הוא נתון RT-qPCR בזמן אמת, אשר מגבירה מטרה ספציפית ב-Mtb 16S rRNA גן, מניב תוצאות בצורה של מחזורי כימות (Cq). עקום רגיל משמש כדי לתרגם Cq לתוך עומס חיידקי, או המשוער מושבה היווצרות יחידות ל-mL (eCFU/mL). קיים קשר הפוך בין Cq לבין העומס החיידקי של המדגם. המגבלה היא כי חום ההפעלה lyses כמה תאים, חשיפת RNA ל-RNases כי לגרום לאובדן של < 1 יומן₁₀Ecfu/ml (כלומר, < 10 cfu/ml). מחקרים נוספים יקבעו את היחס של מטופלים נמוכים מאוד העמסה הגורמות תוצאות שליליות שווא בשל הפעלת החום.

Introduction

נגרמת על ידי שחפת של פטרת (Mtb), מעל 7 x 10⁶ מקרים חדשים של שחפת (TB) מדווחים ברחבי העולם אשר מעל 1 x 10⁶ למות^{בשנה 1,2}.¹ כדי להפוך את המגמה, ארגון הבריאות העולמי (מי) השיקה גישה שלוש-עמוד כולל פיתוח כלים יעילים אבחון וטיפול³. מסווג כחומר ביולוגי מסוכן B על ידי האו ם, עבודה עם דגימות משוער חיובי עבור Mtb דורש רמת הבלימה (CL) של 3. מעבדות CL3 יקרות לבנות ולתחזק. כתוצאה מכך, ברוב המדינות יש שירותי תרבות של TB ברמות האזוריות או הלאומיות. משמעות הדבר היא כי מיקרוסקופ הכתם הוא כלי האבחון הזמין ביותר במתקני הבריאות ההיקפית.

יש המבקשים ליישם בדיקות מולקולרית מהירות כמו xpert MTB/ריף ברמה 4 מתקני בריאות, הממוקם בעיקר ברמות המחוז^4,5. חלק מהמחוזות גדולים למדי ופחות נגישים לחלק מהאנשים. בזמן שהוא מועיל, Xpert MTB/ריף עובד על ידי גילוי ה-DNA Mtb. ה-DNA היא מולקולה יציבה שתשרוד זמן רב לאחר התאים מתו ולכן הוא לא תקן טוב למדידת תאים קיימא קריטי עבור התגובה טיפול בניטור^5,6. RNA מבוססי בחני מציעים חלופה למדידה מדויקת של תאים קיימא^{7,8,9,10,11,12,13}. רנ א קיים במינים שונים של יציבות משתנה: הריבוזוממה RNA (rRNA), העברת RNA (tRNA), ו-RNA שליח (mRNA). RNA מסנג קשור לביטוי הגנים ולכן הקשר הקרוב ביותר לפעילות התאים והכדאיות¹⁴. חשוב לציין כי היעדר ביטוי גנטי אינו שווה ערך למוות של תאים, כי פתוגנים כמו Mtb ידועים להתקיים במצב לא פעיל (רדום) אבל מדינות קיימא^15,16. יציבה מינים RNA כגון rRNA הם ולכן סמנים טובים יותר של מצבים פעילים ובלתי פעילים של תאים קיימא.

באמצעות es, הכלאיים coli, שרידן הראה כי 16 s rrna באופן פרופורציונלי גדל עם צמיחה בקטריאלי הנמדד על ידי מושבה היוצרים יחידות (cfu) ספירות¹⁷. הייתה ירידה בו בספירות CFU ו-16 rRNA כאשר חיידקים E. coli נחשפו אנטיביוטיקה. הנפילה ב rrna לאחר מוות התאים היה אינדיקטור כי ניתן להשתמש בו כסמן עבור הכדאיות התאית^13,17. רישום מתוך עיקרון זה, שחפת מולקולרית העמסה בקטריאלי העומס (TB-mbla) פותחה עבור מיקוד M. שחפת 16s rrna כדי למדוד את העומס שחפת קיימא באמצעות הלסת כסמן של תגובת הטיפול עבור חולים נגד שחפת טיפול^11,18,19. פיתחנו עוד ואופטימיזציה של TB-MBLA לשלב שליטה החילוץ הסלולר המשקף הליזה של M. שחפת באקל והוא חזק בהגדרות סביבתיות שונות²⁰. ההליך TB-MBLA דורש את הצעדים הראשונים של בידוד RNA מ Mtb להתנהל במעבדה CL3 עד Mtb תאים הם לגמרי להבטיח כדי לוודא את ביטחונם של העובדים. כמו כן, הוא כולל שימור לדוגמה לניתוח רטרוספקטיבי לצורך הטיפול ב-80 ° c בguanidine thiocyanate, חומר רעיל ברמה 4. לצורך זה, השתמשנו בחום כדי השבית Mtb ולהפוך דגימות בטוח עבור TB-mbla להתבצע במעבדות ברמה מיקרוסקופ להכפיש.

השימוש בחום ביישומים מעבדתיים וקליניים כבר במשך מאות שנים^21,22. עם זאת, כמה מיקרואורגניזמים כמו Mtb קשה להרוג, וחשיפה קצרה יותר לחום אינו מספיק כדי להרוג את כל התאים^23,24. מחקר עולה כי 20 דקות חימום של שחפת התרבויות ב 80 ° c הרג את כל Mtb חיידקים בלי להרוס את הדנ א הדרושים ל-PCR²⁵. לאחר מכן, מספר טכניקות הוצאת DNA מעבדה כיום חום 95 ° c. יש לנו את אותו עיקרון להראות כי הרתיחה דגימות שחפת ב-80 ° c, 85 ° צ', או 95 ° c מפעיל Mtb תוך שמירה על RNA מספיק עבור TB-MBLA להתבצע. תרבות או רוק ניתן לשמור במיכלים סגורים היטב בטמפרטורת החדר או בקירור במשך 7 ימים מבלי להקטין את כמות rrna.

