Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen schrittweisen Workflow für die immunfluoreszierende Costainierung von IBA1 und TMEM119, zusätzlich zur Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie der peripheren myeloischen Zellinfiltration im Gehirngewebe der Maus.

Zusammenfassung

Dies ist ein Protokoll zur dualen Visualisierung von Mikroglia und infiltrierenden Makrophagen im Gehirngewebe der Maus. TMEM119 (das Mikroglia selektiv kennzeichnet), in Kombination mit IBA1 (das eine außergewöhnliche Visualisierung ihrer Morphologie bietet) ermöglicht die Untersuchung von Veränderungen in Dichte, Verteilung und Morphologie. Die Quantifizierung dieser Parameter ist wichtig, um Einblicke in die Rolle zu geben, die von Mikroglia, den ansässigen Makrophagen des Gehirns, ausgeübt wird. Unter normalen physiologischen Bedingungen werden Mikroglia regelmäßig in einem mosaikartigen Muster verteilt und stellen ein kleines Soma mit verzweigten Prozessen dar. Als Reaktion auf Umweltfaktoren (z. B. Trauma, Infektion, Krankheit oder Verletzung) werden mikrogliaale Dichte, Verteilung und Morphologie je nach Beleidigung auf unterschiedliche Weise verändert. Darüber hinaus ermöglicht die beschriebene Doppelfärbungsmethode die Visualisierung von infiltrierenden Makrophagen im Gehirn basierend auf ihrer Expression von IBA1 und ohne Kolokalisierung mit TMEM119. Dieser Ansatz ermöglicht somit die Diskriminierung zwischen Mikroglia und infiltrierenden Makrophagen, die erforderlich ist, um funktionelle Einblicke in ihre ausgeprägte Beteiligung an der Homöostase des Gehirns in verschiedenen Kontexten von Gesundheit und Krankheit zu geben. Dieses Protokoll integriert die neuesten Erkenntnisse in der Neuroimmunologie, die sich auf die Identifizierung selektiver Marker beziehen. Es dient auch als nützliches Werkzeug für erfahrene Neuroimmunologen und Forscher, die Neuroimmunologie in Projekte integrieren möchten.

Einleitung

Ob akut oder chronisch, Neuroinflammation wird stark durch Mikroglia beeinflusst, die ansässigen Makrophagen des Gehirns. Die Visualisierung von Mikroglia durch Immunfärbung ist wertvoll für die Untersuchung von Neuroinflammation mit dem Einsatz der Lichtmikroskopie, einer hochzugänglichen Technik. Bei homeostatischen Bedingungen werden Mikroglia in der Regel in einem nicht überlappenden, mosaikartigen Muster verteilt. Sie zeigen kleine Somas, die verzweigte Prozesse erweitern¹, die manchmal miteinander in Kontakt treten². Mikrogliale verzweigte Prozesse vermessen dynamisch das Blutparenchym und interagieren mit Neuronen, anderen Gliazellen und Blutgefäßen während normaler physiologischer Bedingungen³. Microglia sind mit einem Arsenal von Rezeptoren ausgestattet, die es ihnen ermöglichen, immunologische Aufgaben auszuführen und auf Veränderungen im Gehirnmilieu, auf Zelltod oder Gewebeschäden zu reagieren. Darüber hinaus üben sie wichtige physiologische Funktionen aus, insbesondere in der synaptischen Bildung, Wartung und Elimination^4,5.

Unter den verfügbaren Markern, die zur Untersuchung von Mikroglia verwendet werden, ist das ionisierte Calciumbindungsadaptermolekül 1 (IBA1) eines der am häufigsten verwendeten. IBA1 ist ein Kalzium-bindendes Protein, das eine außergewöhnliche Visualisierung der mikroglialen Morphologie, einschließlich feiner distaler Prozesse, bietet, wie durch Elektronenmikroskopie⁶bestätigt wird. Dieses Tool war maßgeblich an der Charakterisierung der mikrogliaalen Transformation, früher als "Aktivierung" bezeichnet, in einer Vielzahl von Tierseuchenmodellen^7,8,9. In Gegenwart von Neuroinflammation, die mikrogliaale Reaktion umfasst: Mikrogliase, die als eine Erhöhung der Zelldichte definiert ist, Veränderungen in der Verteilung, die manchmal zu Clustering führen, Vergrößerung des Zellkörpers, sowie Verdickung und Verkürzung der Prozesse, die mit mehr Ameboidformen verbunden sind^10,11,12,13.

