ויזואליזציה של מקרופאג Lytic תא המוות במהלך זיהום פטרת העוברים באמצעות מיקרוסקופ אינטרטל

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להמחיש התנהגות מקרופאג ומוות העובריים מתחלקים במהלך הזיהום של מריחיידק של פטרת . צעדים להכנת חיידקים, זיהום העוברים, ומיקרוסקופ ה, כלולים. טכניקה זו עשויה להיות מיושמת על התבוננות של התנהגות תאית ומוות בתרחישים דומים הכרוכים זיהום או דלקת סטרילית.

Abstract

Zebrafish הוא אורגניזם מודל מעולה לחקר התנהגות התא החיסונית מולדת בשל טבעו שקוף הסתמכות אך ורק על מערכת החיסון שלה מולדת במהלך ההתפתחות המוקדמת. Zebrafish מריחיידק מארנום (מ. מרנום) מודל זיהום כבר הוקמה היטב ללמוד תגובה חיסונית מארחים נגד זיהום פטרת. יש כבר הציע כי שונים סוגי מוות מקרופאג cell יוביל לתוצאות מגוונות של זיהום בקטריאלי. כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ המקרופאג להתבונן במוות התאים בתוך עוברי דגים בעקבות זיהום מ. מרנום . Zebrafish הקווים הטרנסגניים במיוחד בתוויות מקרופאגים ו נויטרופילים נגועים באמצעות מיקרוהזרקה שרירית של fluorescently אופן שכותרתו M. marinum באמצע המוח או המטען. עוברים מזוהמים העוברי דגים הם רכוב לאחר מכן על התכה נמוכה ההיתוך ונצפתה על ידי המיקרוסקופיה בממדים X-Y-Z-T. מכיוון שהדמיה לטווח ארוך מחייבת שימוש בכוח לייזר נמוך כדי למנוע הלבנת ופוטורעילות, מומלץ לבטא מאוד את הביטוי. פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה של התהליכים הדינאמיים ב vivo, כולל העברת תאים חיסוניים, אינטראקציה עם הפתוגן מארח, ומוות תאים.

Introduction

זיהום פטרת הוכח לגרום למוות תא החיסון מארח¹. למשל, זן מחליש יהיה להפעיל אפופטוזיס במקרופאגים ולהכיל את הזיהום. עם זאת, זן המוני יהיה להפעיל את המוות התא lytic, גרימת הפצת חיידקים^1,2. בהתחשב ההשפעה האלה סוגים שונים של מוות תאים יש על מארח התגובה נגד פטרת, התבוננות מפורטת של מקרופאג cell מוות במהלך זיהום פטרת ב vivo הוא צורך.

השיטות הקונבנציונליות למדידת מוות תאי הן להשתמש בכתמי תאים מתים, כגון V, tunel, או אקרידיין אורנג '/propidium יודידה כתמים^3,4,5. עם זאת, שיטות אלה אינן מסוגלים לשפוך אור על התהליך הדינמי של מוות התאים בvivo. האבחנה של מוות תאים בתוך מבחנה כבר הונחה על ידי הדמיה חיה⁶. עם זאת, האם התוצאות מחקות במדויק את התנאים הפיסיולוגיים נותרים ברורים.

Zebrafish כבר מודל מצוין עבור לימוד מארח נגד פטרת תגובות. יש מערכת חיסונית שימור מאוד דומה לזה של בני אדם, הגנום מניפולציות בקלות, והעוברים המוקדמים הם שקופים, אשר מאפשר הדמיה חיה^7,8,9. לאחר ההדבקה עם מ. מרנום, בוגרים מסוג זברפיש מבנים טיפוסיים של גרגירומת מבוגרים, ויוצריםבצורת מבנה שכגרגירומה מוקדם^{מבנים 9,10}. התהליך הדינמי של האינטראקציה הטבועה תא החיסונית בקטריה כבר נחקרו בעבר במודל דג זברה M. מרנום מודל^11,12. עם זאת, בשל הדרישה גבוהה מרחבית ברזולוציה הזמנית, הפרטים המקיפים את מותם של תאים חיסוניים מולדים להישאר במידה מוגדרת ברובו.

כאן אנו מתארים כיצד להמחיש את התהליך של מוות תא מקרופאג lytic המופעל על ידי זיהום פטרת בvivo. פרוטוקול זה עשוי להיות גם להחיל על התנהגות תאית הvivo במהלך פיתוח ודלקת.

Protocol

Zebrafish גדלו תחת תנאים סטנדרטיים בהתאם הנחיות בעלי חיים מעבדה לסקירה אתית של בעלי חיים רווחה (GB/T 35823-2018). כל ניסוי דג זברה במחקר זה אושרו (2019-A016-01) וניהל ב שנגחאי הציבור בריאות קלינית המרכז, אוניברסיטת fudan.

1. M. מרנום תא יחיד הכנה לרשת (איור 1)

1. הפשרת Cerulean-פלורסנט M. marinum גליצרול מלאי מ-80 ° c והאיחסן לוחית 7h10 אגר עם 10% (v/v) oadc, 0.25% גליצרול ו 50 Μg/mL hygromycin. מודקת את הצלחת ב 32 ° c עבור כ 10 ימים.
2. בחר מושבה המבטא זריחה חיובית והאיחסן 3 מ ל של 7H9 בינוני עם 10% OADC, 0.5% גליצרול, ו 50 μg/mL hygromycin.
   1. מודדקת את החיסונים ב 32 ° צ' ו 100 מהפכות לדקה (rpm) עבור 4 – 6 ימים עד התרבות מגיעה לשלב לוגריתמי (OD₆₀₀ = 0.6 – 1.0).
   2. תת-תרבות (1:100) ב 30 מ ל של טריים 7H9 בינוני עם 10% OADC, 0.5% גליצרול, 0.05% יצירת רצף-80, ו-50 μg/mL עד OD₆₀₀ מגיע ~ 1.0.
      הערה: לאיכות התרבות הגבוהה ביותר, מומלץ לשלב זה צעד תת-תרבות. בניסיון שלנו, הוספת שיבוט ישירות לנפח גדול של בינוני יוביל היווצרות של גושים חיידקיים.
3. לאסוף תאים M. מרנום כמתואר להלן.
   1. צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 10 דקות כדי לאסוף את M. מרנום כמו גלולה. למחוק את כל אבל 300 μL של supernatant ולהשתמש בו כדי להשעות מחדש את הגלולה.
   2. הוסף 3 mL של 7H9 בינוני עם 10% גליצרול כדי להשהות עוד יותר את הגלולה, ולאחר מכן sonicate את ההשעיה באמבט מים ב 100 W ב 15 s ON, 15 s ביטול עבור סכום כולל 2 דקות.
      הערה: המטרה של sonication היא להשיג תא בודד המגון לצורך האירשת, אשר תמנע חסימה של מחט המיקרו הזרקה.
4. להעביר את ההשעיה חיידקים 10 mL מזרק, ואז לעבור דרך מסנן 5 יקרומטר כדי להסיר את כל הגושים בקטריאלי.
5. למדוד את הצפיפות האופטית (OD) של ההשעיה באמצעות ספקטרוסקופיה ולדלל אותו OD₆₀₀ = 1.0 עם מדיה 7H9 המכיל 10% גליצרול. לחלק את ההשעיה לתוך 10 μL הבליטים ולאחסן ב-80 ° c מקפיא לשימוש עתידי.
6. לאשר את הריכוז החיידקי של האינוניות (cfu/mL) על ידי דילול סדרתי ציפוי של מלאי בקטריאלי על הצלחת 7H10 אגר המכיל 10% (v/v) של OADC, 0.5% של גליצרול, ו 50 μg/mL של hygromycin.

2. הכנה לעובר בדגים

1. , אחד מיום לפני ההשרצה. להקים זוגות מתרבים בחדר הרבייה
   הערה: הוסף רק זוג אחד לכל חדר רבייה.
2. לאסוף את העוברים בבוקר למחרת בתוך 1 h הפריה הפוסט (hpf). בזהירות לשטוף את העוברים עם מים מזוקקים ולהעביר עד 100 עוברים לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ המכיל 30 מ ל של E3 מדיום. מודטה ב 28.5 ° c.
3. לאחר 12 שעות, להתבונן תחת מיקרוסקופ ולהשליך ביצים לא מופרות או פגום.
4. ב 24 hpf, לשנות את המדיום ל-E3 בינונית טרייה עם N-פניylourea (PTU, 0.2 nM הריכוז הסופי) כדי למנוע את התפתחותם של פיגמנט. מודטה את העוברים ב 28.5 ° c עד העוברים מוכנים מיקרוהזרקה.