TB-MBLA, המשמש כיום לשימוש מחקר בלבד (RUO) הבדיקה היא הסתגלות והוחל על סוגים שונים לדוגמה כולל sputum, רקמת ריאות, ונוזל השדרה מוחין. זה עדיין להחיל על ברונכיט מכתשי נוזל, דם, וסוגים אחרים לדוגמה. באמצעות רוק כמו המדגם, תוצאות הערכת ריבוי אתרים באפריקה (נתונים שלא פורסמו) ואת הפרסומים הקודמים^{18, 26 להראות26} כי הרגישות של mbla הוא עקבי עם מחוון הצמיחה של המחוון הגדילה של פטרת (mgit) נוזלי. עם זאת, TB-MBLA הוא מהיר יותר, מתן תוצאות בשעות בניגוד לימים או שבועות של תרבות, ספציפי, לא מושפע מיקרואורגניזמים שאינם TB במדגם, ונותן מידה כמותית של חומרת המחלה. מי שזיהה לאחרונה TB-MBLA כמועמד להחליף מיקרוסקופ הכתם ותרבות עבור ניטור הטיפול בשחפת².

במאמר זה אנו מתארים בפירוט את ההפעלה החום ואת TB-MBLA הפרוטוקול שפורסם ב Sabiiti et al.²⁷. פרוטוקול מפורט זה יספק משאב חזותי של עצירה אחת עבור משתמשי TB-MBLA ברחבי העולם.

Protocol

1. הכנה לדוגמא

1. תרבות
   1. עבודה על ספסל נקי או מחלקה 1 בקתה, הקציר 1 mL של השלב האקספוננציאלי של באקלוס Calmette-Guérin (BCG) התרבות לתוך 15 מ ל שפופרות צנטריפוגה פלסטיק. . סגרו היטב את הצינורות
      הערה: כדי לעבד מדגם שלם של 5 מ ל, 5 15 מ ל שפופרות צנטריפוגה נדרשות.
      זהירות: ארון בטיחות ביולוגי נדרש בעת עבודה עם כל תרבות שחפת.
2. דגימה מחולה
   1. עבודה בחלל מאוורר היטב ללבוש מסכה באף, בזהירות לפתוח את הדגימה, הפיפטה 1 mL לתוך 15 mL מצינורות צנטריפוגה פלסטיק לסגור היטב את הצינורות.
      הערה: עצה פה רחבה מומלצת לפיטום. באמצעות זוג מספריים, לגזור את החלק היפה של הקצה 1 mL כדי ליצור פה רחב יותר.

2. הפעלת חום

1. לפני ההכנה לדוגמא, קבעו את מרחץ המים עד 95 ° c.
   הערה: הטמפרטורה 95 ° c מגדיל את הסיכוי להפחית את הפעילות RNase וכך לשמר RNA יותר עבור במורד TB-MBLA.
2. להעביר את הצינורות לדוגמה לארון האחיזה שקוע באמבט מים. ודא כי שלושה רבעים של כל שפופרת דגימה שקוע במים.
3. מרתיחים ב 95 ° צ' עבור 20 דקות, ואז להעביר את הצינורות אל הספסל להתקרר בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות לפני תחילת החילוץ RNA.
   הערה: הפעלת חום מוחלטת של M. שחפת באקול ו-bcg אומת על ידי מארג החום בדגימות ושולטת ב 37 ° c עבור 42 ימים כדי לאמת את הצמיחה. מדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD₆₀₀) נלקח בתוכנית הבסיסית ולאחר מכן שבועי לתקופת הדגירה 42 יום.

3. הפקת רנ א

הערה: תהליך הפקת ה-RNA המתואר כאן הוא עבור ערכת ה-RNA המופיעה בטבלת החומרים. אחרים מתאימים RNA ערכות החילוץ על ידי יצרנים שונים ניתן להשתמש.