Die Immunfärbung wird durch die Verfügbarkeit von Antikörpern begrenzt, die gegen bestimmte Marker gerichtet sind. Wichtig ist, dass IBA1 durch Mikroglia, aber auch durch periphere Makrophagen ausgedrückt wird, die das Gehirn infiltrieren¹⁴. Während die Beobachtung von IBA1-positiven Zellen im Gehirn zu einem Marker von Mikroglia in diesem Forschungsgebiet geworden ist, wurde die periphere Makrophageninfiltration unter verschiedenen Bedingungen berichtet, sogar geringfügig im gesunden Gehirn^{15,16 ,17,18}. Folglich erlaubt die Verwendung von IBA1 allein keine selektive Visualisierung von Mikroglia. Darüber hinaus übernehmen Makrophagen molekulare und morphologische Merkmale der ansässigen Mikroglia, sobald sie das Gehirn infiltriert haben, wodurch die Differenzierung behindert wird¹⁹. Dies stellt eine Herausforderung bei der Untersuchung der Funktion sowohl der Mikroglia als auch der Infiltrierung von Makrophagen dar.

Während Mikroglia und periphere Makrophagen unterschiedliche Ursprünge haben (z. B. aus dem embryonalen Eigelbsack bzw.^20,21), gibt es immer mehr Befunde, die darauf hindeuten, dass die beiden Zellpopulationen verschiedene Rollen im Gehirn¹⁹. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, Methoden zu verwenden, die zwischen diesen beiden Populationen ohne invasive Manipulationen (d. h. Knochenmarkchimeren oder Parabiose) unterscheiden, die ihre Dichte, Verteilung, Morphologie und Funktion modulieren können. TMEM119 hat sich als mikrogliaspezifischer Marker für Gesundheit und Krankheit sprägsiert²². In Kombination mit IBA1 wird dieser Marker nützlich, um diese Zellen von infiltrierenden Makrophagen zu unterscheiden, die TMEM119-negativ und IBA1-positiv sind. Während es entwicklungsreguliert ist, wird TMEM119 bereits in den postnatalen Tagen 3 (P3) und 6 (P6) ausgedrückt und steigt stetig an, bis das Erwachsenenniveau zwischen P10 und P14²²erreicht wird. IBA1 wird bereits am embryonalen Tag 10.5 (E10.5)²³ausgedrückt. Das vorgeschlagene Doppelkennzeichnungsprotokoll ist daher nützlich, um diese beiden Populationen während des gesamten postnatalen Lebens zu untersuchen.

Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Immunstaining-Verfahren, das eine Diskriminierung zwischen Mikroglia und peripheren Makrophagen ermöglicht. Außerdem wird erläutert, wie eine quantitative Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie die Analyse der peripheren Makrophageninfiltration durchgeführt werden kann. Während die Untersuchung von Mikroglia und peripheren Makrophagen allein nützlich ist, ermöglicht dieses Protokoll weiterhin die Lokalisierung neuroinflammatorischer Foyers; Daher dient es auch als Plattform, um bestimmte zu untersuchende Regionen zu identifizieren, wobei ergänzende (noch zeit- und ressourcenverbrauchende) Techniken verwendet werden.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institutionellen Tierethikkommissionen in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care und dem Animal Care Committee der Université Laval durchgeführt.

