Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את תהליך העבודה צעד אחר צעד עבור אימונוofluoroocoooooooiood של IBA1 ו TMEM119, בנוסף ניתוח של צפיפות microglial, הפצה, מורפולוגיה, כמו גם חדירת תאים מיאלואידית היקפית ברקמת המוח העכבר.

Abstract

זהו פרוטוקול עבור הדמיה כפולה של מיקרוגלייה והסתננות מקרופאגים ברקמת המוח של העכבר. TMEM119 (אשר מדבקות מיקרוגלייה באופן סלקטיבי), כאשר בשילוב עם IBA1 (אשר מספק הדמיה יוצאת דופן של המבנה שלהם), מאפשר חקירה של שינויים צפיפות, הפצה, מורפולוגיה. לכמת את הפרמטרים הללו חשוב במתן תובנות לתוך התפקידים שהופעלו על ידי microglia, מקרופאגים המתמחים של המוח. בתנאים פיסיולוגיים נורמליים, מיקרוגלייה מופצים באופן קבוע בדפוס כמו פסיפס ולהציג סומה קטנה עם תהליכים מסויד. עם זאת, כתגובה לגורמים סביבתיים (קרי, טראומה, זיהום, מחלה או פציעה), צפיפות microglial, הפצה ומורפולוגיה משתנות בנימוסים שונים, בהתאם לעלבון. בנוסף, השיטה המתוארת כפולה כפולות מאפשר ויזואליזציה של הסתננות מקרופאגים במוח מבוסס על הביטוי שלהם IBA1 וללא התאמה לשפות אחרות עם TMEM119. גישה זו מאפשרת הפליה בין מיקרוגלייה והסתננות מקרופאגים, אשר נדרש כדי לספק תובנות תפקודית למעורבות שלהם ברורים הומאוסטזיס המוח על פני ההקשרים השונים של בריאות ומחלות. פרוטוקול זה משלב את הממצאים העדכניים ביותר נוירואימונולוגיה הנוגעת לזיהוי של סמנים סלקטיבית. הוא משמש גם כלי שימושי עבור נוירואימונוולוגים מנוסים וחוקרים המבקשים לשלב נוירואימונולוגיה לפרויקטים.

Introduction

אם אקוטי או כרוני, דלקת נוירו מושפע היטב על ידי microglia, מקרופאגים התושב של המוח. המחשה של מיקרוגלייה באמצעות כתמים חיסוני הוא בעל ערך למחקר של דלקת מוחי עם שימוש של מיקרוסקופ אור, טכניקה נגישה מאוד. בתנאים הומסטטיים, מיקרוגלייה מופצים בדרך כלל בתבנית ללא חפיפה, כמו פסיפס. הם מציגים מנות קטנות שמרחיבות את התהליכים הללו1, אשר לעיתים מגעיםאחד לשני. תהליכים מיקרוסקופיים מיקרוגליאל באופן דינמי לסקר את המוח בתוך מכימומה, אינטראקציה עם נוירונים, תאים גליה אחרים, וכלי דם במהלך מצבים פיזיולוגיים נורמליים3. Microglia מצוידים בארסנל של קולטנים המאפשרים להם לבצע משימות אימונולוגיים להגיב לשינויים בתחומי המוח, למוות בתאים, או לנזק לרקמות. בנוסף, הם להפעיל פונקציות פיזיולוגיות מפתח, בעיקר היווצרות סינפטית, תחזוקה, וביטול4,5.

בין הסמנים הזמינים המשמשים לחקר microglia, כריכת סידן כריכה מתאם מולקולה 1 (IBA1) הוא אחד הנפוצים ביותר. IBA1 הוא חלבון מחייב סידן המספק הדמיה יוצאת דופן של מורפולוגיה microglial, כולל תהליכים בסדר המרוחק, כפי שאושרו על ידי אלקטרון מיקרוסקופ6. כלי זה היה אינסטרומנטלי באפיון טרנספורמציה microglial, שנקרא בעבר "הפעלה", במערך עצום של מחלת בעלי חיים מודלים7,8,9. בנוכחות של דלקת ניווניות, התגובה microglial כוללת: microglial המוגדר כגידול בצפיפות הסלולר, שינויים בהפצה כי לפעמים כתוצאה באשכולות, הגדלה של גוף התא, כמו גם עיבוי ו קיצור של תהליכים המשויכים לצורות מסוימות של מאמתיבה10,11,12,13.