1. הוספת בקרת חילוץ (EC)
   1. העברה 1 mL הפחתת דגימות חום המופעל כדי 1.5 mL צינורות. ספייק 100 μL של EC לתוך כל מדגם, לסגור את הצינור, ולערבב ידי היפוך הצינור הפוך 3x.
      הערה: ה-EC מסופק עם ערכת החיידקים החיוניים של TB-MBLA (טבלת חומרים).
2. משקעי תאים
   1. באמצעות מיקרוצנטריפוגה שחקן ספסל, צנטריפוגה את הצינורות ב 20,000 x g עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר. . משאיר 50 μL של משקעים
   2. להשעות את המשקע ב-950 μL של מאגר הליזה על ידי ליטוף למעלה ולמטה, ולהעביר את ההשעיה כולה לתוך צינור מטריצה lysing סיפק עם ערכת החילוץ RNA (לוח חומרים). ודא כי הצינורות סגורים היטב לתייג הן את המכסה ואת הצד של הצינור.
3. לפירוק התא, להעביר את הצינורות משלב 3.2.2 לתוך הומוגניצר. הומוגון לסדר את הדגימות עבור 40 s ב 6,000 סל ד.
4. חומצות גרעין טיהור
   1. צנטריפוגה את הליפוסט משלב 3.3 בשעה 12,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. הכינו שפופרות טריות מ-mL והוסיפו 300 μL של כלורופורם לכל צינור.
   3. שימוש 1 mL טיפ בזהירות הצינורות מבלי לגעת במטריקס ליסינג.
   4. העבר את סופרנטאנט לכלורופורם המכיל צינורות ומערבולת עבור 5 s. השאר את השפופרת להתפשר על 5 דקות או יותר עד שלושה שלבים (העליון, האמצעי והתחתון) גלויים בבירור.
   5. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. פיפטה בזהירות את השלב העליון ולהעביר לצינורות טריים 1.5 mL.
   6. כדי הצינורות בשלב 3.4.5, להוסיף 500 μL של קרח קר 100% אתנול, לסגור את הצינורות, ולערבב על ידי בעדינות היפוך 3x הפוך. מודקון את הצינורות ב-80 ° c עבור 15 דקות או 20 ° c עבור 30 דקות ולהמשיך את החילוץ, או לעזוב ב-20 ° c ללילה כדי להשלים את החילוץ למחרת.
   7. הגדר את המיקרוצנטריפוגה ל -4 ° c והמשך להתקרר לפחות 12 ° צ' לפני שהוא מתחיל בצנטריפוגה. לטעון את הצינורות לתוך מיקרוצנטריפוגה ו צנטריפוגה עבור 20 דקות ב 13,000 x g. להיפטר supernatant, להחליף עם 70% האתנול קר הקרח, ו צנטריפוגה לעוד 10 דקות ב 13,000 x g.
      הערה: את 70% אתנול יש לעשות עם נוקלאז כיתה מולקולרית מים ללא תשלום.
   8. התעלם משלב ה3.4.7 והעבר את הצינורות לחממה שנקבעה ב-50 ° c. דגירה של 20 דקות כדי לייבש את RNA/הגלולה DNA. לשמור על צינורות פתוח חלקית כדי לאפשר אידוי של כל אתנול.
   9. הוסף 100 μl של המים החופשיים נוקלאז לגלולה יבש ו דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. מערבולת עבור 3 s כדי לערבב את התוכן.
      הערה: בשלב זה ניתן לאחסן את התמצית 2-3 ימים במקרר או יותר ב-80 ° c עד שסעיף 3.5 מבוצע.
5. הסרת דנ א
   הערה: שלב זה חיוני משום שנוכחות הדנ א בתמצית מבטלת את תוצאת ה-MBLA. סעיף זה מבוסס על ערכת הסרת DNA (טבלת חומרים).
   1. להכין שילוב של האנזים DNase I 10x במאגר ו DNase I האנזים עבור מספר דגימות (10 μL של מאגר ו 1 μL של DNase לדוגמה) פלוס 10% נוסף כדי לכסות כל הפסד מתוך ליטוף. מערבבים על ידי vortexing ואז פיפטה 11 μL לתוך כל צינור המכיל את התמצית RNA.
   2. מערבבים על ידי vortexing 3 s ולאחר מכן ספין בקצרה (10 s ב 13,000 x g) כדי להסיר כל טיפות על הקירות. דגירה ב 37 ° c עבור 30 דקות בבלוק חם או בחממה. הוסף תוספת 1 μL של האנזים DNase I ישירות לתוך כל צינור, לערבב היטב על ידי vortexing, ו דגירה עבור 30 דקות נוספות ב 37 ° c.
   3. הפשרת ההפעלה הכימית של DNase מגיב 10 דקות לפני סיום הדגירה של DNase. מערבולת 20 s להבטיח הומוגנית, חלבי הבולם ולאחר מכן להוסיף 10 μL של הפעלה מגיב DNase לתוך תמצית RNA משלב 3.5.2.
   4. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. מערבולת 3x במהלך 5 דקות דגירה שלב.
   5. צנטריפוגה את התערובת ב 13,000 x g עבור 2 דקות. בזהירות להעביר את supernatant כדי 1.5 ML RNase צינורות חינם בלי לגעת באף אחת המטריצה הפעלה.
   6. לאחסן את תמצית RNA במקרר אם הפעלת RT-qPCR באותו יום או ב-80 ° c עבור אחסון לטווח ארוך.

4. הפוך טרנסקריפטאז qPCR

1. עבור דגימות לא ידועות, לדלל את כל תמציות RNA לשמש ביחס 1:10 RNase מים חינם. מערבבים היטב על ידי vortexing עבור 5 s ובקצרה ספין למטה כדי להסיר כל טיפות או בועות אוויר.
2. עבור דגימות סטנדרטיות עבור עקומת רגיל, לקחת את הסטנדרטים Mtb ו-EC-RNA מ-80 ° c מקפיא ולהפשיר בטמפרטורת החדר. הפוך שבעה ו-6 10 מקפלים לקפל של דגימות סטנדרטיות של Mtb ו-EC בהתאמה. שנה את העצות לפני העברת התערובת מצינורית אחת לשנייה.
   הערה: דגימות סטנדרטיות מסופקות עם ערכת TB-MBLA.
3. הכנה לתמהיל שורים
   הערה: שילוב מאסטר (MM) הוא פתרון של ריאגנטים PCR המספיק כדי להגביר את כל הדגימות, התקנים והמים לצורך בקרת תבנית (NTC). המים המשמשים NTC צריך להיות אותו מים בשימוש בחילוץ ולהכנת MM. ודא כי הסטנדרטים, כל דגם RNA, והדילול העשרוני שלה מוגבר ב-2x עבור ההמרה הפוכה חיובית (RT +) ו-1x עבור שלילי ההמרה הפוכה (RT-) התגובה. RT-התגובה היא שליטה כדי לקבוע את היעילות של הסרת DNA (שולחן 1).
   1. העבר 16 μL של MM לתוך כל צינור התגובה PCR.
   2. הוסף 4 μL של התמצית RNA לתוך כל RT + ו-RT התגובה צינור ומים לתוך צינורות התגובה NTC.
   3. לטעון את הצינורות התגובה לתוך מכונת ה-PCR בזמן אמת ולהגדיר את התנאים PCR כדלקמן: 50 ° c עבור 30 דקות, 95 ° צ' עבור 15 דקות, 40x מחזורים ב 94 ° צ' עבור 45 s, ו-60 ° c עבור 1 דקות עם הרכישה עם fluorophores לספוג בערוצים ירוק וצהוב.
      הערה: הערוץ הירוק הוא fluorophore זיהוי Mtb והצהוב הוא בקרת החילוץ fluorophore.
4. פענוח תוצאות
   הערה: ודא שהתגובות הכפולות של אותה דגימה אינן שונות מסטיית תקן אחת. ערכי Mtb ו-EC Cq גבוהים מ-30 נחשבים לשליליים. ראה פרטים נוספים על הפרשנות בטבלה 2.
   1. כדי לפרש את תגובת הטיפול, המר את ערכי Cq לעומס חיידקי (eCFU/mL) באמצעות העקומה הסטנדרטית. קרא את תגובת הטיפול כשינוי בעומס חיידקי על הטיפול בתקופת המעקב.
      הערה: הנפילה בעומס חיידקי בעקבות הטיפול מרמז על תגובה חיובית (כלומר, נגד שחפת תרופות להרוג את החיידקים TB) בעוד לא שינוי או עלייה בעומס חיידקי מרמז על תגובה שלילית, אשר עשוי להיות התנגדות של חיידקים שחפת לתרופות נגד שחפת או החולה לא כראוי הקפדה על מינון הטיפול שלהם. הנפילה בעומס חיידקי נמדד על ידי TB-MBLA התואם עם העלייה בזמן MGIT התרבות חיוביות (טרומבוציטופניה).

5. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור

1. העברת 2 מ"ל מעבר לתרבויות חום ושליטה לתוך 2 מ ל צינורות מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה עבור 10 דקות ב 20,000 x g.
2. להיפטר supernatant ולהשעות את הגלולה ב 700 μL של מאגר קיבעון התא ו-דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות כדי לתקן את התאים.
3. צנטריפוגה את ההשעיה עבור 30 דקות ב 16,000 x g כדי לקבל גלולה קשה. השמט את הסופרנטאנט והחלף ב-1% סוכרוז בתמיסת מלח מוזרמת פוספט (PBS). אחסן את הפלטות בסוכרוז ב-4 ° c עד שהיא מאחסנת מיקרוסקופ אלקטרוני.
4. בנייה ובנייה
   הערה: הפרוטוקול להלן מותאם מ גריפית'ס et al.²⁸.
   1. הקפאה של הגלולה הסלולרית על ידי הטבעתו ב-2.1 מעלות בשנת הPBS ב-4 ° c. רוחצים את 3x עם מים קרים בקרח.
   2. מגניב את כדורי התא הקריומי בחנקן נוזלי והר אותם cryomicrotomy stub. באמצעות cryomicrotome, לגזור סעיפים באולטרדקים ב 90 ננומטר.
   3. לאחזר את הסעיפים לחתוך באמצעות לולאות תיל טונגסטן של 1:1 תערובת של 2% מתיל תאית ו 2.1 M סוכרוז ב-PBS.
   4. העבר את הסעיפים כדי פיולוטופס מצופה 150 רשת שינוי משושה נחושת TEM תומך (רשתות) ולאחסן ב 4 ° צ' או להמשיך שלב 5.4.5.
   5. בניגוד לרשתות באצטט uranyl ו האוויר יבש בסרט של מתיל אצטט. שטפו את הרשתות במים קרים ולאחריהם שתי טיפות של PBS לאורך 5 דקות ויבשות במשך 15-30 דקות. בדוק את הסעיפים תחת TEM בעקבות הנחיות היצרן.
      הערה: כל שלבי התוויות בוצעו בטמפרטורת הקרח (טמפרטורה נוזלית) למעט שלבי הכביסה, שבוצעו בטמפרטורת הסביבה.

תוצאות

החום מפעיל את כל מ. שחפת בנילי
הצפיפות האופטית (OD) של פקדים (תאים חיים) גדל לאורך זמן, (0.04_od– 0.85_od) ולא שינוי od היה נצפתה בדגימות חום המופעל, מסמל צמיחה ללא צמיחה בהתאמה (איור 1)²⁷. באופן דומה, השליטה ליחה קלינית גדל חיובי ביום 3 ב MGIT בעוד החום דגימות קליניות לא הפעיל לא דגל חיובי עד סוף הדגירה. הצמיחה של Mtb ב MGIT אושרה על ידי מיקרוסקופ הכתם זיגהל-יציבת חומצה ו אנטיגן MPT64²⁹.

רנ א בדגימות מופעלות יציב ב 37 ° c עבור 4 ימים
דגימות חום המופעל היו מודבטים ב 37 ° צ' כדי לקבוע אם RNA מפגיז בעקבות הפעלת החום של תאים. לא נמצא הבדל בין ה-RNA שנקטפו ביום (ד) 0 מיד לאחר הפעלת החום ו-RNA מבודדים ב-D1, 2, 3, ו-4 בתרבויות BCG (איור 2A-C) ו-TB ליחה חיובית (איור 2d).

אקסוגני RNase מגדיל את שיעור הירידה RNA בשברים חום המופעל
כדי לקבוע מדוע ה-RNA לא היה משפיל, RNase אנזים היה הוסיף באופן שולי ב 1,000 U/mL לפני ו/או אחרי הפעלת חום. זה גרם לאובדן RNA שווה ערך לעומס חיידקי 1.5 ± 0.3-, 1.8 ± 0.2-, ו 1.3 ± 0.1 – יומן₁₀ ecfu/mL בשעה 80 ° c, 85 ° c, ו-95 ° c בהתאמה על פני 4 ימים של דגירה. היה הבדל ב-RNA מושפל בדגימות שבהן RNase התווסף לפני ו/או אחרי הפעלת החום (איור 3א-ג).

