Visualisierung des Makrophagen-Lytic Zelltodes während der mykobakteriellen Infektion bei Zebrafischembryonen mittels Intravital-Mikroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Visualisierung des Makrophagenverhaltens und des Todes bei embryonalen Zebrafischen während einer Mycobacterium marinum-Infektion. Schritte zur Herstellung von Bakterien, Infektionder tenatierter Embryonen und intravitale Mikroskopie sind enthalten. Diese Technik kann auf die Beobachtung von Zellverhalten und Tod in ähnlichen Szenarien mit Infektion oder sterile Entzündung angewendet werden.

Zusammenfassung

Zebrafish ist ein ausgezeichneter Modellorganismus für die Untersuchung des angeborenen Immunzellverhaltens aufgrund seiner transparenten Natur und der Abhängigkeit ausschließlich von seinem angeborenen Immunsystem während der frühen Entwicklung. Das Infektionsmodell des Zebrafischs Mycobacterium marinum (M. marinum) hat sich bei der Untersuchung der Immunantwort des Wirts gegen mykobakterielle Infektionen etabliert. Es wurde vorgeschlagen, dass verschiedene Makrophagenzell-Todestypen zu den verschiedenen Ergebnissen einer mykobakteriellen Infektion führen werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Intravital-Mikroskopie, um den Tod von Makrophagenzellen in Zebrafisch-Embryonen nach einer M. marinum-Infektion zu beobachten. Zebrafisch transgene Linien, die speziell Makrophagen und Neutrophile kennzeichnen, werden durch intramuskuläre Mikroinjektion von fluoreszierend M. marinum entweder im Mittelhirn oder im Rumpf infiziert. Infizierte Zebrafisch-Embryonen werden anschließend auf niedrigschmelzender Agarose montiert und durch konfokale Mikroskopie in X-Y-Z-T-Dimensionen beobachtet. Da langzeitige Live-Bildgebung niedrige Laserleistung erfordert, um Photobleichungen und Phototoxizität zu vermeiden, wird eine stark exsemitende transgene empfohlen. Dieses Protokoll erleichtert die Visualisierung der dynamischen Prozesse in vivo, einschließlich Immunzellmigration, Interaktion mit Wirtspathogenen und Zelltod.

Einleitung

Eine mykobakterielle Infektion hat gezeigt, dass sie zum Tod von Immunzellen^{führt 1}. Beispielsweise löst ein abgeschwächter Stamm Apoptose in Makrophagen aus und enthält die Infektion. Jedoch, ein virulenter Stamm wird lytische Zelltod auslösen, was bakterielle Verbreitung^1,2. In Anbetracht der Auswirkungen dieser verschiedenen Arten von Zelltod auf die antimykobakterielle Reaktion des Wirts ist eine detaillierte Beobachtung des Todesfälles von Makrophagenzellen während einer mykobakteriellen Infektion in vivo erforderlich.

Die herkömmlichen Methoden zur Messung des Zelltodes sind die Verwendung von toten Zellflecken, wie Annnexin V, TUNEL oder Acridin orange/propidiumiodid Färbung^3,4,5. Diese Methoden sind jedoch nicht in der Lage, Licht auf den dynamischen Prozess des Zelltodes in vivo zu werfen. Die Beobachtung des Zelltodes in vitro wurdebereits durch Live-Bildgebung 6 erleichtert. Ob die Ergebnisse jedoch die physiologischen Bedingungen genau imitieren, bleibt unklar.

Zebrafische waren ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung von Host Anti-Mycobacterium Antworten. Es hat ein hochkonserviertes Immunsystem ähnlich dem des Menschen, ein leicht zu manipulierendes Genom, und die frühen Embryonen sind transparent, was eine^liveeBildgebung 7^,8,9ermöglicht. Nach einer Infektion mit M. marinum bilden erwachsene Zebrafische typische reife Granulomstrukturen, und embryonale Zebrafische bilden frühe Somaulom-ähnliche Strukturen^9,10. Der dynamische Prozess der angeborenen Immunzell-Bakterien-Interaktion wurde zuvor im Zebrafisch M. marinum Infektionsmodell^11,12untersucht. Aufgrund der hohen räumlich-zeitlichen Auflösung bleiben die Details rund um den Tod der angeborenen Immunzellen jedoch weitgehend undefiniert.

Hier beschreiben wir, wie der Prozess des makrophagenlytischen Zelltodes visualisiert wird, der durch eine mykobakterielle Infektion in vivo ausgelöst wird. Dieses Protokoll kann auch auf die Visualisierung zellulärer Verhalten in vivo während der Entwicklung und Entzündung angewendet werden.

Protokoll

Zebrafische wurden unter Standardbedingungen in Übereinstimmung mit Labortierrichtlinien zur ethischen Überprüfung des Tierschutzes (GB/T 35823-2018) aufgezogen. Alle Zebrafischexperimente in dieser Studie wurden genehmigt (2019-A016-01) und wurden am Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, durchgeführt.

1. M. marinum Einzelzell-Inokulum-Vorbereitung (Abbildung 1)

1. Cerulean-fluoreszierenden M. Marinumglycerinbestand aus -80 °C auftauen und eine 7H10-Agarplatte mit 10% (v/v) OADC, 0,25% Glycerin und 50 g/ml Hygromycin impfen. Inkubieren Sie die Platte bei 32 °C für etwa 10 Tage.
2. Wählen Sie eine Kolonie aus, die positive Fluoreszenz ausdrückt, und impfen Sie 3 ml 7H9-Medium mit 10% OADC, 0,5% Glycerin und 50 g/ml Hygromycin.
   1. Inkubieren Sie die Inokulation bei 32 °C und 100 Umdrehungen pro Minute (Rpm) für 4–6 Tage, bis die Kultur die logarithmische Phase erreicht (OD₆₀₀ = 0,6–1,0).
   2. Subkultur (1:100) in 30 ml frischem 7H9-Medium mit 10% OADC, 0,5% Glycerin, 0,05% Tween-80 und 50 g/ml bis die OD₆₀₀ 1,0 erreicht.
      HINWEIS: Für die höchste Kulturqualität wird an dieser Stelle ein Subkulturschritt empfohlen. Nach unserer Erfahrung wird das direkte Hinzufügen des Klons zu einem großen Volumen von Medium zur Bildung von bakteriellen Klumpen führen.
3. Sammeln Sie M. marinum Zellen wie unten beschrieben.
   1. Zentrifuge bei 3.000 x g für 10 min, um das M. marinum als Pellet zu sammeln. Entsorgen Sie alle bis auf 300 L des Überstandes und verwenden Sie es für das Wiederaufsetzen des Pellets.
   2. Fügen Sie 3 ml 7H9 Medium mit 10% Glycerin, um das Pellet weiter zu suspendieren, dann beschallen Sie die Suspension in einem Wasserbad bei 100 W bei 15 s ON, 15 s OFF für insgesamt 2 min.
      HINWEIS: Der Zweck der Beschallung ist es, ein einzelzelliges Homogenat für das Inokulum zu erreichen, das eine Verstopfung der Mikroinjektionsnadel verhindert.
4. Übertragen Sie die bakterielle Suspension auf eine 10 ml Spritze, und durchlaufen Sie dann einen 5-m-Filter, um alle bakteriellen Klumpen zu entfernen.
5. Messen Sie die optische Dichte (OD) der Suspension mit einem Spektralphotometer und verdünnen Sie sie auf OD₆₀₀ = 1,0 mit 7H9-Medien, die 10% Glycerin enthalten. Teilen Sie die Suspension in 10 L Aliquots auf und lagern Sie sie bei -80 °C Gefrierschrank für die zukünftige Verwendung.
6. Bestätigen Sie die bakterielle Konzentration des Inokulums (cfu/mL) durch serielle Verdünnung und Beschichtung des Bakterienbestands auf einer 7H10-Agarplatte, die 10 % (v/v) OADC, 0,5 % Glycerin und 50 g/ml Hygromycin enthält.

2. Zebrafisch Embryo Vorbereitung

1. Einen Tag vor dem Laichen haben Sie In der Brutkammer Zebrafischbrutpaare aufgestellt.
   HINWEIS: Fügen Sie jeder Brutkammer nur ein Paar hinzu.
2. Sammeln Sie Embryonen am nächsten Morgen innerhalb von 1 h nach der Befruchtung (hpf). Waschen Sie die Embryonen vorsichtig mit destilliertem Wasser und übertragen Sie bis zu 100 Embryonen in eine 100 mm Petrischale mit 30 ml E3-Medium. Bei 28,5 °C inkubieren.
3. Nach 12 h unter dem Mikroskop beobachten und nicht befruchtete oder beschädigte Eier entsorgen.
4. Bei 24 hpf das Medium auf ein frisches E3-Medium mit N-Phenylthiourea (PTU, 0,2 nM Endkonzentration) ändern, um die Pigmententwicklung zu verhindern. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 °C, bis die Embryonen für die Mikroinjektion bereit sind.

3. Infektion über bakterielle Mikroinjektion

1. Bereiten Sie Borosilikatglas Mikrokapillar-Injektionsnadeln wie zuvor in Bezug¹³beschrieben.
2. Zebrafisch-Embryonen zur Infektion
   1. Mikrowelle 100 ml von 1% (w/v) und 100 ml 0,5% (w/v) niedrigschmelzende Agarose in einem autoklavierten E3-Medium, bis die Agarose vollständig geschmolzen ist. In 1 ml Aliquot-Rohre aufteilen und bei 4 °C für die zukünftige Verwendung lagern.
   2. Vor Gebrauch die Agarose in einem 95 °C Heizblock erhitzen, bis sie vollständig geschmolzen ist. Bewahren Sie die Agarose in flüssiger Form auf, indem Sie sie in einen 45 °C-Heizblock legen (Abbildung 2).
   3. Montage bei intramuskulären Infektionen im Rumpfbereich
      1. Erstellen Sie die untere Agaroseschicht, indem Sie 0,5 ml 1% (w/v) Agarose gleichmäßig auf eine Glasrutsche gießen. Auf eine Eisbox oder kalte Oberfläche für 3 min legen, um sich zu erstarren.
      2. Anästhetisieren Sie die Zebrafisch-Embryonen (48–72 hpf) in Eiwasser mit Tricain (200 g/ml) und PTU für 5 min vor der Montage. Bis zu 60 Zebrafisch-Embryonen auf die untere Agaroseschicht legen und sorgfältig in zwei Reihen legen (Abbildung 2B).
      3. Entfernen Sie das restliche Wasser auf der unteren Agaroseschicht mit Tissuepapier, bevor Sie 0,3 ml 0,5% (w/v) Agarose hinzufügen, um die obere Schicht zu erstellen. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen vollständig in die Agarose eingebettet sind. Geben Sie die Glasrutsche wieder in die Eisbox zurück, um die Agarose zu erstarren und Eine Austrocknung zu verhindern.
      4. Halten Sie die obere Schicht von Agarose feucht, indem Sie die Oberfläche mit zusätzlichem E3-Eiwasser bedecken.
   4. Montage bei Mittelhirninfektion
      1. Bedecken Sie die Nut eines einzelnen Konkavitätsglasmikroskopieschlittens mit 1% (w/v) Agarose, und übertragen Sie dann die 4–6 Tricain-anesthetisierten Embryonen in die Agarose.
      2. Positionieren Sie den Kopf jedes Embryos vorsichtig mit einer 10 G Nadel nach oben (Abbildung 2C).
      3. Sobald alle Positionen der Embryonen fixiert sind, übertragen Sie die Glasrutsche auf eine Eisbox oder kalte Oberfläche, um die Agarose erstarren zu lassen.
         HINWEIS: Vermeiden Sie die Verdünnung der niedrigschmelzenden Agarose, indem Sie das Volumen des Eiwassertransfers mit den Embryonen minimieren.
3. Bakterienpräparat für Infektionen
   1. Fügen Sie 1 l steril-gefiltertes Phenolrot (10x) zu einem 10-L-Aliquot-Bakterienbestand (in Schritt 1) hinzu und mischen Sie sie kurz.
      HINWEIS: Die Endkonzentration kann mit sterilem PBS eingestellt werden.
   2. Sonicate die Vorbereitung mit 100 W bei 10 s ON, 10 s OFF für 1 min, um alle Klumpen zu brechen, die¹⁴gebildet haben können.
4. Infektion durch Mikroinjektion
   1. Stellen Sie den Mikroinjektor und den Mikromanipulator an die richtige Position und Einstellung für die Mikroinjektion ein, wie zuvor berichtet¹³.
   2. Übertragen Sie 3 l der bakteriellen Präparation mit einem Mikrolader in die vorbereitete Nadel (siehe Schritt 3.1). Pipette langsam und vorsichtig, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
   3. Für die Rumpfregion Infektion, injizieren 100 cfu in den Stammbereich (Abbildung 3A). Vermeiden Sie das Injizieren von Bakterien in den Notochord.
      HINWEIS: Der cfu für die Injektion wird durch die Formel cfu = bakterielle Stoffkonzentration x Verdünnungsfaktor x Injektiontröpfchenvolumen geschätzt. Die eigentliche Cfu wird bestätigt, indem ein Tropfen bakterielles Inokulum auf einer 7H10-Agarplatte plattiert wird, die 10% (v/v) OADC, 0,5% Glycerin und 50 g/ml Hygromycin enthält.
   4. Für die Midbrain-Infektion, injizieren etwa 500 cfu in die Midbrain-Region (Abbildung 3B).
   5. Nach der Mikroinjektion die Zebrafisch-Embryonen vorsichtig mit einer Plastikpipette in frisches Eiwasser spülen.
      HINWEIS: Montieren Sie Embryonen so schnell wie möglich in der Glasbodenschale, um die Beobachtung der sehr frühen angeborenen Immunzellantwort abzudecken.

4. Live Imaging der Infektion

1. Fischbefestigung für Live-Bildgebung
   1. Bis zu 10 tricain-anesthetisierte Embryonen in die Mitte einer Glasunterschale 35 mm übertragen. Entsorgen Sie zusätzliches E3-Medium.
   2. Bedecken Sie die Schale mit 1% niedrigem Schmelzpunkt Agarose und orientieren Sie die Zebrafisch-Embryonen sorgfältig mit einer 10 G Nadel. Inkubieren Sie die Glasbodenschale auf Eis für 10 s, um die Agarose zu erstarren.
      HINWEIS: Bei der Midbrain-Injektion sollten Embryonen in der Agarose mit dem nach oben gerichteten Kopf montiert werden (Abbildung 4A). Für die intramuskuläre Infektion des Rumpfes sollten Embryonen seitlich in der Agarose montiert werden (Abbildung 4B).
   3. Sobald es vollständig verfestigt ist, bedecken Sie die Agarose mit einer Schicht Eiwasser (plus 1 x Tricain und PTU).
2. Dreifarbige hochauflösende Zeitraffer-Konfokalmikroskopie
   HINWEIS: Die folgenden Schritte werden auf einer konfokalen Mikroskopie mit einer 63,0x 1,40 Öl-UV-Objektivlinse betrieben.
   1. Stellen Sie die Temperatur der Umweltkammer auf 28,5 °C ein. Legen Sie etwas nasses Gewebepapier in die Kammer, um Feuchtigkeit zu gewährleisten und die Verdunstung des Eiwassers zu verhindern (Ergänzungsabbildung 1).
   2. Legen Sie die 35 mm Glasbodenschale mit dem Zebrafisch in die Umweltkammer.
   3. Öffnen Sie die konfokale Software, und initialisieren Sie die Bühne. Wechseln Sie zum 63,0 x 1,40 Öl-UV-Objektiv und lokalisieren Sie den Zebrafisch mithilfe des hellen Feldkanals mit einem DIC-Filter (Differential Interference Contrast).
   4. Öffnen Sie den Laser 405 Diode, Argon (20% Leistung) und DPSS 561 nm. Richten Sie die entsprechenden Laserleistungs- und Spektrumeinstellungen ein.
      ANMERKUNG: Die folgenden Spektrumeinstellungen für Cerulean (Erregung = 405 nm; Emission = 456–499 nm), eGFP (Erregung = 488 nm; Emission = 500–550 nm), DsRed2 (Erregung = 561 nm; Emission = 575–645 nm) (Ergänzende Abbildung 2B).
   5. Wählen Sie denErfassungsmodus"XYZ" Sequential Scan " und legen Sie das Bildformat auf "512 x 512 Pixel" (Ergänzende Abbildung 2A) fest.
   6. Wechseln Sie zu "Live Data Mode". Richten Sie die Position des ersten Zebrafisches und markieren Sie die Position "Begin" und "End" Z. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden der verbleibenden Embryonen. EinePausekann am Ende des Programms hinzugefügt werden (Ergänzende Abbildung 2C).
   7. Definieren Sie die Schleife und den Zyklus des Programms.
   8. Speichern Sie die Datei.

5. Einzelzellige UV-Bestrahlung zur Induzieren von Apoptose und Live Imaging

1. Bergfische, wie in Schritt 4.1 beschrieben.
2. Bildgebung der Midbrain-Region von 3 Tagen nach der Befruchtung (dpf) makrophagenspezifischer transgener Tg(mfap4-eGFP) Embryo¹⁵
3. Wählen Sie den Interessenbereich eines einzelnen fluoreszierend markierten Makrophagens und scannen Sie mit einer Geschwindigkeit von 400 Hz und einer UV-Laserleistung von 6 % für 50 s.
   HINWEIS: Scangeschwindigkeit und -zeit sollten basierend auf dem einzelnen Mikroskop optimiert werden. Die Scanzeit sollte optimiert werden, um die umfangreichen DNA-Schäden zu verursachen, die anschließend eine Apoptose der Zielzelle verursachen, aber nicht die gesamte Zelle photobleichen.
4. Wiederholen Sie den obigen Schritt, um weitere Zielzellen zu bestrahlen.
5. Führen Sie eine Zeitraffer-Bildgebung des Mittelhirnbereichs durch, wie in Abschnitt 4 beschrieben.

6. Bildverarbeitung

1. Führen Sie "Maximale Projektion" für die erfassten Bilder durch.
2. Suchen und markieren Sie die XY-Position und -Zeit der Zielzellen unter der Ansicht"Maximale Projektion".
3. Kehren Sie zur Standardansicht zurück, um die Z-Position der Zielzellen zu suchen und zu markieren.
4. Schneiden Sie das einschichtige Bild der Zielzellen zu.
5. Exportieren Sie den Overlay-Kanal und das helle Feld als Videos im AVI-Format.
6. Schneiden Sie den Interessenbereich des Überlagerungskanals und des hellen Feldes in ImageJ zu.
7. Kombinieren Sie die beiden Videos im letzten Schritt vertikal und speichern Sie sie als ein Video im AVI-Format in ImageJ.

Ergebnisse

Mycobacterium-Infektion kann verschiedene Wirtsreaktionen basierend auf den Infektionswegen auslösen. In diesem Protokoll werden Zebrafischembryonen durch intramuskuläre Mikroinjektion fluoreszierender Bakterien in das Mittelhirn oder den Rumpf infiziert (Abbildung 3) und durch konfokale Live-Bildgebung beobachtet. Eine Infektion über diese beiden Routen wird die Infektion lokal einschränken, die angeborene Immunzellrekrutierung und den anschließenden Zelltod verursacht.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Visualisierung des Makrophagensterbens während einer mykobakteriellen Infektion. Basierend auf Faktoren wie der Integrität der Zellmembran kann der infektionsgetriebene Zelltod in Apoptose und lytischen Zelltod^24,25unterteilt werden. Lytischer Zelltod ist für den Organismus stressiger als Apoptose, weil er eine starke Entzündungsreaktion auslöst ^24,25. Die Beobachtung ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Tween-80	Sigma	P1379
10 mL syringe	Solarbio	YA0552
10% OADC	BD	211886
3-aminobenzoic acid	Sigma	E10521
5 μm filter	Mille X	SLSV025LS
50 μl/ml hygromycin	Sangon Biotech	A600230
7H10	BD	262710
7H9	BD	262310
A glass bottom 35 mm dish	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
Agarose	Sangon Biotech	A60015
Confocal microscope	Leica	TCS SP5 II
Enviromental Chamber	Pecon	temp control 37-2 digital
Eppendorf microloader	Eppendorf	No.5242956003
Glass microscope slide	Bioland Scientific LLC	7105P
Glycerol	Sangon Biotech	A100854
Incubator	Keelrein	PH-140(A)
M.marinum			ATCC BAA-535
Microinjection needle	World Precision Instruments	IB100F-4
Microinjector	Eppendorf	Femtojet
Micromanipulator	NARISHIGE	MN-151
msp12:cerulean			Ref.: PMID 25470057; 27760340
Phenol red	Sigma	P3532
PTU	Sigma	P7629
Single concavity glass microscope slide	Sail Brand	7103
Sonicator	SCICNTZ	JY92-IIDN
Spectrophotometer (OD600)	Eppendorf AG	22331 Hamburg
Stereo Microscope	OLYMPUS	SZX10
Tg(mfap4:eGFP)			Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2)			Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)			Ref.: PMID 27424497; 17477879