כתמים חיסוני מוגבל על ידי הזמינות של נוגדנים בבימויו של סמנים ספציפיים. חשוב מכך, IBA1 מתבטא על ידי מיקרוגלייה אבל גם על ידי מקרופאגים היקפיים שיסתננו את המוח14. בעוד התבוננות של תאים IBA1-חיוביים בתוך המוח הפך סמן של מיקרוגלייה בתחום זה מחקר, הסתננות מקרופאג היקפית דווחה בתנאים שונים, אפילו שולית במוח בריא15,16 ,17,18. כתוצאה מכך, השימוש IBA1 לבדו אינו מאפשר ויזואליזציה סלקטיבית של microglia. בנוסף, מקרופאגים לאמץ תכונות מולקולריות ומורפולוגיות של מיקרוגליה תושב ברגע שהם חדרו למוח, ובכך בידול19. זה מייצג אתגר בעת חקירת הפונקציה של שני מיקרוגלייה ו הסתננות מקרופאגים.

בעוד מיקרוגלייה ו מקרופאגים היקפיים יש מקורות ברורים (למשל, מן שק החלמון העובריים ואת מח העצם, בהתאמה20,21), יש מספר גדל והולך של ממצאים המציינים כי שתי אוכלוסיות תאים להפעיל תפקידים שונים במוח19. לפיכך, חיוני להשתמש בשיטות ההפלות בין שתי האוכלוסיות הללו ללא מניפולציות פולשניות (כלומר, מקרי מח עצם או parabiosis) שיכולים לווסת את הצפיפות, ההפצה, המבנה והתפקוד שלהם. TMEM119 התפתחה כסמן ספציפי microglia על פני בריאות ומחלות בתנאים22. בשילוב עם IBA1, סמן זה הופך להיות שימושי להבדיל תאים אלה מן הסתננות מקרופאגים, שהם TMEM119-שליליים ו IBA1-חיובית. למרות שהוא מוסדר באופן מנטלי, TMEM119 מתבטא כבר בימים אחרי הלידה 3 (P3) ו 6 (P6), הגדלת בהתמדה עד להגיע לרמות מבוגרים בין P10 ו P1422. IBA1 מתבטאת מוקדם כמו יום עובריים 10.5 (E 10.5)23. פרוטוקול תיוג כפול המוצע שימושי ובכך לחקור את שתי האוכלוסיות הללו במהלך החיים לאחר הלידה.

פרוטוקול זה מספק הליך חיסוני צעד אחר צעד המאפשר אפליה בין מיקרוגלייה ומקרופאגים היקפיים. זה גם מסביר כיצד לבצע ניתוח כמותי של צפיפות microglial, הפצה, מורפולוגיה, כמו גם ניתוח של הסתננות מקרופאג היקפית. בעוד החקירה של מיקרוגלייה ו מקרופאגים היקפיים הוא שימושי משלו, פרוטוקול זה עוד מאפשר לוקליזציה של מייבשי נוירודלקתיות; לפיכך, היא משמשת גם כפלטפורמה לזיהוי אזורים מסוימים כדי לחקור, עם שימוש בטכניקות משלימות (עדיין, זמן רב יותר וצורכת משאבים).

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים בוצעו בהסכמה עם ההנחיות לוועדות האתיקה של בעלי החיים המוסדיים, בהתאם למועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ולוועדת הבריאות של אוניברסיטת לאוול.