1. Immunostainierung

1. Wählen Sie mit Hilfe eines Hirnatlas drei Maushirnabschnitte aus, die den Interessenbereich (ROI) (d. h. den Hippocampus) enthalten. Legen Sie die Abschnitte in eine Kunststoff-Multi-Well-Platte und bedecken Sie sie mit 350 l Phosphat-gepufferter Kochsaline (PBS) (Tabelle 1).
   HINWEIS: Für optimale Ergebnisse sollten die Gehirne mit 4% Paraformaldehyd durchsetzt und mit einem Vibram auf eine Dicke von 50 m geschnitten werden. Für eine 24 Multi-Well-Platte kann jeder Brunnen bis zu sechs Abschnitte aufnehmen. Das empfohlene Lösungsvolumen für jeden Bohrstand beträgt 350 l (für bis zu drei Abschnitte) und 500 l für Brunnen mit sechs Abschnitten. Für eine höhere Anzahl von Abschnitten wird empfohlen, eine 12 Multi-Well-Platte zu verwenden. Stellen Sie sicher, dass das ausgewählte Lösungsvolumen für jeden Brunnen das Gewebe vollständig abdeckt und die Abschnitte schweben lassen. Die empfohlenen Volumes gelten für jede Lösung, die im restlichen Protokoll verwendet wird.
2. Waschen Sie die Proben, indem Sie sie mit 350 l PBS bedecken und ruhen lassen, indem Sie die Mehrzweckplatte auf einen Mehrzweck-Shaker bei Raumtemperatur (RT) legen. Entfernen Sie die PBS nach 5 min und ersetzen Sie sie 5x durch frische PBS.
   HINWEIS: Um die Lösungen zu entfernen, wird eine Transferpipette empfohlen. Wenn Sie in jede Lösung gießen, stellen Sie sicher, dass die Spitze der Pipette an der Brunnenwand zu platzieren, um die Gewebeintegrität zu schützen. Achten Sie auch darauf, eine neue Pipette für jede neue Lösung zu verwenden.
3. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 350 l von 10 mM Natriumcitratpuffer mit pH = 6,0 hinzu (Tabelle 1).
4. Versiegeln Sie die Multi-Well-Platte mit Paraffinfolie und lassen Sie sie 40 min bei 70 °C auf einem zuvor vorgeheizten Wasserbad schweben.
5. Lassen Sie die Multi-Well-Platte ca. 15 min abkühlen.
6. Entfernen Sie den Natriumcitratpuffer und waschen Sie die Abschnitte in PBS wie in Schritt 1.2.
7. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 350 l frisch hergestellte 0,1% NaBH₄ (Tabelle 1) und lassen Sie inkubieren für 30 min bei RT.
8. Entfernen Sie die Lösung von 0,1% NaBH₄ und waschen Sie die Abschnitte in PBS wie in Schritt 1.2.
9. Entfernen Sie PBS und fügen Sie den Sperrpuffer (Tabelle 1) für 1 h bei RT auf einem Mehrzweck-Shaker hinzu.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie doppelte Volumes des Blockierpuffers vorbereiten, da dieselbe Lösung im nächsten Schritt verwendet wird.
10. Entfernen Sie den Blockierpuffer, und ersetzen Sie den Puffer, der die Mischung der primären Antikörper enthält (1:150 Maus IBA1 + 1:300 TMEM119). Versiegeln Sie die Platte mit Paraffinfolie und lassen Sie sie über Nacht bei 4 °C brüten.
11. Am nächsten Tag warme Proben bei RT für ca. 15 min.
12. Waschen Sie die Abschnitte 5x für je 5 min in PBS mit Triton (PBST) (Tabelle 1).
13. Entfernen Sie PBST und fügen Sie den Sperrpuffer hinzu, der das Gemisch von sekundären Antikörpern enthält (1:300 Esel-Anti-Maus Alexa 488 für IBA1; 1:300 Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa 568 für TMEM119) für 1,5 h bei RT. Ab diesem Zeitpunkt schützen Sie die Proben vor Licht.
14. Entfernen Sie den Sperrpuffer und waschen Sie die Abschnitte 5x wie in Schritt 1.2, außer diesmal mit PBST.
15. Entfernen Sie die PBST und fügen Sie 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) [1:20000] für 5 min bei RT.
16. Entfernen Sie DAPI und waschen Sie die Abschnitte 3x für jeweils 5 min im Phosphatpuffer (PB).
17. Montieren Sie die Abschnitte auf einem Mikroskopschlitten. Lassen Sie sie trocknen, während sie vor Licht geschützt sind.
18. Wenn getrocknet, fügen Sie einige Tropfen der Montage Fluoreszenz Medium und Abdeckung mit einem Deckelschlupf, Vermeidung von Blasenbildung.
    HINWEIS: Bewahren Sie die Dias unter Lichtschutz in einer histologischen Schiebebox bei 4 °C auf. Die Proben können für mehrere Monate aufbewahrt werden.

2. Imaging für Dichte- und Verteilungsanalyse

1. Verwenden Sie mit Hilfe eines Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskops eine geringe Vergrößerung und den DAPI-Kanal, um den ROI (d. h. die CA1-Region des Hippocampus) zu lokalisieren.
2. Erfassen Sie Bilder mit 20x, mit einer numerischen Blende (NA) von 0,5, mit den Kanälen dAPI, 488 und 568 Kanälen und Filtern, mit einer Auflösung von 0,3 m/Pixel. Erfassen Sie ein Mosaikbild, das den ROI abdeckt. Alternativ können Sie einzelne Bilder aufnehmen, die in ein größeres Bild genäht werden.
   HINWEIS: Ein Mosaikbild ist ein Superbild, das aus kleineren Bildern besteht. Mosaikbilder werden in der Regel verwendet, um den begrenzten Bereich des Sichtfeldes hoher Vergrößerungen zu überwinden. Einige Software enthält eine Mosaik-Funktion; Dennoch können Bilder auch manuell zusammen mit anderen Bildbearbeitungssoftware genäht werden, indem die einzelnen Bilder in eins genäht werden. Denken Sie daran, die Skalierungsinformationen zur Datei hinzuzufügen. Für diese Art der Analyse wird empfohlen, mindestens 300 mikrogliaale Zellen pro ROI/Tier abgebildet zu haben (das entspricht z. B. etwa 10 bis 15 Bildern für den Hippocampus), wobei mindestens fünf Tiere pro Versuchszustand sind. Abbildung 1A-C zeigt die Bilder von kolabelierter Mikroglia.
3. Speichern Sie das Bild als TIFF-Datei.

3. Imaging für die Morphologieanalyse

1. Verwenden Sie ein konfokales oder strukturiertes Beleuchtungsmikroskop, um den ROI bei geringer Vergrößerung zu lokalisieren.
2. Lokalisieren Sie mit einem 40-fachen Objektiv (d. h. NA 1.4-Öl) eine IBA1+/TMEM119+-Zelle im ROI. Bewegen Sie sich während der Live-Bildgebung in der Z-Achse. Sobald das Signal der zufällig ausgewählten Mikroglia verschwindet, legen Sie diese Z-Ebene als Beginn des Z-Stacks fest. Bewegen Sie sich entlang der Z-Achse in die entgegengesetzte Richtung, bis das Signal der Mikroglia verschwindet, und setzen Sie diesen Punkt als Ende des Z-Stacks.
   HINWEIS: Abbildung 2A-C zeigt Bilder von IBA1+/TMEM119+ Microglia.
3. Erstellen Sie einen Z-Stack in allen drei Kanälen (DAPI, 488, 568) mit einem Z-Intervall von 0,33 m und einer Pixelgröße von 0,15 m/Pixel. Fügen Sie die Skalierungsinformationen zur Datei hinzu.
   HINWEIS: Das empfohlene Z-Intervall hängt von der Auflösungskraft des Objektivs ab (z. B. bei einem 40-fachen Objektiv wie NA 1,4 Öl beträgt es 0,33 m). Für die Morphologieanalyse wird empfohlen, mindestens 20 Zellen pro Tier mit mindestens fünf Tieren pro Versuchszustand zu haben.
4. Speichern Sie die Datei als TIFF-Datei.

4. Dichte- und Verteilungsanalyse

1. Öffnen Sie FIJI/ImageJ mit dem nächstgelegenen Nachbar-Entfernungs-Plugin (NND). Öffnen Sie das 20-fache Bild.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine Suchmaschine mit dem Schlüsselwort "Nearest Neighbor Distances Calculation with ImageJ", um die Installationsanweisungen zu finden. Das Plugin Autor ist Yuxiong Mao.
2. Um den Maßstab manuell basierend auf einem auf dem Bild aufgedruckten Maßstab festzulegen, wählen Sie das gerade Linienwerkzeug (Abbildung 3E), platzieren Sie den Cursor am Rand der Skala, und zeichnen Sie beim Drücken der Shift-Taste eine Linie so nah wie möglich an den Maßstab auf dem Bild(Abbildung 3I)/c1 >), wählen Sie Analysieren | Skalieren festlegenund dann die richtigen Informationen eingeben (Abbildung 3J).
   HINWEIS: Der Maßstab kann manchmal in den Metadaten der Datei enthalten und automatisch festgelegt werden.
3. Bild auswählen | Farbe | Erstellen Sie zusammengesetzt, um ein zusammengesetztes Bild aller Kanäle zu erstellen.
   HINWEIS: Während der Bildaufnahme erstellt FIJI/ImageJ automatisch ein Komposit im RGB-Format.
4. Wählen Sie in der Menüleiste Analysieren | Messen einstellen. Prüfbereich, Centroidund Perimeter. Klicken Sie auf der Registerkarte Umleiten zu, und wählen Sie die geöffnete Datei aus (Abbildung 3K).
5. Gehen Sie zu Bild | Farbe | Kanalwerkzeug, um das Kanalwerkzeug zu öffnen.
   HINWEIS: In diesem Menü kann eine bestimmte Farbe deaktiviert werden. Der DAPI-Kanal kann nützlich sein, um den ROI zu identifizieren und Zellen zu bestätigen. Es kann deaktiviert werden, um das Zählen zu erleichtern.
6. Zeichnen Sie mit dem Freihandauswahlwerkzeug(Abbildung 3D) einen groben Umfang des ROI.
7. Aktivieren Sie das Auswahlpinselwerkzeug, indem Sie auf das ovale Werkzeug auf der Werkzeugleiste doppelklicken, und stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen Auswahlpinsel aktivieren aktiviert ist (Abbildung 3G). Dieses Tool wird verwendet, um den ROI genauer abzuarbeiten. Wählen Sie eine geeignete Pinselgröße zwischen 200 und 400 aus.
8. Passen Sie mit dem Auswahlpinsel den Umfang an den ROI an. Drücken Sie T auf der Tastatur, um sie dem ROI-Manager hinzuzufügen (Abbildung 3L).
9. Analysieren auswählen | Messen oder drücken Sie die M-Taste, und ein Ergebnisfenster wird angezeigt. Kopieren und Einfügen der Ergebnisse in ein Datenblatt, und speichern Sie dann die Informationen über den Bereich (d. h. den Bereich des ROI; Abbildung 3R).
10. Löschen Sie nach dem Kopieren des ROI-Bereichs die Informationen aus dem Ergebnisfenster, indem Sie darauf klicken und die Backspace-Taste drücken.
11. Wechseln Sie zum FENSTER ROI-Manager (Abbildung 3L), klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die ROI-Ablaufverfolgung, ändern Sie den Namen so, dass er mit dem Namen des Bildes übereinstimmt, und speichern Sie ihn.
12. Doppelklicken Sie auf das Pinselwerkzeug in der Werkzeugleiste. Wählen Sie die schwarze Farbe und eine Pinselgröße von 10 aus. Stellen Sie sicher, dass die Option Überlagerung stutziert deaktiviert ist (Abbildung 3H).
13. Legen Sie im TMEM119-Kanal vorsichtig einen schwarzen Punkt auf die Mitte des Soma für jede TMEM119+ Mikroglia. Platzieren Sie einen weißen Punkt in der Mitte der Zellen, die für TMEM119 nicht positiv sind (um infiltrierende Makrophagen zu markieren). Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für alle Zellen, die im ROI enthalten sind.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass sich alle Punkte (schwarz und weiß) im selben Kanal befinden. Die Identität des Kanals kann überprüft werden (rot, blau oder grün), indem die Farbe der Bildfensterbeschriftungen betrachtet wird.
14. Bild auswählen | Farbe | Split-Kanal. Für jeden Kanal wird ein Fenster angezeigt. Identifizieren Sie dann den Kanal mit den Punktanmerkungen, und schließen Sie die beiden anderen Fenster.
15. Leiten Sie das neue Split-Channel-Image um. Gehen Sie zu Analysieren | Messen einstellen. Klicken Sie auf der Registerkarte Umleiten zu, und wählen Sie das Bild mit geteiltem Kanal aus (Abbildung 3K).
16. Bild auswählen | Typ | 8-Bit. Gehen Sie zu Bild | Anpassen und Wählen Sie Schwellenwert (Abbildung 3O). Um den Schwellenwert anzupassen, schieben Sie die Taste des zweiten Balkens in beiden Balken ganz nach links (Schwellenwert = 0).
    HINWEIS: Dadurch werden nur die schwarzen Punkte auf dem Bild angezeigt, die weiß erscheinen.
17. Wählen Sie den ROI im FENSTER ROI-Manager aus. Analysieren auswählen | Analysieren von Partikeln (Abbildung 3N). Auf Größe (Zoll2): Schreiben Sie 1-20. Halten Sie die Pixeleinheit deaktiviert, aktivieren Sie Anzeige, fassen Sie den Manager zusammen und fügen Sie sie hinzu,und drücken Sie Ok. Das Zusammenfassungsfenster wird angezeigt und gibt die Anzahl der Punkte an (Abbildung 3P). Kopieren Sie die Informationen, und fügen Sie sie in das Datenblatt ein.
18. Plugins auswählen | NND. Das NND-Fenster wird angezeigt (Abbildung 3Q). Kopieren/Einfügen aller Informationen in das Datenblatt. Jede Zahl stellt den Abstand jeder Mikroglia zur nächsten benachbarten Mikroglia dar.
19. Gehen Sie zurück zum Schwellenfenster und schieben Sie den ersten Balken ganz nach rechts (Schwellenwert = 255 in beiden Balken), wodurch alle weißen Punkte sichtbar sind und weiß angezeigt werden (Abbildung 3M).
20. Analysieren auswählen | Analysieren von Partikeln. Das Zusammenfassungsfenster, das die Anzahl der Punkte bereitstellt, wird angezeigt (Abbildung 3P). Kopieren Sie die Informationen, und fügen Sie sie in das Datenblatt ein.
21. Gehen Sie zum ROI-Manager, wählen Sie alle Punkte aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste und speichern Sie sie mit dem Namen des Bildes. Dies ermöglicht das Speichern aller Punkte in einer ZIP-Datei (Abbildung 3L). Datei auswählen | Speichern Sie als, und speichern Sie die Datei mit einem Namen, der die Identifizierung des analysierten Bildes ermöglicht.
22. Erhalten Sie die Dichte von Mikroglia (für jedes Bild), indem Sie die Anzahl der DOPPELpositiven ZELLEN IBA1+/TMEM119+ durch den Bereich des ROI dividieren.
    HINWEIS: Die Werte für jedes Bild können für jedes Tier gemittelt werden. Die Daten können dann als mittlerer Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aller Tiere dargestellt werden.
23. Bestimmen Sie den NND, indem Sie einen Durchschnitt pro Bild der NND-Werte aller TMEM119+-Zellen erhalten.
    ANMERKUNG: Die Daten können dann als Mittelwert für alle Tiere dargestellt werden.
24. Berechnen Sie den Abstandsindex mit der Formel: NND² x Dichte.
    ANMERKUNG: Die Daten können dann als Mittelwert für alle Tiere dargestellt werden. Die Einheiten für diese Messung sind beliebige Einheiten.
25. Quantifizieren Sie mikrogliaale Cluster, indem Sie Zellen identifizieren, die einen NND unter 12 m haben.
    ANMERKUNG: Hier wird 12 m ausgewählt, da es sich um den ungefähren Abstand zwischen zwei direkt nebeneinander liegenden Mikrogliazellen handelt, die sich gegenseitig mit Lauben berühren. Wenn es mehr als drei Mikroglia gibt, die diese Bedingung erfüllen, kehren Sie zum Bild zurück, und überprüfen Sie, ob diese Zellen Teil eines oder mehrerer Cluster sind.
26. Nachdem Sie die Anzahl der Cluster bestätigt haben, schreiben Sie die Anzahl der Cluster in das Datenblatt.
    HINWEIS: Die Anzahl der Cluster kann durch den ROI-Bereich geteilt werden, um die Dichte der Zellen/mm² für jedes Tier zu erhalten. Die Daten können dann als Mittelwert aller Tiere dargestellt werden.
27. Um den Prozentsatz der peripheren myeloischen Zellinfiltration zu bestimmen, berechnen Sie den Prozentsatz der IBA1+/TMEM119-Zellen über die Gesamtzahl der myeloischen Zellen (TMEM119+/IBA1+ + TMEM119-/IBA1+) für jedes Tier.
    ANMERKUNG: Die Daten können dann als Mittelwert für alle Tiere dargestellt werden.

5. Morphologie-Analyse

1. Öffnen Sie FIJI/ImageJ.
2. Öffnen Sie das 40-fache Bild mit Image J oder FIJI. Wählen Sie Ein Popup-Fenster wird angezeigt, in dem Sie gefragt werden, ob die Bilder in einem Stapel geöffnet werden sollen. Klicken Sie auf OK. Wählen Sie als Nächstes Bild | Stapel | Z-Projekt, um das Z-Projektionsfenster zu öffnen. Schließen Sie alle Slices ein, vom ersten bis zum letzten Slice. Stellen Sie sicher, dass die maximale Intensität unter Projektionstypausgewählt ist, und klicken Sie auf OK
3. Klicken Sie auf das neue Fenster mit dem Z-Projekt. Bild auswählen | Farben | Geteilte Kanäle. Führen Sie die Spuren auf den Bildern des IBA1-Kanals.
   HINWEIS: Die anderen Kanäle (TMEM119 und DAPI) können während der mikrogliaalen Morphologieanalyse offen gehalten und bei Bedarf konsultiert werden.
4. Wählen Sie in der Menüleiste Analysieren | Messen einstellen. Überprüfen Sie den Bereich, Centroidund Perimeter. Wählen Sie auf der Registerkarte Umleiten zudie geöffnete Datei aus (Abbildung 3K).
5. Legen Sie die Skala wie in Den Schritten 4.2 beschrieben fest.
6. Um die Soma-Größe im IBA1-Kanal zu messen, zeichnen Sie mit dem Freihandauswahlwerkzeug(Abbildung 3D) einen groben Umfang des Soma.
7. Aktivieren Sie das Auswahlpinselwerkzeug, indem Sie auf das ovale Werkzeug in der Werkzeugleiste doppelklicken, gefolgt von aktivieren Sie das Auswahlpinselfeld aktivieren (Abbildung 3G). Wählen Sie eine Auswahlpinselgröße zwischen 10 und 20 (Abbildung 3B).
8. Passen Sie mit dem Auswahlpinsel die Spur so an, dass sie am besten zum Soma passt. Durch das Zoomen wird die Genauigkeit in diesem Schritt ermöglicht (Abbildung 2I).
9. Drücken Sie die T-Taste, um die Soma-Ablaufverfolgung zum ROI-Manager hinzuzufügen (Abbildung 3L).
10. Analysieren auswählen | Messen oder drücken Sie die M-Taste. Ein Ergebnisfenster wird angezeigt. Kopieren und Einfügen der Ergebnisse in ein Datenblatt (Abbildung 3R).
11. Um die Informationen zum Soma-Bereich zu speichern, gehen Sie zum ROI-Manager-Fenster, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den ROI, ändern Sie den Namen, um den Namen des Bildes zu entsprechen, geben Sie an, dass die Ablaufverfolgung für soma ist, und speichern Sie dann die Datei.
12. Um die Arborisierungsfläche im IBA1-Kanal zu messen, klicken Sie mit dem Polygonauswahlwerkzeug auf eine mikrogliaale Prozessextremität, mit der die Polygonform gestartet wird (Abbildung 3C).
13. Folgen Sie den Spitzen der mikrogliaalen Prozesse, gehen Sie um die Mikroglia, indem Sie auf die Spitzen jeder Prozessextremität klicken, um ein Polygon zu bilden, das am besten die Fläche darstellt, die von den mikrogliaalen Arborisationen abgedeckt wird (Abbildung 2D- H).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Polygon alle mikrogliaalen Prozessextremitäten verbindet. Die Linien, die das Polygon bilden, sollten sich niemals schneiden. Achten Sie beim Klicken auf eine mikrogliaale Prozessspitze darauf, dass Sie keinen Teil des Prozesses abschneiden. Manchmal ist es sinnvoll, zusätzliche Punkte hinzuzufügen, um einen Prozess zu umgehen. Die Anzahl der Punkte, die das Polygon bilden, ist nicht direkt mit der Anzahl der distalen Prozesse verknüpft und daher für die Studie nicht relevant.
14. Um das Polygon zu schließen, klicken Sie auf den Startpunkt des Polygons.
15. Drücken Sie die T-Taste, um die Ablaufverfolgung zum ROI-Manager hinzuzufügen (Abbildung 3L). Analysieren auswählen | Messen oder drücken Sie die M-Taste. Ein Ergebnisfenster wird angezeigt. Kopieren und Einfügen der Ergebnisse in ein Datenblatt (Abbildung 3R).
16. Um die Informationen zum Arborisierungsbereich zu speichern, gehen Sie zum FENSTER ROI-Manager, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den ROI, ändern Sie den Namen, um den Namen des Bildes zu entsprechen, geben Sie für die Arborisierung an, und speichern Sie dann die Datei.
17. Bestimmen Sie den Soma-Bereich, indem Sie alle Soma-Bereiche für jedes Tier durchschnittlich bestimmen.
    ANMERKUNG: Die Daten können als Mittelwert aller Tiere dargestellt werden.
18. Bestimmen Sie die Arborisierungsfläche, indem Sie alle Arborisierungsbereiche für jedes Tier durchschnittlich bestimmen.
    ANMERKUNG: Die Daten können als Mittelwert aller Tiere dargestellt werden.
19. Berechnen Sie den Morphologieindex, indem Sie den Formel-Soma-Bereich/Arborisationsbereich für jede Mikroglialzelle und den Durchschnitt pro Tier verwenden.
    ANMERKUNG: Die Daten können als Mittelwert aller Tiere dargestellt werden.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Co-Kennzeichnung von Mikroglia mit IBA1 und TMEM119 in einem koronalen Abschnitt des dorsalen Hippocampus, der mit 20x durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet ist. Eine erfolgreiche Färbung zeigt mikrogliaale Zellkörper und ihre feinen Prozesse (Abbildung 1A-C). Diese Färbung ermöglicht die Bestimmung der mikrogliaalen Dichte und Verteilung und Identifizierung von mikrogliaalen Clustern ...

Diskussion

Dieses Protokoll kann in zwei kritische Teile unterteilt werden: Qualität der Färbung und Analyse. Wenn die Färbung nicht optimal ist, wird sie mikrogliaale Zellen nicht angemessen darstellen, was die Dichte-, Verteilungs- und Morphologiemessungen beeinflusst. Darüber hinaus kann der Anteil der infiltrationsperipheren myeloischen Zellen unterschätzt werden. Dies ist eine optimierte Version des Färbeprotokolls, aber es gibt mehrere Faktoren, die zu suboptimalen Bildern führen können. Auch wenn die Durchblutung des...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse	Invitrogen/Thermofisher	A21202
Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit	Invitrogen/Thermofisher	A11011
Biolite 24 Well multidish	Thermo Fisher	930186
Bovine serum albumin	EMD Millipore Corporation	2930
Citric acid	Sigma-Aldrich	C0759-500G
DAPI Nuceleic acid stain	Invitrogen/Thermofisher	MP 01306
Fine Brush	Art store
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Gelatin from coldwater fish skin	Sigma-Aldrich	G7765
Microscope coverglass	Fisher Scientific	1254418
Microslides positively charged	VWR	48311-703
Monoclonal mouse Anti-IBA1	Millipore	MABN92
Na2H2PO4·H2O	BioShop Canada Inc.	SPM306, SPM400
Na2HPO4	BioShop Canada Inc.	SPD307, SPD600
NaBH4	Sigma-Aldrich	480886
NaCl	Fisher Scientific	S642500
Normal donkey serum (NDS)	Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.	017-000-121
Normal goat serum (NGS)	Jackson ImmunoResearch laboratories Inc.	005-000-121
Parafilm-M	Parafilm	PM-999
Rabbit monoclonal Anti-TMEM119	Abcam	ab209064
Reciprocal Shaking bath model 25	Precision Scientific	-
Transfer pipette
Tris buffer hydrochloride	BioShop Canada Inc.	TRS002/TRS004
Triton-X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-100ML