RNA מספיק שמור עבור TB-MBLA באמצעות rRNA 16S כסמן התייחסות
ההשפעה של הפעלת חום על rrna נמדד בתרבויות bcg ו רוק מ-TB חולים חיוביים. עומס חיידקי נמדד של השליטה התרבות BCG, 5.3 ± 0.2 יומן₁₀ Ecfu/ml, היה 0.2 ± 0.1_{יומן 10 ecfu} /ml גבוה יותר מאשר בשילוב 5.1 ± 0.3 יומן₁₀ ecfu/ml של התרבות הפעילה חום (ANOVA p ≪ 0.0001) ב 80 ° c, 85 ° c, ו-95 ° צ' (איור 4a)²⁷. באופן דומה, עומס חיידקי של שליטה החולה sputum, 7.1 יומן₁₀ Ecfu/ml, היה 0.8 ± 0.1 יומן₁₀ ecfu/ml גבוה יותר מאשר המשולב 6.3 ± 0.41 יומן₁₀Ecfu/ml ב 80 ° c, 85 ° c, ו-95 ° צ' (איור 4b)²⁷. הפחתת עומס חיידקי היה < 1log בשני סוגים של דגימות נבדק.

מבחן ההשוואות המרובות של sidak חשף הבדל משמעותי בין העומס החיידקי ב95 ° צ' לעומת זה של 80 ° צ' ו 85 ° צ' (p = 0.001). שום הבדל לא נמצא בדגימות TB בכל הטמפרטורות, p = 0.8.

שלמות קיר התא אינה נהרסת על ידי חום ברוב התאים הMtb
באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM) חקרנו אם התאים היו מנוחמים על ידי הפעלת חום. חלקים דקים של פאראפורמלדהיד כדורי קבוע של תאים נעשו מוטבע בינונית עשיר אלקטרון לפני הבדיקה על ידי TEM. בדיקת התאים בהגדלה נמוכה יותר וגבוהה יותר חשפה קיר תא שלמים וגלויים גופים השומנים תאיים. תאים הופיעו באופן מורפולוגי אך לא מוארכים. איור 5 ממחיש את המבנה של תאי הפטרת בעלי הגדלה שונים. שני לוחות העליון לחשוף הגופים השומנים תאיים ואת הכבל הבלתי המוני כמו חבל, מאפיין מורפולוגית אופייני של מינים של הפטרת. שני לוחות התחתון הם הגדלה גבוהה יותר הרחבת התצוגה של גופים שומנים וחושפים כמה מבנים מיקרו תאיים.

עומס חיידקי נמדד על ידי TB-MBLA הוא בקורלציה הפיכה לזמן התרבות MGIT כדי חיוביות
עבור מטופלים המגיבים לטיפול, העומס החיידקי נופל ביומן ממוצע 1₁₀ ecfu/mL לשבוע במהלך הטיפול. המגיבים מהר ברור מהר יותר, המרה לשלילי (עומס בקטריאלי אפס) על ידי 2 שבועות של טיפול. הנפילה בעומס חיידקי נמדד על ידי TB-MBLA התכתב לעלייה בזמן התרבות MGIT כדי חיוביות (טרומבוציטופניה). איור 6 מדגים את המתאם ההופכי שנמצאו בין עומס בקטריאלי לבין מט טרומבוציטופניה. ההבדל, עם זאת, הוא כי תוצאות TB-MBLA זמינים 4 h וזמן לתוצאה היא עצמאית של רמת עומס חיידקי. זה לעומת 5 – 25 ימים עבור בדיקות תרבות MGIT מט. זיהום עם חיידקים שאינם שחפת לסכן עוד יותר את התוצאות של בדיקות התרבות.

איור 1: אימות ההפעלה של BCG ב-80 ° צ' (עקומת תבנית נקודה), 85 ° צ' (עקומת תבנית נקודה מקף), ו-95 ° צ' (עקומת תבנית מקף). הפקד (עיקול שחור) היה חי (לא מחומם) התרבות BCG שחוסנו לתוך אותו מדיום צמיחה. הצמיחה בשליטה אושרה על ידי העלייה בOD של התרבות על פני תקופת הדגירה. דמות זו השתנתה מתוך Sabiiti ואח '²⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: היציבות של רנ א כמותית בחום לדוגמה המופעל ב-37 ° c במשך 4 ימים (D0 – D4). (א), (ב) ו-(ג) מראים שתרביות bcg מופעלות ב-80 ° c, 85 ° c ו-95 ° c בהתאמה. (ד) מציג את ליחה של TB ב-80 ° c. הפקד הוא החלק שאינו מטופל (חי) של אותה דוגמית. קווי שגיאה = סטיית תקן. , שלוש חזרות. תשע משכפל בכל ריצה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: השפלה גבוהה יותר RNA לאחר תוספת אקסוגני של האנזים RNase. (א) חום הפעלה (HI) בשעה 80 ° c, (ב) שלום ב 85 ° c, ו (ג) hi 95 ° c. קווי שגיאה = שגיאת תקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: שימור של RNA מספיק עבור TB-MBLA בקטריאלי מדידה עומס באמצעות rRNA 16 כסמן. (א) עומס חיידקיהמשוערבתרבויות bcg מבחנה. (ב) עומס חיידקי מוערך של שחפת חיובי sputum. קווי שגיאה = שגיאה סטנדרטית של הממוצע (n = 18 ו-20 משכפל עבור A ו- B בהתאמה). דמות זו השתנתה מתוך Sabiiti ואח '²⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: מיקרוגרפים אלקטרונים של Mtb חיידקים שלמים לאחר הפעלת ב 95 ° c עבור 20 דקות. ברור הקיר תא שלמים הגופים השומנים הניתנים שנצפו עם TEM. למעלה: תמונות הגדלה נמוכה של קבוצה של תאים החושפים מורפולוגיה בלתי מעטה של חבלים, כמו חבל מדומה וגופי שומנים תאיים. בתחתית: הגדלה גבוהה של לוחות העליון כדי להרחיב את התצוגה של גופים שומנים וחשיפת כמה מבנים מיקרו תאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: התגובה לטיפול בשבוע 12 עקומת של חולה נגד שחפת הטיפול מראה מתאם הופכי של TB-MBLA מנמדד בקטריאלי להעמיס ו-mgit טרומבוזית. העומס חיידקי (עיקול כחול) נופל בעוד טרומבוזית עולה (עיקול אדום) כמו המטופל מגיב לטיפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מיקס מאסטר	התגובה החיובית-RT	התגובה השלילית של RT
	נפח לכל תגובה x לא. התגובות 5	נפח לכל תגובה x לא. התגובות 5
תערובת קוונטect	10.0 מיקרומטר	10.0 מיקרומטר
Mtb16S פריימר ערבוב (F + R)	0.4 מיקרומטר	0.4 מיקרומטר
Mtb16S	0.2 מיקרומטר	0.2 מיקרומטר
שילוב EC פריימר (F + R)	0.4 מיקרומטר	0.4 מיקרומטר
בדיקה	0.2 מיקרומטר	0.2 מיקרומטר
אנזים RT	0.2 מיקרומטר	-------
RNase מים חופשיים	4.6 מיקרומטר	4.8 מיקרומטר
נפח כולל	16 μL	16 μL

