JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.

Abstract

היכולת לשמור על תפקוד תקין וקיפול הפרוטאום (הומיאוסטזיס חלבון) יורדת במהלך ההזדקנות הרגילה, מה שמקל על תחילתן של מספר גדל והולך של מחלות הקשורות לגיל. לדוגמה, חלבונים עם הרחבות פוליגלוטמין נוטים לצבירה, כפי שמדגים את חלבון הנטטין ואת התפרצות במקביל של מחלת הנטינגטון. ההידרדרות הקשורה לגיל של הפרוטאום נחקרה בהרחבה באמצעות אלגנים מהונדסים של Caenorhabditis המבטאים חזרות polyQ הותכו לחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). מודל זה של בעלי חיים מהונדסים מסייע לכימות ישיר של הירידה הקשורה לגיל של הפרוטאום באמצעות הדמיית היווצרות מתקדמת של מוקדי פלורסנט (כלומר, אגרגטים של חלבונים) והתפרצות מאוחרת יותר של פגמים בקטר המתפתחים כתוצאה מקריסת הפרוטאום. יתר על כן, הביטוי של polyQ::YFP transgene יכול להיות מונע על ידי מקדמים ספציפיים לרקמות, המאפשר הערכה של פרוטאוסטזיס על פני רקמות בהקשר של אורגניזם רב תאי שלם. מודל זה נוח מאוד לניתוח גנטי, ובכך מספק גישה לכימות ההזדקנות המשלימה לבדיקות תוחלת חיים. אנו מתארים כיצד למדוד במדויק polyQ::YFP היווצרות מוקדים בתוך נוירונים או שריר דופן הגוף במהלך ההזדקנות, ואת תחילתו של פגמים התנהגותיים הבאים. לאחר מכן, אנו מדגישים כיצד ניתן להתאים גישות אלה לתפוקה גבוהה יותר, ויישומים עתידיים פוטנציאליים באמצעות אסטרטגיות מתפתחות אחרות לניתוח גנטי C. elegans.

Introduction

הומאוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס) מוגדר כיכולת התאית לשמור על תפקוד תקין וקיפול הפרוטאום. האתגר המובנה בפרוטוסטזיס הוא להבטיח שכל החלבונים מקופלים ומתוחזקים כראוי בקונפורמציה מקומית, המוגברת עוד יותר על ידי האופי המגוון של גודל החלבון, הרכב חומצות האמינו, קונפורמציה מבנית, יציבות, מחזור, ביטוי, מידור תת-תאי ושינויים1. Proteostasis נשמר באמצעות פעולה מתואמת של רשת פרוטאוסטטיקה גדולה, המורכבת מכ -2000 חלבונים ייחודיים, המסדירים סינתזה נכונה, קיפול, סחר והשפלה בתוך הפרוטאום2,3. רכיבי סוס העבודה של הרשת הפרוטאוסטאטית הם תשע משפחות עיקריות שלמלווים מולקולריים 4. כל רקמה וסוג תא מעדיף להשתמש בתת-קבוצות ספציפיות של מלווים מולקולריים, ככל הנראה בקנה אחד עם הדרישות השונות של פרוטאומים נפרדים5.

סימן היכר אחד של הזדקנות אורגניזמית נורמלית הוא הירידה המתקדמת והתמוטטות הפרוטאוסטזיס התאי, אשר נחשב כבסיס להתפרצות והתקדמות של מספר גדל והולך של מחלות הקשורות לגיל. לדוגמה, מחלת אלצהיימר, פרקינסון, מחלת הנטינגטון וטרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) חולקות מאפיין משותף: בכל מקרה ביטוי של ניוון עצבי מונע על ידי שינויים גנטיים הנטיות חלבון מוטנטי לצבירה (עמילואיד-β/טאו, α-סינוקלין, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, בהתאמה)6,7,8,9,10 . במהלך ההזדקנות, השלמות וחוסר ההגבלות של הרשת הפרוטאוסטקטית יורדת, מה שגורם להצטברות של אגרגטים פרוטאוטוקסיים הגורמים לתפקוד לקוי של התאים ולדגנרציה עצבית. ראוי לציין, מחלות קונפורמציה חלבון אינם ייחודיים נוירונים, להתרחש על פני רקמות מרובות, כפי מודגש על ידי סוכרת מסוג II, מיאלומה נפוצה, סיסטיק פיברוזיס11,12,13,14. לכן, מנגנונים מובהרים המסוגלים לשמר פרוטאוסטזיס יקלו על פיתוח התערבויות ממוקדות לטיפול במחלות ולקדם הזדקנות בריאה.

אלגנס האדמה הקטנה Nematode Caenorhabditis (C. elegans) סייעה בגילוי גנים ובמסלולים מבהירים המשנים פרוטאוסטזיס. רכיבים רבים של הרשת הפרוטאוסטקטית ומסלולי התמרת האות המווסתים את הפרוטאוסטזיס נשמרים מבחינה אבולוציונית. יתר על כן, C. elegans הפחיתה את המורכבות והיתירות ביחס למערכות בעלי חוליות, מה שהופך אותה למקובלת יותר לניתוח גנטי ולגילוי גנים. יתרונות נוספים של C. elegans שהובילו אותו להיות בשימוש נרחב כמערכת מודל לחקר פרוטאוסטזיס כוללים: גנומיקה גנטית ותפקודית רבת עוצמה, מחזור חיים קצר (3 ימים) ותוחלת חיים (3 שבועות), גנום קומפקטי ומובהר היטב, הזמינות של מגוון רחב של מוטציות גנטיות, ואת הקלות של הדמיית שינויים ספציפיים לרקמות בביולוגיה של התא באמצעות כתבים פלואורסצנטיים.

ניתן לכמת בקלות את הריקבון המתקדם של פרוטאוסטזיס במהלך ההזדקנות ב- C. elegans. מעבדת מורימוטו הוכיחה לראשונה כי הרחבת פוליגלוטמין התמזגה לחלבון פלואורסצנטי צהוב (polyQ::YFP) יכולה לשמש לכימות ירידה פרוטאוסטקטית ב- C. elegans במהלך הזדקנות15,16,17,18. היתוך YFP ל-35 חזרות על גלוטמין או יותר גורמות להיווצרות הקשורה לגיל של מוקדי פלורסנט יחד עם סימנים לפתולוגיה תאית. ראוי לציין, טווח זה של הרחבת גלוטמין משקף את אורך מערכת הפוליגלוטמין של חלבון הנטינגטון שבו הפתולוגיה של מחלת הנטינגטון מתחילה להיות נצפתה בבני אדם (בדרך כלל >35 CAG חוזר)19. זנים עם ביטוי של polyQ::YFP בתוך תאים שריריים, מעיים או תאי עצב נוצלו כדי לאשר כי הירידה הקשורה לגיל של פרוטאוסטזיס מתרחשת על פני סוגי תאים ורקמות שונים. ביטוי YFP ספציפי לשרירים (כלומר, unc-54p::Q35::YFP) היה הכתב הספציפי לרקמות הנפוץ ביותר, שכן קל לכמת מוקדי פלורסנט מצטברים בימים הראשונים של הבגרות באמצעות מיקרוסקופ פשוט של ניתוח פלואורסצנטי (איור 1A-1B). בנוסף, בעלי חיים הופכים משותקים במהלך אמצע החיים, כמו פרוטאום בתוך השריר מתמוטט בשל ההשפעה הפרוטאוטוקסית של הכתב (איור 1C). באופן דומה, ניתן לעקוב אחר הירידה הקשורה לגיל בפרוטוסטזיס העצבי (rgef-1p::Q40::YFP) על ידי כימות ישיר של היווצרות מוקדים/צבירה וירידות הקשורות לגיל בכיפופי גוף מתואמים לאחר הצבת בעלי חיים בנוזל (איור 2).

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט על איך למדוד את ההתקדמות תלוית הגיל של הצטברות צבירה חלבון ואת proteotoxicity הקשורים המושרה על ידי הביטוי של פוליגלוטמין חוזר בתוך רקמת נוירונים ושרירים C. elegans. אנו מספקים דוגמאות לתוצאות אופייניות שנוצרו באמצעות זנים ושיטות אלה. יתר על כן, אנו מראים כיצד השתמשנו בשיטות אלה כדי ללמוד רגולציה תמלול של הרשת proteostatic. אנו דנים בדרכים נוספות שבהן ניתן לשלב כתבים אלה בקלות עם ריאגנטים קיימים אחרים או להתאים אותם למסכים גדולים יותר.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים

  1. בחר גנים מעניינים להיות מומת באמצעות RNAi מבוסס האכלה. רכישת מניות של HT115 E. coli המכיל את שיבוט RNAi של ריבית20. לחלופין, תת-תבודד את ה-CDNA של הגן המעניין לאתר הרב-תכליתי של הפלסמיד L4440.
    הערה: כדי למנוע השפלה של dsRNA בתוך החיידקים, השתמש בזן HT115. זהו זן E. coli חסר RNase III עם פעילות פולימראז T7 בלתי ניתנת לניתון IPTG. עבור מחקרי פרוטאוסטזיס שאינם משתמשים RNAi מבוסס האכלה, ניתן להשתמש HT115 או OP50 E. coli על לוחות NGM סטנדרטיים.
  2. הכן 5 x 6 ס"מ לוחות לכל מצב בדיקה. לניסויים באמצעות RNAi, לגרום לייצור dsRNA ב HT115 E. coliהשתנה . עבור מחקרים ללא RNAi, OP50 E. coli על צלחות NGM סטנדרטיות (ראה קובץ משלים 1 עבור מתכונים סטנדרטיים NGM ו RNAi צלחת).
    הערה: צלחות RNAi ניתן לאחסן ב 4 °C (75 °F) במשך כמה חודשים לפני זריעה עם חיידקים.
  3. לגדל תרבויות של E. coli לילה (16-20 שעות) ב 37 °C (50 °F) באינקובטור רועד ב 220 סל"ד. לגדל HT115 E. coli במרק לוריא (LB) עם אמפצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל).
    הערה: OP50 E. coli סטנדרטי אינו עמיד לאנטיביוטיקה, אבל גרסאות עמידות סטרפטומיצין זמינים גם.
    1. מרכזים חיידקים על ידי צנטריפוגה ב-2,400 x גרם למשך 15-20 דקות בצנטריפוגה על ספסל, שואפים את הסופרנט, ומשהים מחדש את הכדור ב-1/10מהנפח ההתחלתי (כלומר, ריכוז של פי 10) של LB עם אמפיצלין ל-HT115, או LB ללא אמפצילין ל-OP50 סטנדרטי.
    2. Aliquot 200 μL של חיידקים מרוכזים 10x לכל צלחת (3-4 משכפלים לכל מצב בדיקה, עם 2 לוחות גיבוי נוספים, לשימוש במקרה של זיהום).
    3. אפשרו ללוחות פתוחים להתייבש בסביבה נקייה כמו ספסל זרימה למינארי עד שכל הנוזל נספג או אפשרו לצלחות מכוסות להתייבש על ספסל מעבדה למשך הלילה.
  4. לצלחות RNAi זרעים מיובשות בברדס, יש לאחסן צלחות מיובשות בתוך קופסת תולעים למשך הלילה (עד 24 שעות) בטמפרטורת החדר. לאחר יום אחד ב RT, צלחות ניתן לאחסן ב 4 °C (4 °F) עד 2 שבועות בשקית אטומה (כדי למנוע צלחות להתייבש). לפני השימוש, אפשר לוחות המאוחסנים ב 4 °C (5 °F) לחזור לטמפרטורת החדר בתוך שקית רוכסן נעילה כדי למנוע עיבוי מלהכניס מזהמים פטרייתיים מוטסים.
    1. בעת שימוש RNAi מבוסס האכלה, להשאיר HT115 חיידקים זרעים על לוחות RNAi בטמפרטורת החדר לפחות 12 שעות לפני הוספת C. elegans. לוחות RNAi מכילים IPTG, אשר מהווה ייצור dsRNA. לחלופין, ניתן להוסיף את IPTG לתרבויות הנוזליות בסוף שלב 1.3.1, שעתיים לפני זריעה.
    2. הימנע אחסון לטווח ארוך של צלחות HT115 זרעים בטמפרטורת החדר (יותר מכמה ימים) כדי למנוע פיצוח של אגר שיגרום C. elegans להתחפר לתוך אגר.

2. סנכרון של ג' אלגנס

הערה: בחר אם לסנכרן C. elegans על ידי טיפול hypochlorite אלקליין של מבוגרים gravid או להטיל ביצים.

  1. סנכרן בעלי חיים על ידי טיפול hypochlorite של בעלי חיים בוגרים gravid כדי לקדם את שחרורו של עוברים22.
    1. לטיפול היפוכלוריט, לשטוף הרמפרודיטים gravid 2 פעמים עם חוצץ M9, ולאחר מכן resuspend בתמיסה היפוכלוריט 5 מ"ל (3.25 מ"ל של פתרון hypochlorite, 1 מ"ל של חיץ M9 ו 0.75 מ"ל של 5 M NaOH) במשך 5 דקות, רועד בעלי חיים resuspended בכל דקה. לאחר 5 דקות, לסובב את בעלי החיים לשטוף 3 פעמים עם חוצץ M9.
      הערה: טיפול היפוכלוריט כבר הניח להשפיע על פרוטאוסטזיס21.
    2. לאחר טיפול היפוכלוריט, לאפשר לעוברים לבקוע לילה ב 3 מ"ל של פתרון M9 עם סיבוב ב 20 °C (50 °F).
    3. לחשב את הצפיפות של בעלי חיים L1 (או לחילופין, עוברים) לכל μL על ידי הפלת 10 μL של פתרון L1 3x על צלחת 6 ס"מ וספירת מספר בעלי חיים L1 כדי לחשב את המספר הממוצע של בעלי חיים L1 לכל μL. בעלי חיים L1 יתיישבו לאורך זמן. לכן, מעת לעת לערבב פתרונות L1 כדי למנוע התיישבות.
    4. זרע 50 L1 בעלי חיים לכל צלחת, לספור ולתעד את המספר זרעים, ולהעביר צלחות לחממה 20 °C .. חשוב לדעת את המספר האמיתי של בעלי חיים על כל צלחת בתחילת ההסתה.
      הערה: סנכרון בעלי חיים L1 על ידי בקיעה לילה ב- M9 משמש באופן שגרתי כפי שהוא ממזער את ההטרוגניות ההתפתחותית לאחר הצבת בעלי חיים על מזון. עם זאת, סנכרון מתרחש באמצעות מעצר התפתחותי בתגובה רמזי רעב, אשר עבור מחקרים מסוימים יש להימנע (ראה23 לדיון נוסף). כחלופה, בעלי חיים מסונכרנים בערך ניתן להשיג באמצעות ביצה להטיל, לראות 2.2.
    5. להקפיא ולאחסן שאריות L1 בעלי חיים בחנקן נוזלי או מקפיא -80 מעלות צלזיוס. בדרך זו נשמרת מדגם של כל זן בזמן ההתקנה הניסיונית, ויוצרת משאב בעל ערך למחקרים עתידיים ולשיפור יכולת הרבייה.
      הערה: ראה קובץ משלים 1 עבור מתכונים פתרון hypochlorite ו- M9.
  2. כדי לסנכרן בעלי חיים באמצעות מטיל ביצים, מניחים 20 בעלי חיים בוגרים צעירים (יום 1 לבגרות) על כל צלחת במשך 4-6 שעות, ומאפשרים להם להטיל ביצים עד שיהיו כ -50 ביצים לצלחת. הסר את כל המבוגרים gravid ולהעביר צלחות עם ביצים לאינקובטור 20 מעלות צלזיוס.
    הערה: יש לסנכרן את בעלי החיים הבוגרים הגרביד ביום הראשון לבגרות. בעלי חיים מבוגרים עשויים להטיל ביצים שנשמרו ברחם, מה שגורם לשחרור ביצים הנמצאות בשלב התפתחותי מתקדם יותר.

3. ייצור צאצאים

הערה: יש לנקוט צעדים כדי למנוע ייצור צאצאים או כדי להפריד את האוכלוסייה ההתחלתית המסונכרנת מהצוות שלהם. מניעת ייצור צאצאים ניתן להשיג כימית עם תוספת של 5-פלואורו-2'-deoxyuridine (FUdR) ללוחות, אשר מתואר כאן. כמה מחקרים דיווחו כי FUdR יכול לשנות פרוטאוסטזיס24,25. גישות חלופיות למניעת ייצור צאצאים נדונים להלן.

  1. הפוך פתרון מלאי 1000x של FUdR על ידי המסת 1 גרם של FUdR לתוך 10 מ"ל של אולטרה-pure H2O. מסנן לעקר את המלאי FUdR עם מסנן 0.2 מיקרומטר ומזרק 10 מ"ל. Aliquot 1 מ"ל של מלאי לתוך צינור סטרילי 1.5 מ"ל. להקפיא ולאחסן ב -20 °C (50 °F).
  2. לגדל בעלי חיים ב 20 °C (50 °F) עד שלב L4. N2 בעלי חיים שגדלו מ L1s מסונכרן מטיפול היפוכלוריט דורשים כ 40 שעות של צמיחה ב 20 °C (50 °F) כדי להגיע L4. שיעורי הצמיחה של זנים אחרים צריכים להיבדק אמפירית לפני הניסויים. לפרטים על איך מדויק שלב C. elegans ראה26.
    1. לכל צלחת 6 ס"מ עם בעלי חיים L4, להוסיף 100 μL של FUdR 80x. זה קריטי להוסיף FUdR בשלב L4.
  3. מחזירים צלחות לקופסת תולעים ומניחים את הקופסה בשקית עם רוכסן. חזור לאינקובטור המתאים.

4. מדידת הירידה בפרוטוסטזיס ברקמת השריר באמצעות בעלי חיים המביעים פוליגלוטמין

הערה: ניתן להשתמש בשתי שיטות כדי לזהות ירידה בפרוטוסטזיס בתאי השריר: הדמיית היווצרות של אגרגטים חלבון במהלך ההזדקנות (4.1) ומדידת הפרוטאוטוקסיות שארגרגטים אלה גורמים עם הגיל באמצעות תחילת השיתוק (4.2).

  1. הדמיית היווצרות צבירה פוליגלוטמין בשריר במהלך ההזדקנות
    הערה: ההתקדמות תלוית הגיל של צבירת חלבונים בתאי השריר מצולמת באמצעות פוליגלוטמין (polyQ) חוזרת ומותכת לחלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). פרוטוקול זה מתאר את השימוש בזן AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP], אך ניתן להשתמש גם בזני וריאנט פוליגלוטמין אחרים. ה- polyQ::YFP transgene מתבטא בשריר באמצעות מקדם unc-54 ספציפי לשרירים. מסונכרן unc-54p::p olyQ::YFP ביטוי בעלי חיים דמיינו ביום 1, 2, 3 ו 4 של הבגרות. כדי לדמיין צבירה של UNC-54p::p olyQ::YFP מצטברת, השתמש במיקרוסקופ מורכב המצויד לפלואורסצנטיות או במיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי. AM140 זמין מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC) ב: https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
    1. בימי הדמיה (יום 1, 2, 3 ו -4 של בגרות), לבחור 20 בעלי חיים ולהרכיב על הגדרת שקופית מיקרוסקופ עם כרית אגרוז 3% ו 5 μL טיפה של 10 mM נתרן אזיד (מדולל במאגר M9).
    2. לאחר שכל בעלי החיים משותקים על ידי נתרן אזיד (~ 5 דקות), צלם את כל גופם של בעלי החיים באמצעות עדשת הגדלה פי 10 (איור 1A). להדמיה, השתמש במסנן FITC ובאותה חשיפה לכל בעל חיים. מחק שקופיות לאחר ההדמיה.
      הערה: לחלופין, מוקדי YFP יכולים גם להיות כימתו ישירות על לוחות, אבל התנועה חייבת להיות מעוכבת על ידי החלת זרם של פחמן דו חמצני על הצלחת תוך ניקוד. שיטה חלופית זו מתאימה ביותר בעת סינון מספר רב של תנאים (ראה דיון לקבלת פרטים נוספים).
    3. לאחר רכישת תמונות, לספור את מספר המוקדים בשרירי דופן הגוף של החיה כולה. המוקדים הם אותות מנוקבים בהירים יותר שניתן להבדיל בין האות המסיס בעמעום ברקע.
    4. התווה את ההתקדמות של הצטברות מוקדי YFP מימים 1, 2, 3 ו -4. התווה גרף XY שבו X מייצג ימי בגרות ו- Y מייצג את מספר unc-54p::p olyQ::מוקדי YFP (איור 1B). מספר המוקדים במצב הניסיוני (למשל, הפחתת גנים או ביטוי יתר) מושווה לבעלי חיים שולטים. בצע ניתוח סטטיסטי בין הקבוצות בכל נקודת זמן שנצפתה עבור כל ניסוי.
      1. בעת השוואת ספירת מוקדים עבור שני תנאים בלבד, בצע בדיקת t מדגם עצמאית בכל נקודת זמן.
      2. בעת השוואת ספירת מוקדים עבור יותר משני תנאים, בצע ניתוח ANOVA omnibus בכיוון אחד עבור כל נקודת זמן, כולל הנתונים עבור כל התנאים בנקודת זמן זו. אם omnibus ANOVA מניב ערך p משמעותי (כלומר, p < 0.005), בצע ניתוח שלאחר הוק עם בדיקות t מדגם עצמאיות זוג כדי לקבוע את התנאים הספציפיים שביניהם זוהה הבדל משמעותי במוקדים (לדוגמה, עבור קבוצות A, B ו- C להשוות A &, A & C, ו- B & C).
  2. מדידת שיעורי שיתוק בעלי חיים כפונדקאית לרעילות פוליגלוטמין בתאי שריר
    הערה: העלייה תלוית הגיל של אגרגטים polyQ בשריר גורמת לירידה בתפקוד השרירים המניעה את הקטר. פגם זה בקטר יכול להיקבע על ידי מדידת קצב השיתוק המתקדם בבעלי חיים המביעים פולי-קיו. לבדיקת השיתוק, סנכרון unc-54p::p olyQ::YFP ביטוי בעלי חיים הם ציון ביום 3, 5, 7 ו 9 של הבגרות. הוסף נקודות זמן נוספות, לפי הצורך כדי להרחיב את טווח הניקוד, כך שתוכל להעריך את ההשפעה של הפרעה גנטית.
    1. בימי הניקוד (יום 3, 5, 7 ו -9 של הבגרות), להסתכל על לוחות 6 ס"מ המכילים 50 בעלי חיים ולתעד את מספר בעלי החיים המשותקים. הסר בעלי חיים משותקים מהצלחת. אם בעלי חיים זחלו מהצלחת, או מתו, יש לצנזר את זה; להקליט את האירוע כך שניתן יהיה להסביר אותו בניתוח.
      הערה: בעל חיים נחשב משותק כאשר לא נצפתה תנועה לאחר חשיפתם לגירויים קלים או עדינים למגע. פעילות שאיבת הלוע משמשת כדי לקבוע אם בעלי חיים שאינם מפחים חיים או מתים.
    2. בסיום הניסוי, לחשב את שיעור השיתוק עבור כל תנאי. לעשות זאת בכל נקודת זמן על ידי חלוקת החלקיק של בעלי חיים משותקים על ידי המספר הכולל של בעלי חיים שנצפו עבור מצב זה באותו זמן. אם אתה מתבונן בלוחות מרובים לכל תנאי לנקודת זמן (כלומר, שכפל לוחות), חשב את היחס בנפרד עבור כל שכפול.
    3. התווה את ההתקדמות של קצב השיתוק בגרף XY (scatterpplot). X מייצג ימי בגרות ו- Y מייצג שיעורי שיתוק. קצב השיתוק של unc-54p::p olyQ::YFP בעלי חיים מושוים לבעלי חיים שליטה(איור 1C). לבצע ניתוח סטטיסטי בין הקבוצות; עבור ניסויים מרובים, לטפל בניסויים באופן עצמאי. השתמש ברגרסיה של קוקס יחסית-סיכונים ומבחן וולד. רוב כלי ניתוח הנתונים התומכים בניתוח הישרדות תומכים גם בדוגמנות קוקס.
      1. שנה את הנתונים: לכל תנאי צריכות להיות שתי עמודות, אחת לזמן, ואחת עבור "אירוע". בכל נקודת זמן שנצפתה, הוסף שורה עם "0" עבור כל חיה משותקת, ו"1" עבור כל חיה מצונזרת. המספר הכולל של שורות צריך להיות שווה למספר בעלי החיים ההתחלתיים על הצלחת עבור מצב זה.
      2. בצע דוגמנות של Cox Proportional-Hazards, ואחריו בדיקת וולד, בהתאם להוראות לתוכנה הסטטיסטית שלך. מודל חד-ivariate יתאים לתכנוני ניסויים טיפוסיים. עבור יותר משני תנאים, אם בדיקה עם כל התנאים הכלולים מצביעה על תוצאה משמעותית (כלומר, p < 0.005), ניתן לבצע בדיקות זוג בין התנאים כדי לקבוע את הזוגות המשמעותיים הספציפיים של התנאים.
        הערה: מודל קוקס מסתמך על הנחה שתנאי הבדיקה מווסתים את ההסתברות לאירוע באופן יחסי לאורך זמן. משמעות הדבר היא, למשל, כי מודל קוקס לא יהיה מתאים להשוואת מצב שבו רוב בעלי החיים משותקים ביום 1 למצב שבו רוב בעלי החיים משותקים ביום 9. הרחבות של מודל קוקס, וגישות אחרות להשוואת פרופורציות משותקות בכל נקודת זמן, זמינות במקרים שבהם הנחת הסיכונים היחסית אינה מחזיקה מעמד, ראה27,28,29,30.

5. מדידת הירידה בפרוטוסטזיס ברקמה העצבית באמצעות פוליגלוטמין המבטא בעלי חיים.

הערה: שתי שיטות משלימות משמשות כדי לעצור את הירידה proteostasis נוירונים (1) על ידי כימות היווצרות של אגרגטים חלבון (מוקדי פלורסנט) במהלך ההזדקנות ו -(2) על ידי מדידת ירידה הקשורות לגיל בפרוטום העצבי באמצעות מבחן מבוסס תנועה.

  1. הדמיית היווצרות צבירה פוליגלוטמין בתאי העצב במהלך ההזדקנות
    הערה: בדומה לאדיקה שכבר נדונו ברקמת השריר, ההתקדמות תלוית הגיל של צבירת חלבונים בתאי העצב מצולמת על ידי הבעת חלבון היתוך YFP המונע על ידי המקדם הספציפי לרקמה פאן-עצבית של rgef-1. באופן ספציפי אנו משתמשים AM101: rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP], היתוך גלוטמין ארבעים ל YFP16. כדי לדמיין את rgef-1p::p olyQ::YFP, השתמש במיקרוסקופ מורכב המצויד לפלורסצנטיות עם עדשת הגדלה של פי 40. AM101 זמין מ- CGC ב: https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
    1. בימי הדמיה (יום 4, 6, 8 ו -10 של בגרות), לבחור 20 בעלי חיים ולהרכיב על שקופית מיקרוסקופ המכיל כרית אגרוז 3% עם 5 μL טיפה של 10 mM נתרן אזיד (מדולל במאגר M9).
    2. אחרי כל בעלי החיים משותקים על ידי נתרן אזיד (~ 5 דקות), לקחת z-מחסנית תמונות של הראש של בעלי החיים באמצעות עדשת הגדלה פי 40 (איור 2A). מחק שקופיות לאחר ההדמיה.
    3. לאחר רכישת תמונות, תהליך z-ערימות כדי להשיג את ההקרנה המרבית ולהשתמש כדי לכמת את מספר המוקדים בתאי עצב הממוקמים על אזור טבעת העצבים. המוקדים הם אותות מנוקבים בהירים יותר שניתן להבדיל בין האות המסיס בעמעום ברקע.
      הערה: בחרנו באופן ספציפי את אזור טבעת העצבים כדי לכמת rgef-1p::p olyQ::YFP מצטבר מכיוון שזה האזור שבו רוב הנוירונים מתכנסים כדי ליצור קשרים סינפטיים. עם זאת, על מנת למדוד את רמות היווצרות המצרפית בתאי עצב מוטוריים, ניתן לכמת rgef-1p::p olyQ::YFP אגרגטים הממוקמים על חוט העצבים הגבי או הגחוני ניתן לכמת.
    4. התווה את ההתקדמות של הצטברות מוקדי YFP מ- D4, D6, D8 ו- D10. עשה זאת בגרף XY שבו X מייצג ימי בגרות ו- Y מייצג את מספר rgef-1p::p olyQ::YFP מוקדים (איור 2B). מספר המוקדים במצב הניסיוני (למשל, הפחתת גנים או ביטוי יתר) מושווה לבעלי חיים שולטים. ניתוח סטטיסטי של ספירת מוקדים עבור נוירונים נעשה באותו אופן כמו עבור שריר polyQ מוקדים; ראה שלבים 4.1.4 וההשטרות המשויכים.
  2. מדידת כיפופי הגוף כמדד פונדקאי של פרוטאוטוקסיות פוליגלוטמין בנוירונים.
    הערה: הלחץ הפרוטאוטוקסי המושרה מהצטברות מצטברת מתקדמת של פוליQ עצבי נקבע על ידי התבוננות פגמים נוירון מוטורי באמצעות בדיקת חבטות. לכמת את מספר כיפופי הגוף בפרק זמן של 30 שניות בזמן שהוא מושעה במאגר הפיזיולוגי M9(קובץ משלים 1).
    1. ביום 2 לבגרות, בחר 10 בעלי חיים מסונכרנים מהצלחת והנח על טיפה של 10 μL של חוצץ M9 במגלשת מיקרוסקופ. חזור על שלב זה לפחות ארבע פעמים כדי לקבל מדגם של 40 בעלי חיים או יותר.
    2. וידאו להקליט את התנועה של 10 בעלי חיים להציב על שקופית מיקרוסקופ עם 10 μL של חוצץ M9 לתקופה של 30 s על סטריאומיקוסקופ עם מצלמה מסוגל וידאו. חזור על שלב זה 4 פעמים עבור מספר מדגם כולל של 40. יש להתאים את הזום והמיקום כך שכל בעלי החיים יהיו גלויים במסגרת למשך 30 השניות המלאות.
    3. לאחר כל קטעי וידאו עם בעלי החיים להיות מנותח מוקלטים, להפעיל את הווידאו ולהבקיע את כיפופי הגוף של כל חיה. כיפוף גוף אחד מוגדר כמו כאשר הפות של החיה הולך מצד אחד להיפך וכל הדרך חזרה למצב ההתחלה.
      הערה: אנו מוצאים חיות סוג בר בדרך כלל יש 49 ± 0.79 כיפופי גוף ב 30 שניות.
    4. התווה את מספר כיפופי הגוף עבור כל חיה בגרף עמודות שבו כל נקודה מייצגת את מספר כיפופי הגוף ב- 30 s (ציר Y) עם התנאים השונים שנבדקו על ציר X. מספר כיפופי הגוף של unc-54p::p olyQ::YFP בעלי חיים מושוות לבעלי חיים שליטה(איור 2C). לבצע ניתוח סטטיסטי בין הקבוצות באופן עצמאי עבור כל ניסוי; אם ההסתערות חוזרת על עצמה במספר נקודות זמן, נתח את הנתונים באופן עצמאי עבור כל נקודת זמן.
      1. כאשר שוקלים רק שני תנאים, בצע בדיקת t מדגם עצמאי.
      2. כאשר שוקלים יותר משני תנאים בו זמנית, בצע תחילה ניתוח ANOVA בכיוון אחד של omnibus, כולל הנתונים עבור כל התנאים באותה נקודת ניסיון / זמן. אם omnibus ANOVA מניב ערך p משמעותי (כלומר, p < 0.005), בצע ניתוח שלאחר הוק עם t-tests מדגם עצמאי pairwise כדי לקבוע את התנאים הספציפיים שביניהם התגלה הבדל משמעותי בספירת כיפוף הגוף.

תוצאות

ב C. elegans, מודל חוזר פוליגלוטמין כבר אינסטרומנטלי לזיהוי של גנים המסדירים את הרשת הפרוטאוסטלית. לדוגמה, הראינו בעבר כי הומיודומיין אינטראקציה חלבון קינאז (HPK-1),קופקטור תמלול, משפיע על פרוטאוסטזיס במהלך ההזדקנות על ידי ויסות הביטוי של autophagy ומלוויםמולקולריים 31. מצאנו כ...

Discussion

ההזדקנות מאופיינת בירידה הדרגתית בפרוטוסטזיס. פרוטאוסטזיס מתוחזקת על ידי מערכת מורכבת, הרשת הפרוטאוסטקטית, לשליטה מתואמת, דינמית, מגיבה ללחץ של קיפול חלבונים, השפלה ותרגום. מדוע פרוטאוסטזיס נכשל במהלך ההזדקנות אינו מובן היטב, אך אפיגנום מתפורר, ירידה בזינוק בתגובות הלחץ, ואובדן צליבה מפצ...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לחברי מעבדת סמואלסון בעבר ובהווה על עזרתם בחידוד שיטה זו ו/או דיון שסייעו בפיתוח כתב יד זה. מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי להזדקנות המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרס RF1AG062593 ו- R21AG064519. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24 Well Culture PlatesGreiner Bio-One#662102
2 mL 96-well platesGreiner Bio-One#780286
600 µL 96-well platesGreiner Bio-One#786261
96-pin plate replicatorNunc250520
Air-permeable plate sealVWR60941-086
bacteriological agarAffymetrix/USB10906
bacto-peptoneVWR90000-368
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- AhringerSource BioscienceC. elegans RNAi Collection (Ahringer)See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)Alfa AesarL16497
Glass microscope cover slipsVWR48404-455
Glass microscope slidesVWR160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)Gold Bio12481C100
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mmThermo-Fisher242811
Sodium Azide, CAS #26628-22-8Sigma-AldrichS2002
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 softwareZeissunknown
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscopeZeissunknown

References

  1. Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
  2. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  3. Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
  4. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  5. Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
  6. Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
  7. Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
  8. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
  9. Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
  10. Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
  11. Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
  12. Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
  13. Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
  14. Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
  15. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  16. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  17. Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
  18. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
  19. Walker, F. O. Huntington's disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
  20. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
  21. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  23. Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
  24. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
  26. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  27. Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
  28. Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
  29. Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
  30. Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell's recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
  31. Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
  32. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
  33. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  35. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  36. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  37. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  38. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
  39. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
  40. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
  41. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
  42. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  43. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  44. Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
  45. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  46. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

175YPCC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved