מוות המוח אינדוקציה עכברים באמצעות לחץ דם פנים עורקים ניטור ואוורור באמצעות קנה מאוזן

Summary

אנו מציגים דגם murine של אינדוקציה מוות המוח על מנת להעריך את ההשפעה של ההשפעות הפתופיזילוגיות שלה על איברים, כמו גם על שתלים רצופים בהקשר של השתלת איברים מוצק.

Abstract

בעוד תרומת החיים והתרומה לאחר מוות הדם לספק הזדמנויות חלופיות השתלת איברים, תרומה לאחר מוות המוח תורם (BD) עדיין מייצג את המקור העיקרי עבור השתלות מוצק. למרבה הצער, אובדן בלתי הפיך של תפקוד המוח ידוע לגרום לשינויים פתופסלוגיים מרובים, כולל הומודינמיקה כמו גם שינויים הורמונליים, לבסוף מוביל תגובה דלקתית מערכתית. מודלים המאפשרים חקירה שיטתית של תופעות אלה vivo הם נדירים. אנו מציגים מודל murine של האינדוקציה BD, אשר יכול לסייע חקירות לתוך ההשפעות ההרסניות של bd על איכות השתלת. לאחר יישום לחץ דם פנים עורקי מדידה דרך העורק הראשי המשותף אוורור אמין באמצעות הקנה הנשימה, BD נגרמת על ידי הגדלת בהתמדה לחץ תוך גולגולתי באמצעות קטטר בלון. ארבע שעות לאחר האינדוקציה BD, איברים יכולים להיות נקצרו לניתוח או להליכי השתלת נוספת. האסטרטגיה שלנו מאפשרת ניתוח מקיף של התורם BD במודל murine, ולכן מאפשר הבנה מעמיקה של השפעות BD הקשורות השתלת איברים מוצק ופוטנציאל לסלול את הדרך כדי אופטימיזציה האיברים הקדם.

Introduction

השתלת כיום הטיפול המרפא היחיד עבור כשל איבר בשלב הסופי. עד עכשיו, מוות מוחי (BD) מטופלים היו המקור העיקרי לתרומות איברים, למרות התרומה החי והתרומה לאחר מוות הדם הן חלופות ערך¹. BD מוגדר על ידי תרדמת בלתי הפיכה (עם סיבה ידועה), העדר רפלקסים גזע המוח דום נשימה². למרבה הצער, איברי BD להפגין תוצאות נחות לטווח ארוך הישרדות השתלת עצמאית של אנטיגן לוקיציט אנושי (HLA)-חוסר התאמה והזמן איסכמי קר³. בינתיים, מחקר אינטנסיבי על גורם זה אנטיגן הסיכון העצמאי בוצע וכתוצאה מכך שלושה היבטים עיקריים של שינויים פתופסלוגיים מתווך כתוצאה של BD: הומודינמיקה, הורמונלי, ו דלקתיות⁴.

עד כה, מודלים BD ניסיוני מכרסמים בוצעו בעיקר באמצעות חולדות. כדי לקבל תובנה גדולה יותר על ההשלכות האימונולוגיים על איברים מוצקים לאחר BD, כיוונו להקים מודל מורטין של BD, כמו כרגע רק מודלים העכבר לאפשר חקירה מקיפה לגורמים גנטיים או אימונולוגיים. בהקשר זה, מערכת העכבר מספקת מגוון רחב יותר של כלים אנליטיים.

עקרון האינדוקציה BD כפי שמתואר כאן מבוסס על עלייה בלחץ תוך גולגולתי הנגרמת על ידי האינפלציה של קטטר בלון מוכנס מתחת לגולגולת. לחץ תוך גולגולתי מוגברת מחקה את המנגנון הפיזיולוגי של BD על ידי חסימת זלוף של המוח, המוח החלק, ואת גזע המוח^5,6. כדי להבטיח שילוב מספיק של איברים היקפיים, מדידת לחץ הדם היא חובה במהלך ההליך. הקטטר המשמש למטרה זו באותו זמן משמש לניהול מלוחים כדי לייצב את לחץ הדם על ידי החלפת נוזלים. כמו BD מלווה בהפסקת נשימה ספונטנית, יש להבטיח אוורור מספיק. שמיכה חשמלית שומרת על טמפרטורת גוף ליבה פיזיולוגית.

לסיכום, מודל זה יאפשר מחקרים מעמיקים לתוך השפעה של פציעה BD המושרה, על הגירה לוקיציט⁷, הפעלת מחמאה⁸, הreperfusion פציעה⁹, וגורמים אחרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לעקרונות של טיפול בעלי חיים במעבדה שגובשה על ידי האגודה הלאומית למחקר רפואי והמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה שהוכנו על ידי האקדמיה הלאומית למדעים ופורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH פרסום No. 86-23, תוקן 1985). כל הניסויים אושרו על ידי משרד החינוך, המדע והתרבות האוסטרית (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).

1. צנתור עורקים

1. הזרק את העכבר בזריקה תוך-בצפק של קטמין ו-xylazine¹⁰ ומשכך כאבים על פי הנוהג המקומי (למשל בופרינורפין).  צבוט את הגפיים האחוריות עם מלקחיים כדי לאשר את העומק הנכון של הרדמה.
   הערה: למחקר זה, עכברים C57BL/6N בגיל 8 עד 12 שבועות שימשו (משקל 20-25 גרם). המחברים בחנו את BALB/c זכר באותו גיל ללא הצלחה, אך לא ניסו זנים אחרים (ראה דיון).
2. הסר את השיער באזורי העניין (ראש, צוואר) באמצעות תער חשמלי. ודא כי לא נותר שיער רופף כדי למנוע זיהום הפצע. לאחר מכן לחטא את השדה כירורגי עם 70% אתנול/כלורהקאדין/betadine ומניחים את העכבר פרקדן עם הראש מול המנתח.
3. לעשות חתך באמצע הצוואר הצווארי עם מספריים מבתר.
4. לנתח את בלוטות הלסת התחתונה ואת רקמת שריר הצוואר ולהפריד אותם כדי לחשוף את עורק הראש המשותף. השתמש בעיקר בניתוח. קהה באמצעות מלקחיים
5. . מקום שלוש 8-0 ליגטורות ממשי. מתחת לעורק הראש המשותף הנכון
6. מניחים מלחציים על הקשירה האבובית ומביאים מתח בעורק כדי שהזרימה תושהה.
7. . תסגור את החיבור המרוחק ביותר
8. הכנס את קטטר העורקים דרך חור עור קטן, שנוצר מראש על ההיבט הגולגולתית של החתך. לסחוט ו עוות לומן של הקטטר אם הוא מופיע גדול מדי כדי להפחית את זרימת הדם. מתקבע עם כל שלושת הליגטורות.
9. מתיקונים את הקטטר לעור כדי למנוע נקע. עשה זאת על ידי שימוש תפר (למשל, 5-0 מונופינט, לא נספגים) אשר מחבר את הקטטר לעור באזור חור העור טרום המבנה.

2. מסדר קנה מאוזן

1. לנתח את השרירים שלפני הקנה. בעזרת מלקחיים
2. . מקום שני 8-0 ליגטורות משי מתחת לקנה הנשימה.
3. קנה מידה באמצעות מספריים מיקרו ככל האפשר כדי למנוע אוורור חד צדדית. השתמש בקו חיתוך אופקי בין שני סחוס הקנה.
4. הכנס את צינור האוורור ואת התיקונים עם הליגטורות המוכנות.
   הערה: הקצה החלק היותר של קנה הנשימה אינו צריך להיות מוקשה.
5. לסגור את העור בתפר מסתובב (למשל, 6-0 מונופינט, לא נספגים).
6. לאוורר את העכבר עם תדר של 150/דקות ואת נפח הגאות של 200 μL.

3. מוות מוחי האינדוקציה

1. לסדר את העכבר על התנוחה נוטה.
2. להסיר את העור מהגולגולת באמצעות מספריים כירורגי מלקחיים להחזיק את העור.
3. מקדחה מקדח בקוטר 1 מ"מ. מעל קליפת הקודקוד השמאלית הפסיקו את הקידוח לפני שפורצים את העצם הקומפקטית הפנימית ואת מאטר דורא.
4. לחדור את גשר הרקמה הסופית של הגולגולת באמצעות מלקחיים קהה, הסרת קצוות חדים.
5. הכנס את קטטר הבלון, כך שהוא לגמרי בתוך חלל הגולגולת. ודא שהבלון מתמלא בתמיסת מלח וכל האוויר פונה.
6. התחל באינפלציה ב-~ 0.1 mL/min לאורך תקופה של 10 עד 15 דקות (נפח כולל של 0.8-1.2 mL) בעזרת משאבת מזרק.
   הערה: העכבר יהיה להפגין מיוקלאוס, mydriasis, עוד להתקף פעילות ונשימות נשימות אגונאליות.
7. לבטא את המוח העכבר מת פעם הזנב של העכבר הלך נוקשה והוקם.
   הערה: BD מאושר על ידי שיא מאפיין של לחץ דם ראשוני (רפלקס קושינג), העדר רפלקסים גזע המוח נשימה ספונטנית. בדיקת דום נשימה רגילה יש להימנע במהלך ניסויים, כמו עכברים עלולים להיות מסוגל להפוך את הדם בשל חוסר חמצן.
8. לעצור את האינפלציה של קטטר הבלון.
9. לשים שמיכה הסקה על העכבר כדי למנוע היפותרמיה.

4. במהלך תקופת BD

1. לפקח ולתעד לחץ דם באופן קבוע. להוציא עכברים עם שלב היתר ממושך (מתכוון לחץ עורקי [MAP] < 50 mmHg עבור > 30 דקות).
2. להשרות 0.1 mL של תמיסת מלח כל 30 דקות כדי לייצב את לחץ הדם של העכבר.
   הערה: בסך הכל 0.8 מ ל של תמיסת מלח היה מנוהל כל עכבר במחקר זה.
3. לאחר 4 h של משך BD, הקציר העכבר איברים/רקמות. הוצא את העכבר מהניסוי אם לב העכבר אינו פועם בסוף הניסוי.

5. הליך זה

1. ביצוע שלבים 1.1-3.3.
   הערה: אל תפתחו את העצם הקומפקטית הפנימית. אין להוסיף או לנפח צנתר בלון.
2. הישארו קרוב לעכבר וברציפות להתבונן בחיה. מלקחיים כדי לאשר את העומק. הנכון של ההרדמה החלת תת-עורי הרדמה נוספת (כ 1/2 של מינון ההתחלה) אם העכבר מראה סימנים של התעוררות, אשר, לניסיוננו, קורה בערך אחרי 2-3 h לאחר ההרדמה.
3. החל את אותה כמות של תמיסת מלח ורידי כמו בעכברים BD.
   הערה: העכבר המזויף יקבל חזרה את הנשימה הספונטנית לאחר הפסקת האוורור. העכבר BD לא. בדיקת דום נשימה צריך להתבצע בעת הקמת המודל, אבל במהלך ניסויים יש להימנע בשל לחץ פיזיולוגי מיותרים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מודל ה-BD murine בוצע בהצלחה יותר מ 100 פעמים עם שיעור הצלחה של מעל 90%. בנוסף, השתלת איברים התערבותית של הלב והכליות כבר בוצעה בבטחה⁷.

BD משרה מגוון שינויים פתופסלוגיים שעשויים להיחקר עוד באמצעות מודל זה. כמתואר באיור 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

BD, גורם סיכון לאיכות השתלת בתורמים רב איברים, כרוך שפע של שינויים pathפסולוגיים, אשר ניתן רק מוערך מספיק באמצעות מודלים vivo. שינויים הומודינמיים, סערת cy, שינויים הורמונליים והשפעתם האולטימטיבית על איכות והשתלת איברים לא ניתן לנתח בתוך מבחנה⁴. רוב ההשתלה הבסיסית, כמו גם מחקר אימונ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arterial catheter (BD Neoflon 26G)	BD	391349
Blood Pressure Transducers (APT300)	Harvard Apparatus Inc.	73-3862
Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3	Edwards Lifesciences Corporation	120403F
Forceps	FST	11271-30
Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe	Harvard Apparatus Inc.	55-7020
Ketansol	Graeub	6680110
Micro scissor	FST	15018-10
Needle holder	FST	12060-02
Prolene 5-0	Ethicon	8698H
Pump 11 Elite Infusion Only Single	Harvard Apparatus Inc.	70-4500
Scissor	FST	14075-11
Stereotactic microscope	Olympus	SZX7
Transpore Tape	3M	1527-1
Underpads	Molinea.A	274301
Ventilator for mice (MiniVent Model 845)	Harvard Apparatus Inc.	73-0043
Xylasol	Graeub	7630109