טבלה 1: מדריך הכנה לערבוב הורים עבור TB-MBLA qPCR.

סוג	ערוץ MTB	ערוץ EC	פרשנות
דוגמה	חיובי	חיובי	חוקי
דוגמה	חיובי	שלילי	וגדר
דוגמה	שלילי	חיובי	חוקי
דוגמה	שלילי	שלילי	לא חוקי
MTB + בקרה	חיובי	שלילי	חוקי
בקרת חילוץ (EC)	שלילי	חיובי	חוקי
בקרת דנ א	שלילי	שלילי	חוקי
שליטה שלילית (NTC)	שלילי	שלילי	חוקי

שולחן 2: TB-MBLA מדריך פרשנות.

Discussion

מאמר זה מראה כי טיפול בחום 20 דקות ב 80 ° c, 85 ° c, ו 95 ° c מפעיל דגימות שחפת ביעילות, מה שמאפשר TB-MBLA להתבצע במתקן non-CL3 ללא סיכון של זיהום לעובדי מעבדה. הממצאים לאשר תצפיות שנעשו במחקרים קודמים תוך מנוגדים עם כמה על האפקטיביות של הפעלת חום של Mtb^25,30. לדוגמה, דיווחים מסוימים מצביעים על כך שהחימום ב-80 ° c אינו יעיל בדוגמאות לעומס בלסת גבוהה^25,31,32,33. אפקט בצפיפות גבוהה השפעה נמנעה במחקר שלנו על ידי להבטיח כי כל רוק ותרבויות טהור התחממו באמצעי אחסון 1 מ ל 15 שפופרת צנטריפוגה לספק מקום מספיק כדי לחשוף כל חלק של המדגם כדי הרתיחה²⁷.

שימור RNA לאחר הפעלת החום מאפשר שחפת-MBLA להתבצע. זה ממצא לדעה עם שני מחקרים שהפגינו שימור RNA לאחר חום^{12איון פעלה 12,34}. הראנו כי רנ א בדגימות חום המופעל יציב ב 37 ° c עבור 4 ימים, רומז כי מעבדות יכול בדיקות אצווה על ידי שמירה על דגימות מופעלות בטמפרטורת החדר במשך שבוע. על ידי החלת ערכות החילוץ RNA הדורשים קירור או הקפאה, היכולת לשמור על החום דגימות מופעל בטמפרטורת החדר ברור את הצורך הן שרשרת קר, קטגוריה 3 מעבדות לבצע TB-MBLA בהגדרות מוגבלות משאב.

פחות מ-1 עומס בקטריאלי של יומן הרישום אבד באמצעות rRNA 16S כסמן. למרות שהיה הבדל בין מדגם בשידור חי לחום, הכמות שאבדה להפעלת חום קטנה מדי כדי לפגוע בתוצאות הזרם. הגדלת הטמפרטורה לא להגדיל את כמות ה-RNA איבד, רומז כי אובדן נצפתה תלויה בטיפול בחום. טיפול חום בטמפרטורות גבוהות ככל הנראה גורם לפירוק תאים, חשיפת RNA לירידה על ידי RNases. אכן, תוספת אקסוגני של RNase A כדי החום השבר המופעל עלה את שיעור השפלה RNA. רתיחה לא להפחית את הפעילות של RNase, רומז שזה חלבון גמיש מאוד.

חשוב לציין כי השפלה ממוצעת RNA של 1.5 יומן₁₀ ecfu/mL הוא לא אובדן גדול. לשם כך אנו ההשערה כי חימום ליסס חלק קטן של Mtb bacilli, ובכך חשיפת כמות קטנה של RNA כדי RNase. באמצעות TEM הראנו כי מורפולוגיה תא Mtb ויושרה של קירות התא מושפע בקושי על ידי חימום ב 95 ° c. משמעות הדבר היא כי זה עשוי לדרוש גורמים פיזיולוגיים שונים ואספקה מספקת של rnases כגון במחשב המארח לבזות באופן משמעותי RNA^35,36. יתר על כן, להיות ריבוחלק מבנית, 16s rrna היא פוטנציאלית פחות רגישים rnase^37,38. תא Mtb יחיד מכיל ~ 700 ריבוזומים/0.1 מ"מ³ של ציטופלסמה³⁷, רומז כי יש כמויות גבוהות יותר של rrna לכל תא. כך, כמויות קטנות יותר של RNase עשוי להיות השפעה קטנה יותר³⁸. קיומו של מספר גבוה של ריבוזומים נותן יתרון ל-TB-MBLA במונחים של רגישות ויכולת לזהות נטל נמוך שחפת חולים.