1. מכתים חיסוני

  1. בחר שלושה סעיפים המוח העכבר המכיל את אזור הריבית (ROI) (כלומר, ההיפוקמפוס) בעזרתו של אטלס המוח. מניחים את הסעיפים בצלחת פלסטיק multi-היטב ולכסות אותם עם 350 μL של מלוחים מאגור פוספט (PBS) (טבלה 1).
    הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, המוח צריך להיות מוכן עם 4% פאראמפורמלדהיד ולחתוך לעובי של 50 יקרומטר עם רטט. לצלחת 24 מרבי, כל טוב יכול להכיל עד שישה חלקים. הנפח המומלץ של הפתרון עבור כל טוב הוא 350 μL (עד שלושה חלקים) ו 500 μL עבור בארות המכילות שישה חלקים. עבור מספר גבוה יותר של סעיפים, מומלץ להשתמש בצלחת 12 מרובת היטב. ודא שנפח הפתרון שנבחר עבור כל באר מכסה לחלוטין את הרקמה ומאפשר למקטעים לצוף. אמצעי האחסון המומלצים חלים עבור כל פתרון הנמצא בשימוש בשאר הפרוטוקול.
  2. לשטוף את הדגימות על ידי כיסוי אותם עם 350 μL של PBS ולתת להם לנוח על ידי הצבת צלחת מרובת היטב על גבי שייקר רב-תכליתי בטמפרטורת החדר (RT). הסר את ה-PBS לאחר 5 דקות והחלף אותו 5x עם PBS טרי.
    הערה: כדי להסיר את הפתרונות, מומלץ לעשות פיפטה להעברה. בעת שפיכת כל פתרון, הקפד למקם את קצה הפיפטה נגד הקיר היטב כדי להגן על שלמות הרקמה. כמו כן, הקפד להשתמש בצנרת חדשה עבור כל פתרון חדש.
  3. להסיר PBS ולהוסיף 350 μL של 10 מ"מ נתרן ציטראט מאגר עם pH = 6.0 (טבלה 1).
  4. חותם את הצלחת multi-היטב עם סרט פרפין ולתת לו לצוף על אמבט מים מחומם קודם לכן עבור 40 דקות ב 70 ° c.
  5. תן את הצלחת רב היטב להתקרר במשך כ 15 דקות.
  6. הסר את המאגר הנתרן ציטראט ושטוף את הסעיפים ב-PBS כפי שנעשה בשלב 1.2.
  7. הסרת PBS ולהוסיף 350 μL של טרי שנעשו 0.1% NaBH4 (טבלה 1) ולתת המיקון עבור 30 דקות ב-RT.
  8. הסר את הפתרון של 0.1% NaBH4 ושטוף את הסעיפים ב-PBS כפי שנעשה בשלב 1.2.
  9. הסר את ה-PBS והוסף מאגר חסימה (טבלה 1) עבור 1 h ב-RT על גבי שייקר רב תכליתי.
    הערה: הקפד להכין אמצעי אחסון כפולים של מאגר חסימות, מכיוון שאותו פתרון ישמש בשלב הבא.
  10. הסר את המאגר החוסם והחלף על-ידי חסימת מאגר המכיל את התערובת של נוגדנים ראשיים (1:150 העכבר IBA1 + 1:300 TMEM119). לאטום את הצלחת עם סרט פרפין ולתת אותו לתוך לילה ב 4 ° c.
  11. למחרת, דגימות חמות ב-RT במשך כ 15 דקות.
  12. שטפו את הסעיפים 5x עבור 5 דקות כל אחד ב-PBS עם טריטון (הטבלה הראשונה).
  13. להסיר PBST ולהוסיף חסימה מאגר המכיל את התערובת של נוגדנים משניים (1:300 חמור נגד עכבר אלקסה 488 עבור IBA1; 1:300 עז אנטי ארנבת אלקסה 568 עבור TMEM119) עבור 1.5 h ב RT. החל מנקודה זו ואילך, הגן על הדגימות מהאור.
  14. הסרת מאגר חוסם ולשטוף את סעיפים 5x כפי שנעשה בשלב 1.2, למעט הפעם עם PBST.
  15. להסיר את PBST ולהוסיף 4 ′, 6-diamidino-2-פניילינדול (DAPI) [1:20000] עבור 5 דקות ב RT.
  16. הסר DAPI ושטוף את הסעיפים 3x עבור 5 דקות כל אחד במאגר פוספט (PB).
  17. הבהר את המקטעים בשקופית מיקרוסקופ. הרשו להם להתייבש. כשהם מוגנים מפני אור
  18. כאשר מיובש, להוסיף כמה טיפות של בינונית הרכבה ולכסות עם שמיכות, הימנעות היווצרות בועה.
    הערה: אחסן את השקופיות תוך הגנה מפני אור, בתוך תיבת שקופית היסטולוגית, ב-4 ° c. את הדגימות ניתן לשמור במשך מספר חודשים.