3. זיהום באמצעות מיקרו הזרקה חיידקית

1. הכנת בורוסיליקט מחטי זכוכית מיקרוקפילר כפי שמתואר קודם לכן בהתייחסות¹³.
2. עוברי דג שעוברים הרכבה לזיהום
   1. מיקרוגל 100 mL של 1% (w/v) ו 100 mL של 0.5% (w/v) התכה נמוכה ההיתוך בינונית E3 עד הצמח נמס לחלוטין. לחלק לצינורות mL 1 מ"ל ולאחסן ב 4 ° צ' לשימוש עתידי.
   2. לפני השימוש, לחמם את הצמח ב 95 מעלות צלזיוס בלוק חימום עד שהוא נמס לחלוטין. שמור על הצמח בצורה נוזלית על-ידי הצבתו בבלוק של 45 ° c (איור 2).
   3. הרכבה לזיהום תוך-שרירית באזור הגזע
      1. צור את שכבת agarose התחתונה על-ידי שפיכת 0.5 mL של 1% (w/v) התעוררה באופן שווה על שקופית זכוכית. מניחים על תיבת קרח או משטח קר עבור 3 דקות כדי לגבש.
      2. העבר את עוברי הדג (48 – 72 hpf) ב מי ביצה עם tricaine (200 μg/mL) ו-PTU עבור 5 דקות לפני ההרכבה. מקום עד 60 דג זברה עוברים על השכבה התחתונה agarose ולהניח אותם בזהירות לתוך שתי שורות (איור 2ב).
      3. הסר את המים הנותרים על השכבה התחתונה agarose עם נייר טישו לפני הוספת 0.3 mL של 0.5% (w/v) agarose כדי ליצור את השכבה העליונה. ודא כי העוברים מוטבעים לחלוטין בתוך הצמח. החזר את שקופית הזכוכית אל תיבת הקרח שוב כדי לחזק את הצמח ולמנוע התייבשות.
      4. לשמור על השכבה העליונה של agarose לחות על ידי כיסוי פני השטח עם תוספת E3 מי ביצה.
   4. הרכבה לזיהום מוחי בינוני
      1. לכסות את החריץ של מיקרוסקופ יחיד מיקרוסקופית זכוכית שקופית עם 1% (w/v) agarose, ולאחר מכן להעביר את 4 – 6 עוברים מורדם לתוך הצמח.
      2. מקמו את ראשו של כל עובר כלפי מעלה בזהירות עם מחט של 10 גר' (איור 2ג).
      3. לאחר כל מיקומי העוברים קבועים, להעביר את שקופית הזכוכית לתיבת קרח או משטח קר כדי לאפשר לחזק את הצמח.
         הערה: הימנע מדילול ההיתוך נמוך על ידי מזעור נפח של העברת מים ביצה עם העוברים.
3. הכנת חיידקים לזיהום
   1. הוסף 1 μl של מסוננים סטרילי-פנול אדום (10x) ל 10 μl סדרת מחלקים של מלאי חיידקי (עשה בשלב 1) ולערבב על ידי vortexing בקצרה.
      הערה: ניתן לכוונן את הריכוז הסופי באמצעות ה-PBS הסטרילית.
   2. Sonicate ההכנה באמצעות 100 W ב -10 s ON, 10 s כבוי עבור 1 דקות כדי לשבור את כל הגושים שייתכן שנוצרו¹⁴.
4. זיהום באמצעות מיקרו-הזרקה
   1. כוונן את המיקרו-מזרק והמיקרומניפולציה למיקום הנכון ולהגדרה של מיקרוהזרקה כפי שדווח בעבר על¹³.
   2. העברה 3 μL של הכנה חיידקית באמצעות מטעין מיקרו לתוך המחט מוכן (ראה שלב 3.1). הפיפטה לאט ובזהירות כדי להימנע מיצירת בועות אוויר.
   3. עבור זיהום אזור הגזע, להזריק 100 cfu לתוך אזור הגזע (איור 3א). הימנע מהזרקת חיידקים לתוך מיתר הנוטוקורד.
      הערה: cfu להזרקה מוערך על ידי הנוסחה cfu = ריכוז מלאי חיידקי x דילול גורם x הזרקה droplet. Cfu בפועל הוא אישר על ידי ציפוי טיפה אחת של בקטריות בצלחת 7H10 אגר המכיל 10% (v/v) של OADC, 0.5% של גליצרול, ו 50 μg/mL של hygromycin.
   4. עבור זיהום המוח האמצע, להזריק על 500 cfu לתוך האזור המוח אמצע (איור 3ב).
   5. לאחר המיקרוהזרקה, שוטפים בזהירות את העוברים לתוך מי ביצה טריים עם פיפטה פלסטיק.
      הערה: העוברים הר בצלחת הזכוכית בתחתית בהקדם האפשרי כדי לכסות את התצפית של התגובה המוקדמת מאוד מולדת התא החיסונית.

4. הדמיה חיה של הזיהום

1. הרכבה לדגים להדמיה חיה
   1. העברה עד 10 העוברים tricaine-מ, לאמצע התחתונה זכוכית 35 mm צלחת. התעלם מאמצעי E3 נוסף.
   2. לכסות את הצלחת עם 1% התכה נמוכה בנקודה והאוריינט העוברים בזהירות באמצעות המחט 10 G. מקרין את הקערה בתחתית הזכוכית על קרח 10 כדי לחזק את הצמח.
      הערה: לצורך הזרקת מוח מוחית, יש לרכוב על עוברים בתוך הצמח כאשר הראש מופנה כלפי מעלה (איור 4א). עבור האזור גזע הזיהום הפנימי, העוברים צריך להיות מותקן בתוך הצמח (איור 4ב).
   3. ברגע שהוא התחזק לחלוטין, לכסות את agarose עם שכבה של מי ביצה (פלוס 1 x tricaine ו PTU).
2. שלושה צבעים ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה קונפוקלית
   הערה: השלבים הבאים מופעלים על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד 63.0 x 1.40 הנפט היעד UV עדשה.
   1. הגדר את טמפרטורת חדר הסביבה עד 28.5 ° c. מניחים כמה נייר טישו רטוב בתוך החדר כדי לספק לחות ולמנוע אידוי של מי ביצה (משלים איור 1).
   2. מניחים את הצלחת 35 מ"מ זכוכית בתחתית עם דג דג זברה בחדר הסביבה.
   3. פתח את התוכנה הקונקלית ואתחל את הבמה. עבור אל מטרת ה-UV של 63.0 x 1.40 שמן, ואתר את הדגים באמצעות ערוץ השדה הבהיר עם מסנן ניגודיות דיפרנציאלי (DIC).
   4. פתח את 405 דיודות, ארגון (20% כוח), ו DPSS 561 לייזר nm. הגדרת עוצמת הלייזר והגדרות הספקטרום המתאימות.
      הערה: להלן הגדרות הספקטרום עבור Cerulean (עירור = 405 nm; פליטה = ~ 456 – 499 nm), eGFP (עירור = 488 nm; פליטה = ~ 500 – 550 ננומטר), DsRed2 (עירור = 561 nm; פליטה = ~ 575 – 645 nm) (משלים איור 2B).
   5. בחר את "XYZ" "סריקה סדרתית" מצב הרכישה ולהגדיר את הפורמט תמונות "512 x 512 פיקסלים" (איור משלים 2a).
   6. עבור אל 'מצב נתונים חי'. למקד את המיקום של הדגים הראשונים ולסמן את מיקום "התחל" ו "סוף" Z. חזור על תהליך זה עבור כל אחד מהעוברים הנותרים. ניתן להוסיף "השהה" בסוף התוכנית (איור משלים 2 ג).
   7. הגדר את הלולאה ואת מחזור התוכנית.
   8. . שמור את הקובץ

5. תא יחיד UV הקרנה לגרום אפופטוזיס והדמיה חיה

1. דג הר כפי שמתואר בשלב 4.1.
2. הדמיה של אזור אמצע המוח של 3 ימים הפריה (dpf) מקרופאג העובר הספציפי Tg (mfap4-eGFP) ¹⁵
3. בחר את האזור של העניין של ממקרופאג אחד בודד התווית ולסרוק ב-400 Hz מהירות 6% לייזר UV כוח עבור 50 s.
   הערה: מהירות הסריקה והזמן צריכים להיות ממוטבים בהתאם למיקרוסקופ הבודד. זמן סריקה צריך להיות ממוטב כדי לגרום נזק DNA נרחב כי לאחר מכן לגרום היעד תאים אפופטוזיס, אבל לא photobleach כל התא.
4. חזור על השלב שלעיל כדי להקרין תאי יעד נוספים.
5. בצע הדמיית זמן הדמיה של אזור אמצע המוח כמתואר בסעיף 4.

6. עיבוד תמונה

1. בצע "הטלה מקסימלית" עבור התמונות שנרכשו.
2. חפש וסמן את המיקום והשעה של תרשימי XY בתאי היעד תחת התצוגה "הקרנה מקסימלית".
3. חזור אל התצוגה הרגילה כדי לחפש ולסמן את מיקום Z של תאי היעד.
4. חתוך את תמונת השכבה הבודדת של תאי היעד.
5. יצא את ערוץ הכיסוי והשדה הבהיר כסרטוני וידאו בתבנית AVI.
6. חתוך את אזור העניינים של ערוץ הכיסוי והשדה הבהיר ב-ImageJ.
7. לשלב את שני קטעי וידאו בשלב האחרון אנכית ולשמור כמו וידאו אחד בפורמט AVI ב-ImageJ.

תוצאות

זיהום פטרת יכול להפעיל תגובות מארח שונים מבוסס על נתיבי זיהום. בפרוטוקול זה, עוברי דג דג זברה נגועים על ידי הזרקת מיקרותוך שרירית של חיידקים המסומנים fluorescently לתוך המוח האמצע או המטען (איור 3) ונצפתה על ידי הדמיה מוקד חי. זיהום באמצעות שני המסלולים הללו יהיה באופן מקומי להגבי?...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של מוות מקרופאג במהלך זיהום פטרת. מבוסס על גורמים כגון שלמות קרום התא, זיהום מונחה תאים מוות יכול להיות מחולק אפופטוזיס ו-lytic מוות התא^24,25. המוות התאי lytic הוא מלחיץ יותר עבור האורגניזם מאשר אפופטוזיס, כי זה מפעיל תגובה דלקתית חזקה

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Tween-80	Sigma	P1379
10 mL syringe	Solarbio	YA0552
10% OADC	BD	211886
3-aminobenzoic acid	Sigma	E10521
5 μm filter	Mille X	SLSV025LS
50 μl/ml hygromycin	Sangon Biotech	A600230
7H10	BD	262710
7H9	BD	262310
A glass bottom 35 mm dish	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
Agarose	Sangon Biotech	A60015
Confocal microscope	Leica	TCS SP5 II
Enviromental Chamber	Pecon	temp control 37-2 digital
Eppendorf microloader	Eppendorf	No.5242956003
Glass microscope slide	Bioland Scientific LLC	7105P
Glycerol	Sangon Biotech	A100854
Incubator	Keelrein	PH-140(A)
M.marinum			ATCC BAA-535
Microinjection needle	World Precision Instruments	IB100F-4
Microinjector	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	NARISHIGE	MN-151
msp12:cerulean			Ref.: PMID 25470057; 27760340
Phenol red	Sigma	P3532
PTU	Sigma	P7629
Single concavity glass microscope slide	Sail Brand	7103
Sonicator	SCICNTZ	JY92-IIDN
Spectrophotometer (OD600)	Eppendorf AG	22331 Hamburg
Stereo Microscope	OLYMPUS	SZX10
Tg(mfap4:eGFP)			Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)			Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)			Ref.: PMID 27424497; 17477879