היה מתאם חזק בין עומס חיידקי שנמדד על ידי TB-MBLA ו MGIT התרבות של מיגית טרומבוציטופניה. זה מאשר את עומס חיידקי כמו הנהג של התרבות חיוביות במידה מסוימת. עם זאת, היתרון של TB-MBLA הוא שזה ישירות לכמת טען בלסת הנוכחית נוכח המדגם ואינו דורש התפשטות התא Mtb לפני האיתור. זה ניגודים עם התרבות אשר הזמן לחיוביות תלוי ברמה של עומס חיידקי ושיעור של התפשטות התא Mtb. מחקרים עתידיים יעריכו את זרימת העבודה של TB-MBLA, כולל הפעלת חום, במסגרות קליניות שגרתיות. המחקר יהיה גם לחקור דגימות עם מגוון של המון חיידקים כדי להבין את המספר שעשוי להשתנות מחיובי לשלילי (כלומר, אלה עם פחות חיידקים לאחר הפעלת החום).

הפרוטוקול TB-MBLA לקוונפיקציה מולקולרית של עומס חיידקי הוא הראשון מסוגו בתוך בדיקות. השיטה מכמת באופן ישיר את העומס Mtb הלסת מפני המטופל החולה ולא דורש שום תרבות לעשות זאת. זה עושה את זה מהר יותר ומגביר את הפוטנציאל שלה כדי להודיע על החלטה קלינית על התקדמות המטופל. שלב הפעלת החום מפחית את הסיכון של זיהום ומגביר את הישימות של TB-MBLA בהגדרות שאין להם קטגוריה 3 מעבדה. לאחר הפעלת החום של המדגם, ישנם שלושה שלבי הפרוטוקול כדי להשיג TB-MBLA תוצאות: חילוץ RNA, היפוך הטרנסקריפטאז (RT)-qPCR, ו qPCR ניתוח תוצאות.

ככל שהיעילות של בידוד Mtb RNA ממדגם מטופל, גבוהה יותר איכות התוצאות. חשוב לציין כי האיכות של המדגם רוק משפיע על כמות ה-RNA מבודדים. לדוגמה, רוק הרוק נחשב באיכות נמוכה והוא נקשר עם עומס בלסת נמוכה. משמעות הדבר היא כי אימון החולה לצפות באיכות מצפה הרוק חשוב. כדי להעריך את היעילות של תהליך החילוץ, בקרת החילוץ (כלומר, המספר הידוע של תאים שאינם Mtb) הוא זינק לתוך המדגם לפני חילוץ RNA. החזרת בקרת החילוץ מאשרת את היעילות של תהליך הפקת ה-RNA. תהליך בידוד ה-RNA אינו יכול להיות חוקי אלא אם כן בקרת החילוץ אוחזרו. בהתחשב בעובדה כי Mtb הוא אורגניזם גמיש גורם לפירוק מכני חלק מכריע בתהליך. הומוגון של המדגם במהירות גבוהה (600 rpm) בנוכחות חרוזים (כלומר, ליסינג מטריצה) ביעילות לסדר את התאים. טיהור ליפוסט מניב תמצית המכילה גם RNA ו-DNA. הסרת ה-DNA היא הצעד האחרון המכריע של חילוץ RNA. TB-MBLA שואפת למדוד ברולה קיימא על ידי כימות RNA. כך, כישלון להסיר דנ א גנומית פירושו כי התוצאות יהיה אות מן ה-DNA, וזה לא סמן טוב עבור הכדאיות התא⁶.

ה-RT-qPCR הוא דופלקס המפעיל בדיקה כפולה לMtb ושליטה בחילוץ. זה כולל שלושה צעדים: 30 דקות היפוך שעתוק על ידי היפוך הטרנססקריפט ב 50 ° c, 15 דקות דנטורציה ב 95 ° c, ו 40 מחזורי הגברה בשעה 94 ° c ו-60 ° c. רכישת קרינה מהגששים מתרחשת ב-60 ° צ' (כלומר, שלב התארכות הקטע). חשוב לציין כי TB-MBLA כבר אופטימיזציה באמצעות מכונת qPCR מסוים, כך אופרטורים באמצעות פלטפורמות qPCR אחרים צריך למטב את התנאים עבור הציוד שלהם. היעילות של הסרת DNA נשלטת על ידי הפעלת תגובה אחת לכל מדגם בהעדר RT. תוצאה חיובית מתגובה זו מרמזת על הסרה לא מלאה של דנ א. דגימות נטל גבוה כי יש כמויות גבוהות של דנ א עשוי לדרוש כפול כמות האנזים DNase כדי להסיר לחלוטין DNA. למרבה המזל, בדגימות עומס גבוה של הלסת העליונה, הנוכחות של כמויות קטנות של דנ א סביר פחות להשפיע על התוצאה של RNA. רנ א ריבוזומיום, היעד TB-MBLA, באופן טבעי מתרחשת כפול כמות ה-DNA³⁷. ב-PCR, אין בקרת תבנית (NTC), שהיא המים המשמשים לפזר את הריאגנטים PCR, שולטת עבור זיהום צולב עם DNA אקסוגני או RNA. אות חיובי ב-NTC מרמז על זיהום צולב והתוצאה נחשבת לבלתי חוקית. משמעות הדבר היא שכל הפתרונות היוו שימוש במים אלה צריך להיות מושלך וחדשים שנעשו באמצעות בקבוקון טרי של מים. מומלץ לשמור על המים של ה-PCR באמצעות שומרים נפרדים כדי למנוע זיהום של כל המים. שליטה חיובית (Mtb RNA) משמשת לשליטה ביעילות הכוללת של ה-PCR.

ניתוח תוצאות כרוך ההמרה של PCR Cqs לתוך עומס חיידקי (כלומר, המושבה המשוער להרכיב יחידות ל-mL) באמצעות עקומת רגיל. הגדרה ואופטימיזציה של העקומה הסטנדרטית היא חיונית לשלב זה. מומלץ לעשות יעילות בעקומה רגילה של 0.95 – 1. עקומות סטנדרטיות עבור MTb ובקרת החילוץ צריך להיות מוגדר אופטימיזציה לפני חולים או דגימות בדיקה אחרות מופעל במחשב. דגימות סטנדרטיות מסופקות עם ערכת TB-MBLA. דילול של 10 מקפלים של תמצית RNA מומלצת ל-PCR. זה מרמז כי תוצאת עומס חיידקי צריך להיות מוכפל על ידי גורם של 10 כדי להשיג את תוצאת העומס החיידקי הסופי לכל mL. חשוב לציין כי Cqs מעל 30 נחשבים שליליים עבור TB-MBLA. מינימום של שני תוצאות עומס בקטריאלי פוטנציאליים נמדד בנקודות זמן שונות נדרש לעשות היסק על תגובת הטיפול. מומלץ מאוד שאחת משתי התוצאות צריכה להיות בסיסית, לפני תחילת הטיפול. עם זאת, אם החולה יזמה הערכת עומס חיידקי מתרחשת באמצע דרך הטיפול, יש להיות נקודת זמן השנייה עומס חיידקי להעריך את תגובת הטיפול. TB-MBLA יכול להבחין עומס חיידקי בחלל של 3 ימים על הטיפול אבל האידיאל הוא שני מדידות עומס בקטריאלי נלקח 7 ימים בנפרד.

בעוד הפרוטוקול מייצר תוצאות כמותיים אינפורמטיבי לתגובה לטיפול, זה עדיין בעיקר ידני ודורש ידיים משמעותיות בזמן להפקת RNA. ייתכן שהפעם לא תהיה לטכנאים במעבדות עסוקות. סידורים מתבצעת כדי להפוך את תהליכי החילוץ והPCR של RNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heat inactivation:
15 mL Centrifuge tubes	Fisher-Scientific	10136120	50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved
15 mL Wire Tube rack	Fisher-Scientific	11749128	Other brands with similar make can be used
Water bath	Fisher-Scientific	15700619	Other brands with similar make can be used
RNA extraction:
Chloroform	Sigma	372978-1L	Not necessary in other RNA extraction kit brands
Ethanol, absolute 99-100%	Sigma	51976-500ML-F	Larger volume available
Extraction control	SOI group St Andrews	VitalbacteriaEC	Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit
FASTRNA Pro blue Kit	MP Biomedicals	116025050	Supplied with lysing matrix tubes
Molecular grade water (RNase free)	Sigma	W4502-1L	Qiagen, Fisherscientific can also supply same product
Precellys 24 homogeniser	VWR	432-3750	FastPrep MP Biomedicals can be used too
Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus	Fisher-Scientific	15352117	Other brands with similar capacity can be used
Thermomixer	Eppendorf	BLD-455-010C	Works with 1-2 mL tubes
TURBO DNA-free	Fisher-Scientific	AM1907M	Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures.
RT-qPCR:
Primers and Taqman probes	SOI group St Andrews	VitalbacteriaPP	Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX.
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit	Qiagen	204845	PCR mix plus the RT enzyme
RotorGene Q 5plex machine	Qiagen	9001580	Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc. can be used
Strip Tubes and Caps, 0.1 mL	Qiagen	981103	Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed.
Non-heat inactivation Sample preservation materials
1 M Tris-HCl pH 7.5	Sigma	93313	Supplied ready to use
2-Mercaptoethanol	Sigma	63689	Many competent suppliers
Guanidine thiocyanate (GTC)	Promega	V2791	Promega brand recommended for quality
Molecular grade water (RNase free)	Sigma	W4502-1L	Ensures that GTC solution is free of nucleases
General materials (used but not specific to TB-MBLA)
500 mL plastic containers		734-5087	Nalgene brand recommeded
Biological waste discard jars			Many competent suppliers
Chemical waste discard jars			Many competent suppliers
Disposable gloves, chemical resistant			Many competent suppliers
Freezer (-20 °C)			Many competent suppliers
Freezer (-80 °C)			Many competent suppliers
Fridge (0-8 °C)			Many competent suppliers
Fume hood			For safe handling of toxic reagents
Laboratory scales			For accurate measurement of reagents
Measuring cylinders, plastic			To ensure accurate measurement of reagents
PCR reaction tubes			Should be suitable to the PCR instrument used
Pipettes and matching sterile filtered pipette tips,			DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended
Qiagility loading plates	Qiagen		5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates
QIAgility Pipetting Robot	Qiagen		Important for high throughput pipetting
Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes			Chemical-resistant and autoclavable recommended
RNase Away (Removes RNases enzymes from working space)	Fisher Scientific	10666421	Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme
Safety goggles, chemical resistant	Fisher Scientific		Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents.
Sterile Pasteur pipettes, 1.5-3 mL			Many competent suppliers
Sterile RNAse-free microtubes			1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended
TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse			Ensure it is freshly prepared or prepared within a week
Vortex			Genie 2 brand recommended
Transmission electron microscopy
Glutaldehyde (8%)	Sigma	G7526-10ML	Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
HEPES (pH 7.4, 100 mM)	Sigma	H4034-25G	Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
Leica FCS ultracryo	Leica		Cryomicrotome for tissue sectioning
Methyl cellulose	Agar Scientific	AGG6425	Cold mounting resin
Paraformaldehyde (4% in PBS)	Sigma	P6148-500G	Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
Sucrose	Sigma	84097-250G	Preservation and mounting medium
Uranyl acetate	Agar Scientific	AGR1260A	Universal Electron microscopy stain