2. הדמיה לניתוח צפיפות והפצה

  1. בעזרתו של מיקרוסקופ בתחום האפידל, להשתמש בהגדלה נמוכה ובערוץ DAPI כדי לאתר את ROI (כלומר, אזור CA1 של ההיפוקמפוס).
  2. לרכוש תמונות ב 20x, באמצעות צמצם מספרי (NA) של 0.5, עם DAPI, 488, ו 568 ערוצים ומסננים, ברזולוציה של 0.3 μm/פיקסל. לכידת תמונת פסיפס המכסה את התשואה. לחילופין, צלם תמונות בודדות שיהיו תפורות לתמונה גדולה יותר.
    הערה: תמונת פסיפס היא דמות סופר המהווה תמונות קטנות יותר. תמונות פסיפס משמשות בדרך כלל כדי להתגבר על השטח המוגבל של שדה התצוגה של הגדלה גבוהה. תוכנות מסוימות כוללות פונקציית פסיפס; עם זאת, תמונות יכול גם להיות תפור באופן ידני יחד עם תוכנות אחרות לעריכת תמונות על ידי תפירת התמונות הבודדות לתוך אחד. זכור להוסיף את מידע קנה המידה לקובץ. עבור סוג זה של ניתוח, מומלץ להיות לפחות 300 התאים microglial התמונה לכל ROI/בעלי חיים (המקבילה כ 10-15 תמונות על ההיפוקמפוס, למשל), עם מינימום של חמש בעלי חיים לכל מצב ניסיוני. איור 1A-C מראה את התמונות של מיקרוגליה קולאבאני.
  3. שמור את התמונה כקובץ TIFF.

3. הדמיה לניתוח מורפולוגיה

  1. השתמש בערוץ DAPI כדי לאתר את ה-ROI בהגדלה נמוכה.
  2. באמצעות מטרה 40x (כלומר, NA 1.4 שמן), לאתר IBA1 +/tממ119 + תא בתוך ההחזר. בזמן הדמיה חיה, לנוע בציר Z. ברגע שהאות של מיקרוגלייה שנבחרו באקראי נעלם, להגדיר את רמת z זה כתחילתו של מחסנית z. הזז לאורך ציר z בכיוון ההפוך עד שהאות של מיקרוגלייה ייעלם ותגדיר נקודה זו כסופה של מחסנית Z.
    הערה: איור 2A-C מראה תמונות של IBA1 +/tmem119 + microglia.
  3. צור מחסנית Z בכל שלושת הערוצים (dapi, 488, 568) באמצעות מרווח הזמן ב0.33 יקרומטר ובגודל פיקסל של 0.15 יקרומטר/פיקסל. הוסף את מידע קנה המידה לקובץ.
    הערה: מרווח Z המומלץ תלוי בעוצמת הפתרון של המטרה (למשל, עבור מטרה 40x כגון הנפט NA 1.4, זה 0.33 μm). עבור ניתוח מורפולוגיה, מומלץ להיות לפחות 20 תאים לכל חיה עם מינימום של חמש בעלי חיים לכל מצב ניסיוני.
  4. שמור את הקובץ כקובץ TIFF.

