JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Özet

Proteonun (protein homeostazı) uygun işlevini ve katlamasını sürdürme yeteneği normal yaşlanma sırasında azalır ve yaşla ilişkili hastalıkların giderek artan sayıda başlangıcını kolaylaştırır. Örneğin, poliglutamin genleşmelerine sahip proteinler, huntingtin proteini ve Huntington hastalığının eşlik eden başlangıcı ile örneklendirilir. Proteonun yaşa bağlı bozulması, sarı floresan proteine (YFP) kaynaşmış poliQ tekrarlarını ifade eden transgenik Caenorhabditis elegans kullanımı ile yaygın olarak incelenmiştir. Bu poliQ::YFP transgenik hayvan modeli, floresan odakların (yani protein agregalarının) ilerleyici oluşumunu ve daha sonra proteomin çökmesi sonucu gelişen lokomotion kusurlarının başlangıcını görüntüleme yoluyla proteomin yaşa bağlı düşüşünün doğrudan nicelemesini kolaylaştırır. Ayrıca, polyQ::YFP transgene ekspresyosu dokuya özgü promotörler tarafından yönlendirilebilir ve proteostazın sağlam çok hücreli bir organizma bağlamında dokular arasında değerlendirilmesini sağlar. Bu model genetik analize son derece elverişlidir, böylece yaşam süresi testlerini tamamlayıcı olan yaşlanmayı ölçmek için bir yaklaşım sağlar. Yaşlanma sırasında nöronlar veya vücut duvar kası içindeki poliQ::YFP odak oluşumunun ve daha sonra davranış kusurlarının başlangıcının nasıl doğru bir şekilde ölçüldüklerini açıklıyoruz. Daha sonra, bu yaklaşımların C. elegans genetik analizi için diğer gelişmekte olan stratejileri kullanarak daha yüksek verim ve gelecekteki potansiyel uygulamalar için nasıl uyarlanabilebileceğini vurguluyoruz.

Giriş

Protein homeostazı (proteostaz), proteomun düzgün çalışmasını ve kat katlamasını sağlamak için hücresel yetenek olarak tanımlanır. Proteostazın doğasında var olan zorluk, tüm proteinlerin protein boyutunun çeşitli doğası, amino asit bileşimi, yapısal konformasyon, stabilite, ciro, ifade, hücresel altı bölümlere ayırma ve değişikliklerle daha da güçlendirilen yerel bir konformasyonda düzgün bir şekilde katlanmasını ve korunmasını sağlamaktır1. Proteostaz, proteom 2,3içinde uygun sentezi, katlamayı, kaçakçılığı ve bozulmayı düzenleyen yaklaşık 2000 benzersiz proteinden oluşan büyük bir proteostatik ağın koordineli etkisi ile sürdürülür. Proteostatik ağın iş atı bileşenleri moleküler refakatçilerin dokuz ana ailesidir4. Her doku ve hücre tipi tercihen moleküler refakatçilerin belirli alt kümelerini kullanır, muhtemelen farklı proteomların farklı talepleri ile uyumlu olarak5.

Normal organizmasal yaşlanmanın ayırt edici özelliklerinden biri, giderek artan sayıda yaşa bağlı hastalığın başlangıcı ve ilerlemesi için temel olduğu düşünülen hücresel proteostazın ilerleyici düşüşü ve çökmesidir. Örneğin, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Huntington hastalığı ve Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) ortak bir özelliği paylaşmaktadır: her durumda nörodejenerasyonun tezahürü, mutant bir proteini toplama (amiloid-β / Tau, α-synuclein, HTT, FUS/TBD-43/SOD-1, sırasıyla)6,7,8,9,10 . Yaşlanma sırasında, proteostatik ağın bütünlüğü ve indükbilitesi azalır, bu da hücresel işlev bozukluğu ve nörodejenerasyon ile sonuçlanan proteotoksik agregaların birikmesiyle sonuçlanır. Not olarak, protein konformasyonel hastalıklar nöronlara özgü değildir ve tip II diyabet, multipl miyelom ve kistik fibrozis11 , 12 , 13,14ile vurgulandığı gibi birden fazla dokuda görülür. Bu nedenle, proteostazları koruyabilen elucidating mekanizmaları, hastalığın tedavisi için hedefe yönelik müdahalelerin geliştirilmesini ve sağlıklı yaşlanmayı teşvik edecektir.

Küçük toprak nematod Caenorhabditis elegans (C. elegans) genlerin keşfedilmesinde ve proteostazı değiştiren yolların aydınlatıcı yollarında etkili olmuştur. Proteostatik ağın birçok bileşeni ve proteostazı düzenleyen sinyal transdüksiyon yolları evrimsel olarak korunur. Ayrıca, C. elegans omurgalı sistemlere göre karmaşıklığı ve artıklığı azaltarak genetik analiz ve gen keşfine daha uygun hale getirmiştir. C. elegans'ın proteostaz çalışması için bir model sistemi olarak yaygın olarak kullanılmasına yol açan ek avantajları şunlardır: güçlü genetik ve fonksiyonel genomik, kısa bir yaşam döngüsü (3 gün) ve ömür (3 hafta), kompakt ve iyi açıklamalı bir genom, geniş bir genetik mutant yelpazesinin mevcudiyeti ve floresan muhabirleri kullanarak hücre biyolojisinde dokuya özgü değişiklikleri görselleştirme kolaylığı.

Yaşlanma sırasında proteostazın ilerleyici bozunması C. elegans'ta kolayca ölçülebilir. Morimoto laboratuvarı ilk olarak, sarı floresan proteine (polyQ::YFP)kaynaşmış bir poliglutamin genişlemesinin, yaşlanma sırasında C. elegans'taki proteostatik düşüşü ölçmek için kullanılabileceğini göstermiştir15,16,17,18. 35 glutamin tekrarı veya daha fazlasına YFP füzyonları, hücresel patoloji belirtileri ile birlikte floresan odakların yaşa bağlı bir oluşumuna neden sonuçlanır. Not olarak, bu glutamin genişlemesi aralığı, Huntington Hastalığı patolojisinin insanlarda gözlenmeye başladığı Huntingtin proteininin poliglutamin kanalının uzunluğunu yansıtır (tipik olarak >35 CAG tekrar eder)19. Kas, bağırsak veya nöronal hücrelerde poliQ::YFP ekspresyürü ile suşlar, proteostazın yaşa bağlı düşüşünün farklı hücre ve doku tiplerinde meydana geldiğini doğrulamak için kullanılmıştır. Kaslara özgü poliQ::YFP ekspresyifi (örneğin, unc-54p::Q35::YFP),biriken floresan odakların basit bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak yetişkinliğin ilk birkaç gününde ölçülmesi kolay olduğu için en yaygın kullanılan dokuya özgü muhabir olmuştur (Şekil 1A-1B). Ek olarak, hayvanlar orta yaşam sırasında felç olur, çünkü kas içindeki proteom muhabirin proteotoksik etkisi nedeniyle çöker (Şekil 1C). Benzer şekilde, nöronal proteostazdaki yaşa bağlı düşüş (rgef-1p::Q40::YFP) hayvanları sıvıya yerleştirdikten sonra koordineli vücut virajlarındaki odak/agrega oluşumu ve yaşa bağlı düşüşler doğrudan ölçülerek takip edilebilir (Şekil 2).

Burada, protein agrega birikiminin yaşa bağlı ilerlemesinin ve C. elegans'tanöronal ve kas dokusunda poliglutamin tekrarlarının ekspresyonu ile indüklenen ilişkili proteotoksisitenin nasıl ölçülacağı hakkında ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu suşlar ve yöntemler kullanılarak oluşturulan tipik sonuçlara örnekler sunuyoruz. Ayrıca, proteostatik ağın transkripsiyonsal düzenlemesini incelemek için bu yöntemleri nasıl kullandığımızı gösteriyoruz. Bu muhabirlerin mevcut diğer reaktiflerle kolayca entegre edilebilmesinin veya daha büyük ekranlara uyarlanabilmesinin ek yollarını tartışıyoruz.

Protokol

1. Reaktiflerin hazırlanması

  1. Besleme tabanlı RNAi aracılığıyla inaktive edilecek ilgi genlerini seçin. RNAi faiz klonunu içeren HT115 E. coli hisse senetleri20. Alternatif olarak, ilgi geninin cDNA'sını L4440 plazmidinin çok kavunlu bölgesine subklase edin.
    NOT: Bakteri içindeki dsRNA'nın bozulmasını önlemek için HT115 suşu kullanın. Bu, IPTG-indüklen T7 polimeraz aktivitesi ile RNase III eksikliği olan bir E. coli suşudur. Besleme bazlı RNAi kullanmayan proteostaz çalışmaları için standart NGM plakalarında HT115 veya OP50 E. coli kullanılabilir.
  2. Test durumu başına 5 x 6 cm plaka hazırlayın. RNAi kullanan deneyler için, dönüştürülmüş HT115 E. coli'dedsRNA üretimine neden olur. RNAi içermeyen çalışmalar için standart NGM plakaları üzerinde OP50 E. coli kullanılabilir (Standart NGM ve RNAi plaka tarifleri için Ek Dosya 1'e bakın).
    NOT: RNAi plakaları bakterilerle tohumlanmadan önce birkaç ay boyunca 4 °C'de saklanabilir.
  3. E. coli kültürlerini bir gecede (16-20 saat) 37 °C'de 220 rpm'de sallanan bir inkübatörde büyütün. Luria Suyu'nda (LB) AMPİkILLIN (50 μg/mL) ile HT115 E. coli yetiştirin.
    NOT: Standart OP50 E. coli antibiyotiğe dirençli değildir, ancak streptomisin dirençli varyantlar da mevcuttur.
    1. Bakterileri tezgah üstü santrifüjde 15-20 dakika boyunca 2.400 x g'da santrifüjleme ile konsantre edin, süpernatantı epire edin ve peletin başlangıç hacminde (yani 10x konsantrasyonda) HT115 için ampisilinli LB'de veya standart OP50 için ampisilin olmadanLB'de yeniden askıya alın.
    2. Aliquot 200 μL konsantre 10x bakteri her plakaya (3-4, kontaminasyon durumunda kullanılmak üzere 2 ekstra yedek plaka ile test durumu başına çoğalır).
    3. Açık plakaların laminer akış tezgahı gibi temiz bir ortamda tüm sıvı emilene kadar kurumasına izin verin veya kapalı plakaların bir laboratuvar tezgahında bir gecede kurumasına izin verin.
  4. Bir başlıkta kurutulmuş tohumlu RNAi plakaları için, kurumuş tabakları oda sıcaklığında bir gece boyunca (24 saate kadar) bir solucan kutusunda saklayın. RT'de 1 gün kaldıktan sonra, plakalar kapalı bir torbada 2 haftaya kadar 4 °C'de saklanabilir (plakaların kurumasını önlemek için). Kullanmadan önce, 4 °C'de depolanan plakaların, yoğuşmanın havadaki mantar kontaminelerini tanıtmasını önlemek için fermuarlı torba içindeki oda sıcaklığına dönmesine izin verin.
    1. Besleme bazlı RNAi kullanırken, C. elegan eklemeden önce en az 12 saat boyunca RNAi plakalarında tohumlu HT115 bakterilerini bırakın. RNAi plakaları, dsRNA üretimine neden olan IPTG içerir. Alternatif olarak, IPTG, tohumlamadan 2 saat önce, 1.3.1 adımının sonunda sıvı kültürlerine eklenebilir.
    2. C. eleganların ağar içine gömülmesine neden olacak agarın çatlamasını önlemek için tohumlu HT115 plakalarının oda sıcaklığında (birkaç günden fazla) uzun süreli depolanmasını önlayın.

2. C. eleganların senkronizasyonu

NOT: C. elegans'ın gravid yetişkinlerin alkali hipoklorit tedavisi veya yumurta serme ile senkronize edilip edilmeyeceğini seçin.

  1. Embriyoların salınımını teşvik etmek için gravid yetişkin hayvanların hipoklorit tedavisi ile hayvanları senkronize edin22.
    1. Hipoklorit tedavisi için, gravid hermafroditleri M9 tamponu ile 2 kez yıkayın, ardından 5 mL hipoklorit çözeltisinde (3,25 mL hipoklorit çözeltisi, 1 mL M9 tamponu ve 5 M NaOH'un 0,75 mL'si) her dakika resüspended hayvanları sallayarak yeniden yıkayın. 5 dakika sonra hayvanları aşağı çevirin ve M9 tamponu ile 3 kez yıkayın.
      NOT: Hipoklorit tedavisi proteostaz21'ietkileyecek şekilde ortaya almıştır.
    2. Hipoklorit tedavisinden sonra, embriyoların 20 ° C'de dönme ile 3 mL M9 çözeltisinde gece boyunca yumurtadan çıkmasına izin verin.
    3. ΜL başına ortalama L1 hayvanı sayısını hesaplamak için 10 μL L1 çözeltisini 3x 6 cm tabağa bırakarak ve μL başına ortalama L1 hayvanı sayısını hesaplamak için L1 hayvanlarının sayısını sayarak μL başına L1 hayvanlarının (veya alternatif olarak embriyoların) yoğunluğunu hesaplayın. Bu nedenle, yerleşmeyi önlemek için L1 çözeltilerini periyodik olarak karıştırın.
    4. Plaka başına 50 L1 hayvan tohumlayın, tohumlanan sayıyı sayın ve kaydedin ve plakaları 20 °C inkübatöre taşıyın. Tahlil başlangıcında her tabakta gerçek hayvan sayısını bilmek önemlidir.
      NOT: L1 hayvanlarını M9'da gece kuluçkaya yatırarak senkronize etmek, hayvanları yiyeceğe yerleştirdikten sonra gelişimsel heterojenliği en aza indirdiği için rutin olarak kullanılır. Bununla birlikte, senkronizasyon, bazı çalışmalar için kaçınılması gereken açlık ipuçlarına yanıt olarak gelişimsel tutuklama yoluyla gerçekleşir (ek tartışma içinbkz. Alternatif olarak, kabaca senkronize hayvanlar bir yumurta yumurtlama yoluyla elde edilebilir, bkz.
    5. Kalan L1 hayvanlarını sıvı azot veya -80 °C dondurucuda dondurun ve saklayın. Bu şekilde, deneysel kurulum anında her bir suşun bir örneği korunur, gelecekteki çalışmalar için değerli bir kaynak oluşturulur ve tekrarlanabilirliği artırır.
      NOT: Hipoklorit ve M9 çözüm tarifleri için Ek Dosya 1'e bakın.
  2. Hayvanları yumurta bırakma yoluyla senkronize etmek için, her tabağa 4-6 saat boyunca 20 genç gravid yetişkin hayvan (yetişkinliğin 1. günü) yerleştirin ve tabak başına yaklaşık 50 yumurta olana kadar yumurta bırakmalarına izin verin. Tüm gravid yetişkinleri çıkarın ve yumurtalı tabakları 20 ° C inkübatöre taşıyın.
    NOT: Gravid yetişkin hayvanlar yetişkinliğin ilk gününde senkronize edilmelidir. Yaşlı hayvanlar rahimde tutulan yumurtaları bırakabilir ve daha ileri bir gelişim aşamasında olan yumurtaların salınmalarına neden olabilir.

3. Soy üretimi

NOT: Soy üretimini önlemek veya eşitlenmiş başlangıç popülasyonu soylarından ayırmak için adımlar atılmalıdır. Burada açıklanan plakalara 5-Floro-2'-deoksiroridin (FUdR) ilavesi ile soy üretiminin önlenmesi kimyasal olarak sağlanabilir. Bazı çalışmalar FUdR'nin proteostaz24 , 25'i değiştirebileceğinibildirmiştir. Soy üretimini önlemek için alternatif yaklaşımlar aşağıda tartışılmıştır.

  1. 1 g FUdR'yi 10 mL ultra saf H2O'ya eriterek 1000x stok çözümü yapın. Aliquot 1 mL stok steril bir 1.5 mL tüp içine. Dondurun ve -20 °C'de saklayın.
  2. L4 aşamasına kadar 20 ° C'de hayvan yetiştirin. Hipoklorit tedavisinden senkronize L1'lerden yetiştirilen N2 hayvanları, L4'e ulaşmak için 20 ° C'de yaklaşık 40 saat büyüme gerektirir. Diğer suşlar için büyüme oranları deneyden önce ampirik olarak test edilmelidir. C. elegans'ın doğru bir şekildenasıl sahnelendirılacağı hakkında ayrıntılı bilgi için bkz.
    1. L4 hayvanları ile her 6 cm plakaya 100 μL 80x FUdR ekleyin. L4 aşamasında FUdR eklemek önemlidir.
  3. Plakaları bir solucan kutusuna geri verin ve kutuyu bir zip-lock torbasına koyun. Uygun inkübatöre dönün.

4. Poliglutamin ifade eden hayvanlar kullanılarak kas dokusundaki proteostazdaki düşüşün ölçülmesi

NOT: Kas hücrelerindeki proteostaz düşüşünü tanımlamak için iki yöntem kullanılabilir: yaşlanma sırasında protein agregalarının oluşumunu görüntülemek (4.1) ve bu agregaların felcin başlangıcında yaşla birlikte neden olduğu proteotoksisiteyi ölçmek (4.2).

  1. Yaşlanma sırasında kasta poliglutamin agrega oluşumunu görüntüleme
    NOT: Kas hücrelerindeki protein toplamanın yaşa bağlı ilerlemesi, sarı bir floresan proteine (YFP) kaynaşmış poliglutamin (polyQ) tekrarları kullanılarak görüntülenmiştir. Bu protokol, AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP]geriniminin kullanımını özetler, ancak diğer poliglutamin varyant suşları da kullanılabilir. PolyQ::YFP transgene, unc-54 kas spesifik promotörü kullanılarak kasta ifade edilir. Senkronize unc-54p::p olyQ::YFP ifade eden hayvanlar yetişkinliğin 1, 2, 3 ve 4. Unc-54p::p olyQ::YFP agregalarını görselleştirmek için floresan veya floresan diseksiyon mikroskobu için donatılmış bileşik bir mikroskop kullanın. AM140, Caenorhabditis Genetics Center'dan (CGC) şu https://cgc.umn.edu/strain/AM140.
    1. Görüntüleme günlerinde (Yetişkinliğin 1, 2, 3 ve 4. günü), 20 hayvan seçin ve % 3 agarose ped ve 10 mM sodyum azit (M9 tamponunda seyreltilmiş) 5 μL damla ile mikroskop slayt kurulumuna monte edin.
    2. Tüm hayvanlar sodyum azit (~ 5 dakika) ile hareketsiz hale geldikten sonra, 10x büyütme lensi kullanarak hayvanların tüm vücutlarını görüntüleyin (Şekil 1A). Görüntüleme için bir FITC filtresi ve her hayvan için aynı pozlamayı kullanın. Görüntülemeden sonra slaytları atın.
      NOT: Alternatif olarak, YFP odakları doğrudan plakalar üzerinde de ölçülebilir, ancak puanlama sırasında plakaya bir karbondioksit akışı uygulanarak hareket engellenmelidir. Bu alternatif yöntem, çok sayıda koşulun tarandığında en uygun yöntemdir (daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın).
    3. Görüntülerin elde edildikten sonra, tüm hayvanın vücut duvarı kaslarındaki odak sayısını sayın. Odaklar, arka plandaki dimmer çözünür sinyalden ayırt edilebilen daha parlak noktalı sinyallerdir.
    4. 1, 2, 3 ve 4. X'in yetişkinlik günlerini, Y'nin ise unc-54p::p olyQ::YFP odaklarının sayısını temsil ettiği bir XY grafiği çizin (Şekil 1B). Deneysel durumdaki odakların sayısı (örneğin, gen küçültme veya aşırı ekspresyon) kontrol hayvanları ile karşılaştırılır. Her deneme için gözlenen her zaman noktasında gruplar arasında istatistiksel analiz gerçekleştirin.
      1. Odak sayılarını yalnızca iki koşul için karşılaştırırken, her zaman noktasında bağımsız bir örnek t testi gerçekleştirin.
      2. İkiden fazla koşul için odak sayılarını karşılaştırırken, o zaman noktasındaki tüm koşulların verileri de dahil olmak üzere her zaman noktası için bir omnibus tek yönlü ANOVA analizi gerçekleştirin. Omnibus ANOVA önemli bir p değeri (örneğin, p < 0.005) verirse, odaklarda önemli bir farkın tespit edildiği belirli koşulları belirlemek için çift yönlü bağımsız örnek t-testleri ile geçici bir analiz yapın (örneğin, A, B ve C grupları için A & B, A ve C ve B & C'yi karşılaştırın).
  2. Kas hücrelerinde poliglutamin toksisitesi için taşıyıcı olarak hayvan felci oranlarının ölçülmesi
    NOT: Kastaki poliQ agregalarının yaşa bağlı artışı, hareket hızını artıran kas fonksiyonunun azalmasına neden olur. Lokomotiondaki bu kusur, poliQ ekspresyonlu hayvanlarda ilerleyici felç oranı ölçülerek belirlenebilir. Felç tahlilleri için, senkronize unc-54p::p olyQ::YFP ifade eden hayvanlar yetişkinliğin 3, 5, 7 ve 9. Genetik pertürbasyonun etkisini değerlendirebilmeniz için puanlama aralığını genişletmek için gerektiğinde ek zaman noktaları ekleyin.
    1. Puanlama günlerinde (Yetişkinliğin 3, 5, 7 ve 9. günü), 50 hayvan içeren 6 cm plakalara bakın ve felçli hayvan sayısını kaydedin. Felçli hayvanları tabaktan çıkarın. Hayvanlar tabaktan sürünerek çıkmışsa veya ölmüşse, sansürlenmelidir; analizde hesaba alınabilmesi için olayı kaydedin.
      NOT: Bir hayvan, hafif veya yumuşak dokunma uyaranlarına maruz kaldıktan sonra herhangi bir hareket gözlenmediğinde felçli olarak kabul edilir. Farengeal pompalama aktivitesi, hareketsiz hayvanların canlı veya ölü olup olmadığını belirlemek için kullanılır.
    2. Deneyin tamamlanmasıyla, her durum için felç oranını hesaplayın. Bunu her zaman, felçli hayvanların fraksiyonunu o zaman bu durum için gözlemlenen toplam hayvan sayısına bölerek yapın. Zaman noktası başına koşul başına birden fazla plaka gözlemliyorsanız (örneğin, plakaları çoğaltın), her çoğaltma için oranı ayrı olarak hesaplayın.
    3. XY grafiğinde (scatterplot) felç oranının ilerlemesini çizin. X yetişkinlik günlerini, Y ise felç oranlarını temsil eder. Unc-54p::p olyQ::YFP hayvanlarının felç oranı kontrol hayvanları ile karşılaştırılır (Şekil 1C). Gruplar arasında istatistiksel analiz yapmak; birden fazla deneme için, denemeleri bağımsız olarak tedavi edin. Cox Proportional-Hazards Regresyonunu ve Wald testini kullanın. Hayatta kalma analizini destekleyen çoğu veri analizi aracı da Cox modellemesini destekler.
      1. Verileri dönüştürün: her koşulun biri zaman için, diğeri "olay" için olmak üzere iki sütunu olmalıdır. Gözlemlenen her zaman noktasında, her felçli hayvan için "0" ve sansürlenmiş her hayvan için bir "1" içeren bir satır ekleyin. Toplam satır sayısı, bu durum için plakadaki başlangıç hayvanlarının sayısına eşit olmalıdır.
      2. İstatistiksel yazılımınızın talimatlarına göre Cox Proportional-Hazards modellemesini ve ardından Wald testini gerçekleştirin. Tipik deney tasarımları için tek değişkenli bir model uygun olacaktır. İkiden fazla koşul için, tüm koşulları içeren bir test önemli bir sonuç gösteriyorsa (örneğin, p < 0.005), koşulların belirli önemli çiftlerini belirlemek için koşullar arasında çift yönlü testler yapılabilir.
        NOT: Cox modeli, test durumlarının zaman içinde bir olayın olasılığını orantılı olarak modüle ettiği varsayımını temel eder. Bu, örneğin, Cox modelinin, çoğu hayvanın 1. Cox modelinin uzantıları ve her zaman noktasında felç olan oranları karşılaştırmak için diğer yaklaşımlar, orantılı tehlike varsayımının tutmadığı durumlar içinkullanılabilir,bkz.

5. Nöronal dokudaki proteostazdaki düşüşü, hayvanları ifade eden poliglutamin kullanarak ölçmek.

NOT: Yaşlanma sırasında protein agregalarının (floresan odaklar) oluşumunu ölçerek nöronlarda proteostaz düşüşünü (1) ve (2) hareket bazlı bir tahlil yoluyla nöronal proteomda yaşa bağlı düşüşü ölçerek test etmek için iki tamamlayıcı yöntem kullanılır.

  1. Yaşlanma sırasında nöronlarda poliglutamin agrega oluşumunu görüntüleme
    NOT: Kas dokusunda zaten tartışılan teste benzer şekilde, nöronlarda protein toplamanın yaşa bağlı ilerlemesi, rgef-1'inpan-nöronal dokuya özgü promotörü tarafından yönlendirilen bir poliQ::YFP füzyon proteini ifade ederek görüntülenmiştir. Özellikle AM101 kullanıyoruz: rmIs110 [rgef-1p::Q40::YFP] , YFP16'yakırk glutamin füzyonu . rgef-1p::p olyQ::YFP'yi görselleştirmek için, 40x büyütme lensi ile floresan için donatılmış bileşik bir mikroskop kullanın. AM101, CGC'den şu https://cgc.umn.edu/strain/AM101.
    1. Görüntüleme günlerinde (Yetişkinliğin 4, 6, 8 ve 10. günü), 20 hayvan seçin ve 10 mM sodyum azit (M9 tamponunda seyreltilmiş) 5 μL damlası olan% 3 agarose ped içeren bir mikroskop kaydırağı üzerine monte edin.
    2. Tüm hayvanlar sodyum azit (~ 5 dakika) tarafından hareketsiz hale geldikten sonra, 40x büyütme lensi kullanarak hayvanların başının z-stack görüntülerini alın (Şekil 2A). Görüntülemeden sonra slaytları atın.
    3. Görüntülerin elde edildikten sonra, maksimum projeksiyonu elde etmek için z yığınlarını işleyin ve sinir halkası bölgesinde bulunan nöronlardaki odak sayısını ölçmek için kullanın. Odaklar, arka plandaki dimmer çözünür sinyalden ayırt edilebilen daha parlak noktalı sinyallerdir.
      NOT: Sinir halkası bölgesini rgef-1p::p olyQ::YFP agregalarını ölçmek için özellikle seçtik, çünkü bu çoğu nöronun sinaptik bağlantılar yapmak için birleştiği bölgedir. Bununla birlikte, motor nöronlarda agrega oluşum seviyelerini ölçmek için, dorsal veya ventral sinir kordonunda bulunan rgef-1p::p olyQ::YFP agregaları ölçülebilir.
    4. D4, D6, D8 ve D10'dan YFP odak birikiminin ilerlemesini çizin. Bunu, X'in yetişkinlik günlerini temsil ettiği ve Y'nin rgef-1p::p olyQ::YFP odaklarının sayısını temsil ettiği bir XY grafiğinde yapın (Şekil 2B). Deneysel durumdaki odakların sayısı (örneğin, gen küçültme veya aşırı ekspresyon) kontrol hayvanları ile karşılaştırılır. Nöronlar için odak sayılarının istatistiksel analizi, kas poliQ odakları ile aynı şekilde yapılır; bkz. adım 4.1.4 ve ilişkili notlar.
  2. Vücut bükülmelerinin ölçülmesi, nöronlarda poliglutamin proteotoksisitesinin taşıyıcı ölçüsü olarak bükülür.
    NOT: Nöronal poliQ'nun ilerleyici agrega birikiminden kaynaklanan proteotoksik stres, motor nöron kusurlarına bir hırpalama testi yoluyla bakılarak belirlenir. M9 fizyolojik tamponda askıya alınırken vücut bükümlerinin sayısını 30 saniyelik bir sürede ölçün (Ek Dosya 1).
    1. Yetişkinliğin 2. gününde, plakadan 10 senkronize hayvan seçin ve mikroskop kaydırağı üzerinde 10 μL'lik bir M9 tampon damlasına yerleştirin. 40 veya daha fazla hayvan örneği almak için bu adımı en az dört kez tekrarlayın.
    2. Mikroskop kaydırağine yerleştirilen 10 hayvanın hareketini video özellikli bir kamera ile stereomikroskopta 30 s süre için 10 μL M9 tamponu ile video kaydedin. Toplam örnek sayısı 40 için bu adımı 4 kez yineleyin. Yakınlaştırma ve konum, tüm hayvanların tam 30 saniye boyunca çerçevede görülebilecek şekilde ayarlanmalıdır.
    3. Analiz edilecek hayvanlarla tüm videolar kaydedildikten sonra, videoyu oynatın ve her hayvanın vücut virajlarını puanlayın. Bir vücut bükümü, hayvanın vulvasının bir taraftan diğerine ve başlangıç pozisyonuna geri dönmesi olarak tanımlanır.
      NOT: Vahşi tip hayvanların tipik olarak 30 saniyede 49 ± 0,79 vücut virajına sahip olduğunu görüyoruz.
    4. Her noktanın X ekseninde test edilen farklı koşullarla 30 s (Y ekseni) olarak gövde bükümlerinin sayısını temsil ettiği bir sütun grafiğinde her hayvan için gövde bükümlerinin sayısını çizin. Unc-54p::p olyQ::YFP hayvanlarının vücut bükümlerinin sayısı kontrol hayvanlarıyla karşılaştırılır (Şekil 2C). Her deneme için gruplar arasında bağımsız olarak istatistiksel analiz yapmak; test birden çok zaman noktasında tekrarlanırsa, verileri her zaman noktası için bağımsız olarak analiz edin.
      1. Yalnızca iki koşulu değerlendirirken, bağımsız örnek bir t testi gerçekleştirin.
      2. Aynı anda ikiden fazla koşulu göz önünde bulundurduğunuzda, önce o zaman deneme/zaman noktasındaki tüm koşulların verileri de dahil olmak üzere omnibus tek yönlü ANOVA analizi yapın. Omnibus ANOVA önemli bir p değeri (yani p < 0.005) verirse, vücut büküm sayımında önemli bir farkın tespit edildiği belirli koşulları belirlemek için çift yönlü bağımsız örnek t-testleri ile geçici bir analiz yapın.

Sonuçlar

C. elegans'da poliglutamin tekrar modeli proteostatik ağı düzenleyen genlerin tanımlanmasında etkili olmuştur. Örneğin, daha önce homeodomainin transkripsiyonel bir kofaktör olan protein kinazını(hpk-1)etkileşime sokarak, otofaji ve moleküler refakatçilerin ekspresyonunu düzenleyerek yaşlanma sırasında proteostazları etkilediğini gösterdik31. RNAi susturma veya hpk-1 (pk1393) null mutant hayvanlarda hpk-1 kaybının yaşlanma sırasında bi...

Tartışmalar

Yaşlanma, proteostazda kademeli bir düşüş ile karakterizedir. Proteostaz, protein katlama, bozulma ve çevirinin koordineli, dinamik, strese duyarlı kontrolü için karmaşık bir sistem olan proteostatik ağ tarafından korunur. Proteostazın yaşlanma sırasında neden başarısız olduğu yezih anlaşılmaktadır, ancak çürüyen bir epigenom, stres yanıtlarının azalan indüksiyonatı ve telafi edici çapraz konuşma kaybı bu arıza ile çakışmaktadır. C. elegans'ta, birden fazla stres yanıtı ...

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Samuelson laboratuvarının geçmiş ve şimdiki üyelerine, bu yöntemin iyileştirilmesine ve/veya bu makalenin geliştirilmesine yardımcı olan tartışmalara yardımları için teşekkür ederiz. Bu yayında bildirilen araştırmalar, RF1AG062593 ve R21AG064519 Ödül Numaraları altında Ulusal Sağlık Enstitülerinin Yaşlanması Ulusal Enstitüsü tarafından desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Fon sağlayıcılar çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rol oynamamışlardır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
24 Well Culture PlatesGreiner Bio-One#662102
2 mL 96-well platesGreiner Bio-One#780286
600 µL 96-well platesGreiner Bio-One#786261
96-pin plate replicatorNunc250520
Air-permeable plate sealVWR60941-086
bacteriological agarAffymetrix/USB10906
bacto-peptoneVWR90000-368
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- AhringerSource BioscienceC. elegans RNAi Collection (Ahringer)See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- VidalSource BioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)Alfa AesarL16497
Glass microscope cover slipsVWR48404-455
Glass microscope slidesVWR160004-422
IPTG (isopropyl beta-D-1-thigalactopyranoside)Gold Bio12481C100
Retangular non-treated single-well plate, 128x86mmThermo-Fisher242811
Sodium Azide, CAS #26628-22-8Sigma-AldrichS2002
Zeiss Axio Imager M2m microscope with AxioVision v4.8.2.0 softwareZeissunknown
Zeiss StemiSV11 M2 Bio Quad microscopeZeissunknown

Referanslar

  1. Wolff, S., Weissman, J. S., Dillin, A. Differential scales of protein quality control. Cell. 157 (1), 52-64 (2014).
  2. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  3. Powers, E. T., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W., Balch, W. E. Biological and chemical approaches to diseases of proteostasis deficiency. Annual Review of Biochemistry. 78, 959-991 (2009).
  4. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  5. Sala, A. J., Bott, L. C., Morimoto, R. I. Shaping proteostasis at the cellular, tissue, and organismal level. Journal of Cell Biology. 216 (5), 1231-1241 (2017).
  6. Braak, H., Braak, E., Strothjohann, M. Abnormally phosphorylated tau protein related to the formation of neurofibrillary tangles and neuropil threads in the cerebral cortex of sheep and goat. Neuroscience Letters. 171 (1-2), 1-4 (1994).
  7. Poirier, M. A., Jiang, H., Ross, C. A. A structure-based analysis of huntingtin mutant polyglutamine aggregation and toxicity: evidence for a compact beta-sheet structure. Human Molecular Genetics. 14 (6), 765-774 (2005).
  8. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659 (2014).
  9. Eftekharzadeh, B., Hyman, B. T., Wegmann, S. Structural studies on the mechanism of protein aggregation in age related neurodegenerative diseases. Mechanisms of Ageing and Development. 156, 1-13 (2016).
  10. Pokrishevsky, E., Grad, L. I., Cashman, N. R. TDP-43 or FUS-induced misfolded human wild-type SOD1 can propagate intercellularly in a prion-like fashion. Scientific Reports. 6, 22155 (2016).
  11. Mukherjee, A., Morales-Scheihing, D., Butler, P. C., Soto, C. Type 2 diabetes as a protein misfolding disease. Trends in Molecular Medicine. 21 (7), 439-449 (2015).
  12. Sikkink, L. A., Ramirez-Alvarado, M. Biochemical and aggregation analysis of Bence Jones proteins from different light chain diseases. Amyloid. 15 (1), 29-39 (2008).
  13. Qu, B. H., Strickland, E., Thomas, P. J. Cystic fibrosis: a disease of altered protein folding. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 29 (5), 483-490 (1997).
  14. Qu, B. H., Strickland, E. H., Thomas, P. J. Localization and suppression of a kinetic defect in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator folding. Journal of Biological Chemistry. 272 (25), 15739-15744 (1997).
  15. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
  16. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
  17. Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. New England Journal of Medicine. 355 (21), 2254-2255 (2006).
  18. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes & Development. 22 (11), 1427-1438 (2008).
  19. Walker, F. O. Huntington's disease. Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).
  20. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), 0002 (2001).
  21. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. Journal of Visualized Experiments. (82), e50840 (2013).
  22. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  23. Cornwell, A. B., Llop, J. R., Salzman, P., Thakar, J., Samuelson, A. V. The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan. Journal of Visualized Experiments. (136), e57819 (2018).
  24. Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
  25. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), 85964 (2014).
  26. Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction. Developmental Biology. 51 (1), 23-33 (1976).
  27. Schemper, M. Cox Analysis of Survival Data with Non-Proportional Hazard Functions. Journal of the Royal Statistical Society. Series D (The Statistician). 41 (4), 455-465 (1992).
  28. Royston, P., Parmar, M. K. The use of restricted mean survival time to estimate the treatment effect in randomized clinical trials when the proportional hazards assumption is in doubt. Statistics in Medicine. 30 (19), 2409-2421 (2011).
  29. Campbell, I. Chi-squared and Fisher-Irwin tests of two-by-two tables with small sample recommendations. Statistics in Medicine. 26 (19), 3661-3675 (2007).
  30. Busing, F. M., Weaver, B., Dubois, S. 2 x 2 Tables: a note on Campbell's recommendation. Statistics in Medicine. 35 (8), 1354-1358 (2016).
  31. Das, R., et al. The homeodomain-interacting protein kinase HPK-1 preserves protein homeostasis and longevity through master regulatory control of the HSF-1 chaperone network and TORC1-restricted autophagy in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 13 (10), 1007038 (2017).
  32. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes & Development. 21 (22), 3006-3016 (2007).
  33. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  34. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  35. Shemesh, N., Shai, N., Ben-Zvi, A. Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (5), 814-822 (2013).
  36. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14914-14919 (2009).
  37. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  38. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).
  39. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genetics. 7 (12), 1002438 (2011).
  40. Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans. Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).
  41. Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New genes tied to endocrine, metabolic, and dietary regulation of lifespan from a Caenorhabditis elegans genomic RNAi screen. PLoS Genetics. 1 (1), 119-128 (2005).
  42. Nollen, E. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  43. Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes & Development. 21 (22), 2976-2994 (2007).
  44. Johnson, D. W., et al. The Caenorhabditis elegans Myc-Mondo/Mad complexes integrate diverse longevity signals. PLoS Genetics. 10 (4), 1004278 (2014).
  45. Wang, Z., Sherwood, D. R. Dissection of genetic pathways in C. elegans. Methods in Cell Biology. 106, 113-157 (2011).
  46. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 175proteostazpoliglutaminpoliQ YPCC elegansya lanmabiyobelirteprotein homeostazgenetik analizfonksiyonel genomik

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır