קוונפיקציה של הדבקה תא הגידול בצומת לימפה קריוסעיפים

Summary

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה וזולה המאפשרת כימות של תאים סרטניים דבק לצומת לימפה (LN) קריודורים. In-חסיד תאים סרטניים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ אור ואישר על ידי שיטה מבוססת-פלואורסצנטית, מתן אינדקס הדבקה החושף את הזיקה של תא הגידול מחייב לתוך הכריכה.

Abstract

גידול בלוטות לימפה ניקוז (LNs) הם לא רק מסננים של פסולת המיוצר הגידול. הם אחד האתרים האזוריים הנפוצים ביותר של מגורים זמניים של תאים סרטניים המופץ בחולים עם סוגים שונים של סרטן. הזיהוי של תאים אלה המתגוררים בתוך הגידול הוא בסמנים חשובים הקשורים פרוגנוזה גרועה החלטות הטיפול הפסיקה. מודלים העכבר האחרונות הצביעו על תאים סרטניים בתוך המתגוררים יכול להיות מקור משמעותי של תאים ממאירים עבור גרורות מרוחקות. היכולת לכמת את הadהיסוס של תאי הגידול לתוך מכימומה הוא מד קריטי במחקר ניסיוני המתמקד בזיהוי של גנים או איתות מסלולים הרלוונטיים הפצת הלימפה/גרורתית. מכיוון LNs הם מבנים תלת-ממדיים מורכבים עם מגוון רחב של הופעות ויצירות בסעיפים רקמות בהתאם למישור של סעיף, מטריצות שלהם קשה לשכפל ניסויים בתוך מבחנה באופן מלא בשליטה. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה וזולה המאפשרת את הקוונפיקציה של תאים סרטניים דבק כדי בהקפאה חלקים. שימוש במקטעים סידוריים של אותו LN, אנו להתאים את השיטה הקלאסית שפותחה על ידי Brodt להשתמש בתוויות לא רדיואקטיביות ולספור ישירות את מספר תאים הגידול הקפדה על פני השטח בשטח. In-חסיד תאים סרטניים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ אור ואישר על ידי שיטה מבוססת על-ידי זריחה, מתן אינדקס הדבקה החושף את הזיקה לתא-מחייב ב-LN, אשר היא עדות מרמזת של שינויים מולקולריים באיגוד האהדה של אינטגרציה להתאים שלהם ב-ligands ליגנדס.

Introduction

גרורות סרטן היא הסיבה העיקרית לכישלון הטיפול ואת ההיבט הדומיננטי סכנת חיים של סרטן. כפי היסוד 130 לפני שנים, התפשטות גרורתית תוצאות כאשר האליטה של תאי הגידול הפיצו (DTCs, "זרעים") לרכוש יכולות ביולוגיות ספציפיות המאפשרות להם להתחמק אתרים עיקריים ולהקים צמיחה ממאיר באתרים מרוחקים ("האדמה")¹. לאחרונה, מספר מושגים חדשניים לגבי היחסים "זרעים וקרקע" הופיעו, כגון אינדוקציה של נישות גרורתית (המשגיחה כ "אדמה פורייה" הדרושה "זרעים" כדי לשגשג), הזריעה עצמית של גידולים ראשוניים על ידי dtcs, "זרע" תרדמה באיברים משניים ומודל מתקדמות מקבילי של גרורות².

עבור ממאירות מוצק ביותר, DTCs יכול לשכון ולהתגלות באיברים רבים mesenchymal, כגון מח עצם ובלוטות הלימפה (LNs) בחולים עם או בלי ראיות של גרורות קליני. מכיוון LNs ניקוז הגידול הם המיקום הראשון של התפשטות האזור של DTCs, במצב LN הוא אינדיקטור תחזיות חשוב והוא משויך לעיתים קרובות עם החלטות טיפול בפסיקה³. עבור חלק מסוגי הגידולים, הקורלציה בין במעמד ותוצאות גרועות יותר היא חזקה, כולל ראש וצוואר^4,5, שד⁶, הערמונית⁷, ריאה⁸, קיבה⁹, המעי הגס^10,11 בלוטת התריס סרטן¹².

Lns הם איברים קטנים דמוי של מערכת הלימפה, כי הם מכוסים בתאים רשתית מוקף עם כלי הלימפה. איברים אלה נחוצים בהחלט לתפקוד מערכת החיסון¹³. LNs לפעול כפלטפורמות מושכים עבור תאים מחזורי החיסונית, להביא את לימפוציטים ו אנטיגן הצגת תאים יחד¹⁴. עם זאת, LNs גם למשוך תאים סרטניים במחזור. לאורך עשורים, LNs היו בתמונה כמסלולים פסיבי של הובלה תאים סרטניים גרורתי. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי תאים סרטניים עשוי גם להיות מונחה לכיוון LNs על ידי כימוטקטיק (נוגדנים) ו/או האפוטוטקטיק (אלמנטים מטריקס מושג) רמזים מופרש על ידי אנדותל הלימפה¹⁵. כדוגמאות, ביטוי יתר של קולטן CCR7 בתאי הגידול מקלה על ההדרכה של תאים מלנומה גרורתית לקראת הגידול-LNs מרוקן¹⁶. בנוסף, מסחטות חלבונים ב-LN לספק פיגום דבק עבור גיוס והישרדות של תאים סרטניים במחזור¹⁷. למעשה, מרוקן הגידול LNs לספק קרקע פורייה לזריעה של DTCs, אשר ניתן לשמור במדינות מתרבים או רדום על ידי מסוים בתוך אותות סביבתיים מיקרו¹⁸. גורלם הסופי של פקדי הזמן המתגוררים בעיר הוא שנוי במחלוקת; כמה עבודות מציעות כי תאים אלה הם אינדיקטורים פסיבי של התקדמות גרורתית¹⁹, בעוד אחרים מציעים כי הם בסבירות גבוהה יותר מייסדי ההתנגדות (על-ידי לזריעה עצמית אתרים ראשיים) ו/או לפעול כמאגרים סלולריים עבור גרורות (הפצת "זרעים" לצמיחת סרטן שלישוני)^20,21. לאחרונה, שימוש במודלים פרה-קליניים, זה הוכיח כי חלק של אלה בתוך המתגוררים DTCs באופן פעיל הפולשים כלי הדם, נכנס למחזור הדם והכובש את הריאות²¹.

בהתחשב בכך נוכחות של תאים סרטניים ב LNs הוא סמן עבור תוקפנות סרטן והחלטיות, במחקר זה, אנו אופטימיזציה שיטה קלאסית שפותחה על ידי Brodt²² כדי כימות הגידול למדוד בלתי מותאם למדידת הגידולים לתאי מבחנה. השימוש בכדאיות מבוססת-פלואורסצנטית איפשר לנו לפתח פרוטוקול בעלות נמוכה, מהירה, רגישה וידידותית לסביבה (לא רדיואקטיבית) לאיתור שינויים דביקים בין תאי גידול לבין מקטעי בהקפאה. באמצעות התאים של סרטן השד MCF-7 המבטא רמות שונות של ביטוי גנים NDRG4 ועכברוש בסעיפים קפואים להדגים את השיטה, הראנו כי פרוטוקול זה איפשר מתאם טוב בין הדבקה תא הגידול כדי LNs בתוך מבחנה בתוך גרורות שנצפו בחולי סרטן השד²⁴.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

LNs התגלו מגוויות טרי של מבוגר בריא חולדות Wistar הוקרב על ידי פריקה צוואר הרחם. עקבנו אחר הנחיות NIH לכאב ומצוקה בחיות מעבדה וכל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה ומחקר בעלי חיים של מכון המחקר והחינוך של בית החולים Sírio-Libanês (CEUA P 2016-04).

הערה: כל הרקמות הקפואות הטריות נחשבות לחומרים ביולוגיים ויש לטפל בהן באמצעות אמצעי זהירות מתאימים לבטיחות ביולוגית.

1. Lymphadenectomy וקריוסיסיב

1. מניחים גוויות טריים של חולדות Wistar למבוגרים (180-220 g) שוכב בתוך שכיבה על לוח חיתוך נקי בטמפרטורת החדר.
   הערה: LNs יש לאסוף עד 30 דקות לאחר המתת חסד.
2. רסס את גופת החולדה עם אלכוהול איזופרופילי 70% והשתמש בכלים מעוקרים לקציר.
3. הרם את עור הבטן בעזרת מלקחיים ופתח חלל עם חתך אמצעי מבלי לפגוע ברקמה הבסיסית, תוך חשיפת מעיים הבטן. משוך החוצה את המעי, LNs החזה ואת הבטן להיות גלוי (איור 1).
4. השתמש במספריים של מספריים בעלי עצות בוטה כדי להימנע מפגיעה בעורק הראשי העליון השוכב מאחור.
   הערה: בהתאם למיקום של הצומת לימפה מחדש, יש צורך לנקות רקמות אחרות דבקה אותו, כגון רקמה מצע.
5. הקציר LNs לתוך 15 מ ל צינורות חרוטי המכיל 5 מ ל של מלוחים סטרילי מאגור פוספט (PBS).
6. להשליך כראוי את גוויות החולדה.
7. להסיר LNs טרי מ-PBS, רול ולייבש את הצומת על נייר סינון יבש. מניחים אותו בצלחת פטרי קטנה ולהוסיף פתרון הטבעה של דגימות רקמות קפואות (O.C.T.) עבור 2 דקות.
8. להעביר ולהתמצא הפנים למטה במיקום הרצוי בבסיס של הקריוזקן, עם מספיק בדיוק O. C כדי לכסות את זה. להימנע בועות ליד הרקמה. משטח הקרקע הוא. החלק התחתון של הקריומיושן
9. באופן מיידי להקפיא את הקריומד במקרר קלקר עם קרח יבש. כאשר יש עדיין חלק קטן של O.C.T. הקפואה (~ 20-35 s), להעביר את המדגם לרדיד אלומיניום ולמקם אותו קריר עם קרח יבש תוך המשך להקפיא דגימות אחרות. בסוף, לאחסן את כל הדגימות ב-80 ° c עד הפחתת.
10. מקטע את LN עם עובי התאמת מקטע התאמה ל 5-8 μm. העברת הקפאה של שקופיות על מיקרוסקופ.
    הערה: לפני שאתה מוותר, הסר את הדגימות הקפואות ממקפיא-80 ° c ואפשר להם לתקן את הטמפרטורה בחדר המיקרו-מיקרו-סטטיסטיקה ב-22 ° c עבור כ -30 דקות. ניתן לאחסן את השקופיות המכילות ב-80 ° c עד חודש אחד.

2. תיוג סלולארי עם צבעי פלורסנט

הערה: צבעי פלורסנט נמצאים בשימוש נרחב בביולוגיה של תאים. אנחנו מעדיפים להשתמש התיוג הארוך שרשרת התוויות (dii (C₁₈), עירור 549 nm, פליטה 565 nm) כי הם בהירים, יציב ניתן להוסיף ישירות לתקשורת התרבות, אינו משפיע על הכדאיות התא או המאפיינים דבק תא^25,26.

1. תאים המונתק גדלים תחת תנאים אידיאליים (כלומר, במדיום מלא) ולהשעות מחדש בינונית ללא סרום בצפיפות של 10⁶ תאים/mL.
2. הוסף 1 מ ל של השעיית תא (10⁶ תאים) לצינור a15 mL ו תווית עם דיל (C₁₈) (2 μg/mL) עבור 10 דקות ב 37 ° c.
   הערה: לאחר 5 דקות, בעדינות מתפרעים את הצינורות כדי למנוע משקעי תאים וכתמים של תאי ממדים. צפיפויות גדולות יותר דורשות זמני דגירה ארוכים יותר עבור כתמים אחידים. זמן דגירה אופטימלי עבור הצביעת התא משתנה עם קו התאים. זה יכול להיות יותר כימות באמצעות FL2 המקובלת זרימה cy, לנסות ערוץ זיהוי (איור 2א).
3. צנטריפוגה את שפופרות ההשעיה בתווית ב 300 x g עבור 4 דקות.
4. הסר את הסופרנטנט ושטוף פעמיים ב -10 מ ל של מדיום ללא סרום. לשחזר את התאים כדורי אדום. השהה מחדש את התאים בגודל של 10⁶ תאים/mL ב-סרום ללא מדיום עם 0.1% בסרום (bsa).

3. מנות מקדימות עם פתרון פולי-L-ליזין או BSA כבקרת זריעה (אופציונלי)

הערה: השתמשנו מנות תרבות התא מצופה מראש עם PLL כמו משטחי טעינה חיוביים שליטה כדי להבטיח כי קבוצות נסיוניות שונות של תאים סרטניים הופרה באותו מספר, כמו גם משטחים מצופי BSA כפקדים שליליים.

1. בתנאים סטריליים, כדי להכין את PLL-or BSA-מצופה בארות, להוסיף 300 μL של PLL (0.1% w/v ב H₂o) או bsa (מדולל ב 2.5% w/v ב h₂o) ישירות לצלחת 24-הבאר ו מודלת לילה ב 4 ° c.
2. להסיר את הפתרון על ידי השאיפה, לשטוף בעדינות את פני השטח עם PBS סטרילי ומייבשים את הצלחת בטמפרטורת החדר במכסה העור-רקמה לפני זריעת התאים.
   הערה: הכרכים הסופיים של PLL או BSA חייבים להיות מותאמים בהתאם לאזור של צלחות היטב שונות.

4. זריעת פלורסנט-התווית תאים סרטניים על בתוך בהקפאה או PLL/BSA-מצופה בארות

הערה: כפקדים ניסיוניים, השתמשנו (1) מנות תרבות התא מצופות מראש עם PLL או BSA ו-(2) מקטעים רצופים של אותו b לניסוי (ראה פירוט זה באיור 2D), שבו האחרון יהיה למזער וריאציות אזוריות בהרכב מטריצה (ecm) של כל מקטע LN, אשר בתורו יכול להכתיב את קצב עבור שיטת הדבקה של תא הגידול הבא, בחר באיכות גבוהה ורציפים מקטעי בהקפאה.

1. שוטפים בעדינות את הקריודורים פעמיים עם PBS ומייבשים עם PBS במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
2. חסימת הדבקה לא ספציפית לקריודורים עם 2.5% BSA עבור 30 דקות ב-37 ° c. השתמש בתאי השטיפה האימונוהיסטוכימיה ובעריסות לאמינה כדי להבטיח כי כל ה-O. C. T הוסר במהלך השטיפה והincubations.
3. מסננים את ה-BSA העודפים על מגבת נייר יבשה, מייבשים את המתאר של מקטעי LN בעזרת מטלית כותנה וממקיפים את המקטעים באמצעות עט פאפ.
4. עבור שיטת הדבקה של תא הגידול, להוסיף 100 μL של השעיית תא (משלב 2.4) לכל מקטע LN מוקף או גם בצלחות 24-היטב PLL-מצופה ולמקם אותו בארון מחולל לחות עבור 1-2 h ב 37 ° c בחממה המקובלת בתרבות התא.
   הערה: הנפח הסופי של השעיית תאים צריך להיות מותאם על פי השטח של LNs שונים מוקפים.
5. שטוף בעדינות את התאים הלא מחסיד ארבע פעמים עם PBS. תקן את התאים הפלורסנט הנותרים חסיד עם 3.7% פורמלדהיד ב-PBS עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר.

5. קוונפיקציה ידנית של המדד הדביק

הערה: המדד הדביק (כלומר, תאים סרטניים/in mm²) הושג באמצעות מטרה 10x ובאופן ידני לספור את מספר התאים הסרטניים, מזוהה בקלות על ידי מיקרוסקופ אור ואישר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית (איור 2ד), באזורים הלימפה לימפה של מספר שדות עצמאיים (השיג באמצעות

1. השתמש במיקרוסקופ פלורסנט עם מטרה 10x לקחת תמונות TIFF נפרדות בשני ערוצים המתאימים לשדות הבהירים והמוארים בצבע אדום (איור 2ד). שם ושמור תמונות אלה באופן שיטתי.
2. הפעל את ImageJ/פיג'י, פתח את התמונות וקבע את קנה המידה. יש להשתמש בסולם כיול (לדוגמה, שליט מיקרומטר 1 מ"מ) (איור 2ג).
3. פתח את התמונה של סרגל המיקרומטר (או מיקרומטר שלב), בחר את כלי הקו הישר וצייר קו ישר המגדיר מרחק ידוע.
4. בתפריט ' ניתוח ', בחר ' קבע קנה מידה'. המרחק בפיקסלים יתמלא בהתאם לאורך (בפיקסלים) של הקו שצויר בשלב 5.3. המרחק הידוע יתמלא במרחק האמיתי (במקרה זה, במילימטרים) וביחידת האורך בשדה ' יחידת אורך ' (במקרה זה, במילימטרים).
5. לחץ על הלחצן הכללי (כיול זה חל על כל התמונות שנפתחו בהפעלת imagej/פיג'י) ולחץ על אישור.
6. הלימפה האזור הצומת כימות: בחר את הכלי שרביט ועל ידי לחיצה כפולה, לפתוח את הגדרות הכלי מטה . הגדר מצב כמחוברל-8. לחץ בתמונה והגדר את הסובלנות עד לבחירת כל בלוטות הלימפה בתמונה ולחץ על אישור. כדי למדוד את האזור, פתח את ' נתח ' | מדידה (CTRL + M). האזור מבוטא ביחידות שנקבעו קודם לכן.
7. תא הגידול כימות: לפתוח את מיקרוסקופ אור/תמונות זריחה בתוכנת פיג'י. בחר תוספים | לנתח את | מונה תאים | . מונה תאים לחץ על התמונה כדי להיות כמותית ולחץ על לחצן אתחול בחלון מונה התא. בחר סוג מונה (1-8) ולחץ על התאים בתמונה. כדי לאתחל את התמונה הבאה, לחץ על לחצן איפוס בחלון המונה של התא, פתח את התמונה החדשה וחזור על כל השלבים.
   הערה: המדד האדהזיה מבוטא כמספר תאי גידול מחסיד לכל אזור LN (תאים/mm²).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אנו ממחישים את היכולת על ידי הערכת הפוטנציאל הדביק LN של פלורסנט אדום MCF-7 סרטן השד ביטוי רמות שונות של הגן NDRG4 (המכונה NDRG4-חיוביים ו NDRG4-שלילי תאים), מאפטור שלילי של beta1 אינטגרציה באשכולות במשטח התא²⁴, על ידי בחינת שברים של בתאי הגידול החולדה in-חסיד. דוגמאות לתמונו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מערכת הלימפה הפצת תאים סרטניים דורש מגוון של אירועים מונחה תאים מורכבים. הם ליזום עם ניתוק התאים מהגידול העיקרי ואת שיפוץ של מטריצה החילוץ (ecm) האדריכלות, והם נתמכים על ידי כימוצ מתמשך הגירה פעילה דרך כלי לימפה lymphatics en בדרך הזקיף lns. אם תאים סרטניים לדבוק ולשרוד LNs, הם יכולים בקלות להתפשט לאי?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tubes	Corning	352096
2-propanol	Merck	109634
Benchtop Laminar Flow	Esco Cell Culture
Bin for Disc	Leica	14020139126
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9647-100
Cell culture flask T-25 cm2	Corning	430372
Cryostat	Leica	CM1860 UV
Cryostat-Brush with magnet	Leica	14018340426
DiIC18 Cell Traker Dye	Molecular Probes	V-22885
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	12657-029
Fluorescence microscope	Nikon Eclipse 80
Forma Series II CO2 incubator	Thermo Scientific
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549
High Profile Disposable Razor	Leica	14035838926
Incubation Cube (IHC)	KASVI	K560030
Inverted microscope	Olympus	CKX31
Isofluran 100 mL	Cristália
Liquid Bloquer Super Pap Pen	Abcam, Life Science Reagents	ab2601
Optimal Cutting Temperature "OCT" compound	Sakura	4583
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Life Technologies	70011-044
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	Gibco	31800-022
Serological Pipettes 1 mL	Jet Biofil	GSP010001
Serological Pipettes 10 mL	Jet Biofil	GSP010010
Serological Pipettes 2 mL	Jet Biofil	GSP010002
Serological Pipettes 5 mL	Jet Biofil	GSP010005
Serological Pipettes 50 mL	Jet Biofil	GSP010050
Serological Pipettor Easypet 3	Eppendorf
Tissue-Tek cryomold	Sakura	4557
Trypan Blue 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Instituto Adolfo Lutz	ATV