4. צפיפות וניתוח הפצה

  1. פתח את פיג'י/ImageJ עם תוסף המרחק הקרוב ביותר (NND) המותקן. פתח את התמונה 20x.
    הערה: השתמש במנוע חיפוש עם מילת המפתח "חישוב מרחקים שכנים הקרובים ביותר עם ImageJ" כדי למצוא את הוראות ההתקנה. מחבר התוסף הוא Yuxiong מאו.
  2. כדי להגדיר את קנה המידה באופן ידני בהתאם לקנה מידה המוטבע על התמונה, בחר את הכלי קו ישר (איור 3E), מקם את הסמן על קצה הסולם, ובזמן הקשה על מקש shift, צייר קו קרוב ככל האפשר לקנה המידה בתמונה (איור 3e ), בחר באפשרות ' נתח ' | קבע את קנה המידהולאחר מכן הזן את המידע הנכון (איור 3j).
    הערה: ניתן לפעמים לכלול את קנה המידה במטא-נתונים של הקובץ ולקבוע אותו באופן אוטומטי.
  3. בחר תמונה | צבע | הפוך למורכב כדי ליצור תמונה ללא הפרדות צבע של כל הערוצים.
    הערה: במהלך רכישת תמונה, פיג'י/ImageJ ייצרו באופן אוטומטי שילוב בתבנית RGB.
  4. בשורת התפריטים, בחר באפשרות ' נתח ' | קביעת מדידות. . בדוק אזור, סנטאיד והיקף בכרטיסיה נתב מחדש אל, לחץ על ובחר את הקובץ הפתוח (איור 3k).
  5. עבור לתמונה | צבע | כלי ערוץ כדי לפתוח את כלי הערוץ.
    הערה: תפריט זה יאפשר להפוך צבע מסוים ללא זמין. ערוץ DAPI יכול להועיל לזיהוי ROI ולאישור תאים. ניתן לנטרל אותו. כדי להקל על הספירה
  6. ציירו היקף מחוספס של ההחזר עם הכלי בחירה ביד חופשית (איור 3D).
  7. הפעל את כלי מברשת הבחירה באמצעות לחיצה כפולה על הכלי הסגלגל בסרגל הכלים וודא שהתיבה הפעל מברשת בחירה מסומנת (איור 3g). כלי זה ישמש לתיחום הROI ביתר דיוק. בחרו גודל מברשת מתאים בין 200-400.
  8. באמצעות מברשת הבחירה, להתאים את המערכת כדי להתאים ביותר את ההחזר. לחץ על T במקלדת כדי להוסיף למנהל הROI (איור 3l).
  9. בחר באפשרות ' נתח ' | מדוד או לחץ על מקש M , וחלון התוצאות יצוץ. העתק והדבק את התוצאות בגליון נתונים ולאחר מכן שמור את המידע הנוגע לאזור (כלומר, האזור של ההחזר; איור 3R).
  10. לאחר העתקת האזור של ה-ROI, מחק את המידע מחלון התוצאות על-ידי לחיצה עליו והקשה על מקש Backspace .
  11. עבור אל חלון מנהל הROI (איור 3L), לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על מעקב roi, שנה את השם כדי להתאים לשם התמונה ולאחר מכן שמור.
  12. לחצו פעמיים על כלי המברשת בסרגל הכלים. בחרו בצבע השחור ובגודל המברשת של 10. ודאו שהאפשרות ' צבע של שכבת-על ' אינה מסומנת (איור 3h).
  13. בערוץ TMEM119, המקום בזהירות נקודה שחורה על מרכז הסומה עבור כל TMEM119 + microglia. מניחים נקודה לבנה על מרכז התאים שאינם חיוביים עבור TMEM119 (כדי לסמן הסתננות מקרופאגים). חזור על אותו ההליך עבור כל התאים המוכלים ב-ROI.
    הערה: חשוב שכל הנקודות (שחור-לבן) ממוקמות באותו ערוץ. ניתן לוודא את זהות הערוץ (אדום, כחול או ירוק) על-ידי התבוננות בצבע של תוויות חלון התמונה.
  14. בחר תמונה | צבע | פצל ערוץ. חלון עבור כל ערוץ יופיע. לאחר מכן, זהה את הערוץ המכיל את ביאורי הנקודה וסגור את שני החלונות האחרים.
  15. נתב מחדש את תמונת הערוץ המפוצל החדשה. עבור לניתוח | קביעת מדידות. בכרטיסיה נתב מחדש אל, לחץ על ובחר את תמונת הערוץ המפוצל (איור 3k).
  16. בחר תמונה | סוג | 8 סיביות. עבור לתמונה | כוונן ובחר את הסף (איור 3o). כדי לכוונן את הסף, החלק את הלחצן של הסרגל השני, כל הדרך עד שמאל (ערך הסף = 0) בשני הסרגלים.
    הערה: זה ישאיר רק את הנקודות השחורות על התמונה, הופעת לבן.
  17. בחר את ה-ROI בחלון מנהל הROI. בחר באפשרות ' נתח ' | לנתח חלקיקים (איור 3n). בגודל אינץ ' (באינצ ' 2): כתוב 1-20. השאר את יחידת הפיקסלים לא מסומנת, בדוק את התצוגה, סכם והוסף למנהל ולחץעל אישור. חלון הסיכום יופיע ויעניק את מספר הנקודות (איור 3P). העתק והדבק את המידע לגליון הנתונים.
  18. בחר תוספים | Nnd. החלון NND יצוץ (איור 3Q). העתק/הדבק את כל המידע לגליון הנתונים. כל מספר מייצג את המרחק כל מיקרוגליה יש מיקרוגליה השכנה הקרובה ביותר.
  19. חזור אל חלון הסף והחלק את הסרגל הראשון כל הדרך ימינה (הערך הסף = 255 בשני הסורגים), אשר ישאיר את כל הנקודות הלבנות גלויות, הופעת לבן (איור 3M).
  20. בחר באפשרות ' נתח ' | ניתוח חלקיקים. חלון הסיכום המספק את מספר הנקודות יצוץ (איור 3P). העתק והדבק את המידע לגליון הנתונים.
  21. עבור אל מנהל הROI בחר את כל הנקודות, לחץ לחיצה ימנית ושמור עם שם התמונה. זה יאפשר שמירה של כל הנקודות בקובץ zip (איור 3L). בחר קובץ | שמור בשםושמור את הקובץ בשם המאפשר זיהוי של התמונה שנותחה.
  22. להשיג את הצפיפות של מיקרוגלייה (עבור כל תמונה) על ידי חלוקת מספר IBA1 +/tmem119 + תאים כפולים חיוביים על ידי האזור של ההחזר.
    הערה: הערכים עבור כל תמונה ניתנים לממוצע עבור כל חיה. לאחר מכן ניתן להציג את הנתונים כממוצע ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע (SEM) של כל החיות.
  23. קבע את ה-NND על-ידי קבלת ממוצע לכל תמונה של ערכי NND של כל TMEM119 + תאים.
    הערה: לאחר מכן ניתן להציג את הנתונים כממוצע ± SEM של כל החיות.
  24. חשב את אינדקס הריווח באמצעות הנוסחה: דחיסות NND2 x.
    הערה: לאחר מכן ניתן להציג את הנתונים כממוצע ± SEM של כל החיות. היחידות למדידה זו יהיו יחידות שרירותיות.
  25. ככמת אשכולות microglial על ידי זיהוי תאים בעלי NND מתחת 12 μm.
    הערה: כאן, 12 יקרומטר נבחר, כפי שהוא המרחק המשוער בין שני תאים מעמת ישירות מפנים מיקרוגליאל לגעת זה בזה עם arborizations. אם יש יותר משלושה מיקרוגליה שעומדים בתנאי זה, חזרו לתמונה ובדוק אם תאים אלה הם חלק מאשכול אחד או מספר אשכולות.
  26. לאחר אישור מספר האשכולות, כתוב את מספר האשכולות בגליון הנתונים.
    הערה: מספר האשכולות יכול להיות מחולק על ידי אזור ROI כדי לקבל את צפיפות התאים/mm2 עבור כל חיה. לאחר מכן ניתן להציג את הנתונים כממוצע ± SEM של כל החיות.
  27. כדי לקבוע את האחוז של הסתננות של תא מיאלואיד היקפי, חשב את התאים% of IBA1 +/T119-במספר הכולל של תאים מיאלואידים (TMEM119 +/TMEM119-+ + TMEM119-/TMEM119-+) עבור כל חיה.
    הערה: לאחר מכן ניתן להציג את הנתונים כממוצע ± SEM של כל החיות.

5. ניתוח מורפולוגיה

  1. פתח את פיג'י/ImageJ.
  2. פתחו את תמונת ה-40x באמצעות Image J או פיג'י. בחר חלון מוקפץ יופיע וישאל אם יש לפתוח את התמונות בערימה. לחץ על אישור. לאחר מכן, בחר תמונה | ערימות | פרוייקט z כדי לפתוח את חלון התחזית z. כלול את כל הפרוסות, מהפרוסה הראשונה עד האחרונה. ודא שהעוצמה המרבית נבחרה תחת סוג הקרנהולחץ על OK
  3. לחץ על החלון החדש עם הפרוייקט Z. בחר תמונה | צבעים | פצל ערוצים. לנהל את העקבות על התמונות של ערוץ IBA1.
    הערה: ניתן לשמור על הערוצים האחרים (TMEM119 ו-DAPI) פתוחים ולהתייעץ בהתאם לצורך במהלך ניתוח מורפולוגיה של microglial.
  4. בשורת התפריטים, בחר באפשרות ' נתח ' | קביעת מדידות. . תבדקו את האיזור, סנטאיד והשטח בכרטיסיה נתב מחדש ל, בחר את הקובץ הנפתח (איור 3k).
  5. הגדר את הסולם כפי שמתואר בשלבים 4.2.
  6. כדי למדוד את גודל הסומה בערוץ IBA1, לצייר היקף מחוספס של סומה עם כלי בחירה ביד חופשית (איור 3D).
  7. הפעל את כלי מברשת הבחירה על-ידי לחיצה כפולה על הכלי הסגלגל בסרגל הכלים, ואחריו בדיקה הפיכת תיבת מברשת הבחירה לזמינה (איור 3g). בחרו גודל מברשת בחירה בין 10 ל-20 (איור 3B).
  8. באמצעות מברשת הבחירה, להתאים את המעקב כדי להתאים ביותר את הסומה. התקרבות תאפשר לדיוק במהלך שלב זה (איור 2I).
  9. הקש על מקש T כדי להוסיף את מעקב הסומה למנהל הROI (איור 3l).
  10. בחר באפשרות ' נתח ' | מדוד או לחץ על מקש M . חלון תוצאות יצוץ. העתק והדבק את התוצאות בגליון נתונים (איור 3R).
  11. כדי לשמור את המידע על אזור סומה, ללכת לחלון מנהל ROI, לחיצה ימנית על ROI, לשנות את השם כדי להתאים את שם התמונה, לציין כי המעקב הוא עבור סומה, ולאחר מכן לשמור את הקובץ.
  12. כדי למדוד אזור arborization בערוץ IBA1, לחץ על הקצה תהליך microglial עם הכלי בחירת מצולע, אשר יתחיל את צורת מצולע (איור 3C).
  13. בעקבות הטיפים של התהליכים microglial, ללכת סביב מיקרוגלייה ידי לחיצה על הטיפים של כל תהליך הגפיים כדי ליצור מצולע המייצג הטוב ביותר את האזור מכוסה על ידי המיקרו מיקרוגליזציה (איור 2d-H).
    הערה: ודא שהמצולע מחבר את כל הגפיים של תהליך ה-microglial. הקווים היוצרים את המצולע. לא צריכים להצטלב בעת לחיצה סביב תיאור תהליך microglial, להיזהר להימנע מגזירת כל חלק של התהליך. לפעמים זה שימושי כדי להוסיף נקודות נוספות כדי לעקוף תהליך. מספר הנקודות היוצרות את המצולע אינו מקושר ישירות למספר התהליכים האלה ולכן אינו רלוונטי למחקר.
  14. כדי לסגור את המצולע, לחץ על נקודת ההתחלה של המצולע.
  15. הקש על מקש T כדי להוסיף את המעקב אל מנהל הROI (איור 3l). בחר באפשרות ' נתח ' | מדוד או לחץ על מקש M . חלון תוצאות יצוץ. העתק והדבק את התוצאות בגליון נתונים (איור 3R).
  16. כדי לשמור את המידע לגבי אזור arborization, עבור אל החלון מנהל ROI, לחץ לחיצה ימנית על ההחזר, שנה את השם כדי להתאים את שם התמונה, ציין עבור arborization, ולאחר מכן שמור את הקובץ.
  17. לקבוע את אזור סומה על ידי ממוצע כל האזורים הסומה עבור כל חיה.
    הערה: ניתן להציג את הנתונים כממוצע ± SEM של כל החיות.
  18. לקבוע אזור arborization על ידי ממוצע כל אזורי arborization עבור כל חיה.
    הערה: ניתן להציג את הנתונים כממוצע ± SEM של כל החיות.
  19. לחשב את האינדקס מורפולוגיה באמצעות הנוסחה באזור איזור/arborization עבור כל תא microglial ממוצע לכל חיה.
    הערה: ניתן להציג את הנתונים כממוצע ± SEM של כל החיות.

תוצאות

איור 1 מציג את שיתוף התיוג של מיקרוגלייה באמצעות IBA1 ו TMEM119 בחלק הקורילי של ההיפוקמפוס הדו היפוב1 ב-20x על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית. מכתים מוצלח חושף את גופי התא microglial ואת התהליכים העדינים שלהם (איור 1א-ג). זה הצביעת מאפשר נחישות של צ...

Discussion

פרוטוקול זה ניתן לחלק בשני חלקים קריטיים: איכות ההכתמים והניתוח. אם הצביעת אינו אופטימלי, הוא ייכשל לייצג תאים microglial כראוי, ובכך להשפיע על צפיפות, הפצה, ומורפולוגיה מדידות. בנוסף, הפרופורציה של תאים מיאלואיד היקפית היקפיים עלול להיות לא מזלזל. זוהי גירסה ממוטבת של פרוטוקול ההכתמים, אך ישנם ...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

אנו אסירי תודה לנטלי ורנוקס על הדרכתו ועזרתה בניסויים. בנוסף, אנו רוצים להודות לד"ר עמנואל פלאמל וסרג ' ריבסט לשימוש הקרינה הפלואורסצנטית והקונקמיקרוסקופים שלהם, בהתאמה. עבודה זו ממומנת בחלקו על ידי מלגות מהמועצה המקסיקנית למדע וטכנולוגיה (conacyt; ל-F. G. I), fondation famille-צ'קט ומרכז תימטאקה דה רצ'רצ'ה en מדעי המוח (ctrn; כדי K.P.), כפות דה מחקר du קוויבק-סאנטא (כדי מ ב), ו שתיל הודו-קנדי המכון (כדי K.B.), כמו גם מענק דיסקברי ממדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה של קנדה (NSERC) כדי M.E.T. M.E.T. מחזיקה כסא מחקר בקנדה (Tier II) של נוירוטיקה החיסונית בריאות וטיפול.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouseInvitrogen/ThermofisherA21202
Alexa Fluor 568 goat anti-rabbitInvitrogen/ThermofisherA11011
Biolite 24 Well multidishThermo Fisher930186
Bovine serum albuminEMD Millipore Corporation2930
Citric acidSigma-AldrichC0759-500G
DAPI Nuceleic acid stainInvitrogen/ThermofisherMP 01306
Fine BrushArt store
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
Gelatin from coldwater fish skinSigma-AldrichG7765
Microscope coverglassFisher Scientific1254418
Microslides positively chargedVWR48311-703
Monoclonal mouse Anti-IBA1MilliporeMABN92
Na2H2PO4·H2OBioShop Canada Inc.SPM306, SPM400
Na2HPO4BioShop Canada Inc.SPD307, SPD600
NaBH4Sigma-Aldrich480886
NaClFisher ScientificS642500
Normal donkey serum (NDS)Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.017-000-121
Normal goat serum (NGS)Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.005-000-121
Parafilm-MParafilmPM-999
Rabbit monoclonal Anti-TMEM119Abcamab209064
Reciprocal Shaking bath model 25Precision Scientific-
Transfer pipette
Tris buffer hydrochlorideBioShop Canada Inc.TRS002/TRS004
Triton-X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML

References

  1. Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
  2. Milior, G., et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress. Brain, Behavior, and Immunity. 55, 114-125 (2016).
  3. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., Khoury, J. E. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359 (2018).
  5. Tay, T. L., Savage, J. C., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. 595 (6), 1929-1945 (2017).
  6. Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial Interactions with Synapses Are Modulated by Visual Experience. PLoS Biology. 8 (11), (2010).
  7. Jakovljevic, M., et al. Induction of NTPDase1/CD39 by Reactive Microglia and Macrophages Is Associated With the Functional State During EAE. Frontiers in Neuroscience. 13, (2019).
  8. Taylor, A. M. W., et al. Microglia Disrupt Mesolimbic Reward Circuitry in Chronic Pain. The Journal of Neuroscience. 35 (22), 8442-8450 (2015).
  9. Poliani, P. L., et al. TREM2 sustains microglial expansion during aging and response to demyelination. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2161-2170 (2015).
  10. Lu, S. M., et al. HIV-1 Tat-Induced Microgliosis and Synaptic Damage via Interactions between Peripheral and Central Myeloid Cells. PLoS ONE. 6 (9), e23915 (2011).
  11. Rodríguez, J. J., et al. Increased densities of resting and activated microglia in the dentate gyrus follow senile plaque formation in the CA1 subfield of the hippocampus in the triple transgenic model of Alzheimer's disease. Neuroscience Letters. 552, 129-134 (2013).
  12. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130 (11), 2816-2829 (2007).
  13. Walker, F. R., et al. Dynamic structural remodelling of microglia in health and disease: a review of the models, the signals and the mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity. 37, 1-14 (2014).
  14. Ohsawa, K., Imai, Y., Kanazawa, H., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Involvement of Iba1 in membrane ruffling and phagocytosis of macrophages/microglia. Journal of Cell Science. 113 (17), 3073-3084 (2000).
  15. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. Journal of Experimental Medicine. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  16. Wohleb, E. S., et al. Peripheral innate immune challenge exaggerated microglia activation, increased the number of inflammatory CNS macrophages, and prolonged social withdrawal in socially defeated mice. Psychoneuroendocrinology. 37 (9), 1491-1505 (2012).
  17. Shemer, A., et al. Engrafted parenchymal brain macrophages differ from microglia in transcriptome, chromatin landscape and response to challenge. Nature Communications. 9, (2018).
  18. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages and dendritic cells. Science (New York, N.Y). 327 (5966), 656-661 (2010).
  19. Minogue, A. M. Role of infiltrating monocytes/macrophages in acute and chronic neuroinflammation: Effects on cognition, learning and affective behaviour. Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry. 79, 15-18 (2017).
  20. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science (New York, N.Y). 330 (6005), 841-845 (2010).
  21. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  22. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. Journal of Immunology. 188 (1), 29-36 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152microgliaimmunofluorescence IBA1TMEM119

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved