מדידת בצקת מוחית לאחר שבץ מוחי, אזור אוטם ופירוק מחסום דם- מוח בערכה אחת של דגימות מוח מכרסמים

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה חדשנית של מדידת שלושת הפרמטרים החשובים ביותר של פגיעה מוחית איסכמית על אותה קבוצה של דגימות מוח מכרסמים. שימוש במדגם מוח אחד בלבד הוא יתרון גדול במונחים של עלויות אתיות וכלכליות.

Abstract

אחד הגורמים השכיחים ביותר לתחלואה ותמותה ברחבי העולם הוא שבץ איסכמי. מבחינה היסטורית, מודל של בעלי חיים המשמש להמרצת שבץ איסכמי כרוך בחסימת עורק המוח האמצעי (MCAO). אזור אוטם, בצקת במוח והתמוטטות מחסום הדם - מוח (BBB) נמדדים כפרמטרים המשקפים את היקף הפגיעה המוחית לאחר MCAO. מגבלה משמעותית לשיטה זו היא כי מדידות אלה מתקבלות בדרך כלל בדגימות שונות של מוח החולדות, מה שמוביל לעומסים אתיים ופיננסיים בשל המספר הגדול של חולדות שיש להרדים עבור גודל מדגם מתאים. כאן אנו מציגים שיטה להעריך במדויק פגיעה מוחית בעקבות MCAO על ידי מדידת אזור אוטם, בצקת במוח וחדירות BBB באותה קבוצה של מוחות חולדה. טכניקה חדשנית זו מספקת דרך יעילה יותר להעריך את הפתופיזיולוגיה של שבץ.

Introduction

אחד הגורמים השכיחים ביותר לתחלואה ותמותה ברחבי העולם הוא שבץ מוחי. באופן גלובלי, שבץ איסכמי מייצג 68% מכלל מקרי השבץ, ואילו בארצות הברית שבץ איסכמי מהווה 87% ממקרי^{השבץ 1,2}. ההערכה היא כי הנטל הכלכלי של שבץ מגיע $34 מיליארד בארצות הברית² ו 45 מיליארד אירו באיחוד האירופי³. מודלים בעלי חיים של שבץ נחוצים כדי ללמוד את הפתופיזיולוגיה שלה, לפתח שיטות חדשות להערכה, ולהציע אפשרויות טיפוליות חדשות⁴.

שבץ איסכמי מתרחש עם חסימה של עורק מוחי גדול, בדרך כלל עורק המוח האמצעי או אחד מענפיו⁵. לכן, מודלים של שבץ איסכמי מעורבים היסטורית חסימת עורק המוח התיכון (MCAO)^{6,7,8,9,10,11,12}. בעקבות מקאו, פגיעה נוירולוגית מוערכת בדרך כלל על ידי מדידת אזור אוטם (IZ) באמצעות 2,3,5-טריפינילטטרזוליום כלוריד (TTC) שיטת הכתמת¹³, בצקת במוח (BE) באמצעות יבש חישוב או חישוב כרכים hemispheric^14,15,16, ומחסום הדם מוח (BBB) חדירות על ידי טכניקה ספקטרומטריה באמצעות אוונס כחול מכתים^17,18,19.

שיטת MCAO המסורתית משתמשת בקבוצות נפרדות של מוחות עבור כל אחת משלוש מדידות המוח. עבור גודל מדגם גדול, התוצאה היא מספר משמעותי של בעלי חיים מורדמים, עם שיקולים אתיים ופיננסיים נוספים. שיטה חלופית להקלה על עלויות אלה תכלול מדידות של כל שלושת הפרמטרים בסט אחד של מוחות מכרסמים שלאחר MCAO.

נעשו ניסיונות קודמים למדוד שילובים של פרמטרים באותה דגימת מוח. שיטות צביעה חיסוניות בו זמנית^20, כמו גם ניתוחים מולקולריים וביוכימיים אחרים²¹ תוארו לאחר כתמי TTC באותה דגימת מוח. חישבנו בעבר כרכים בחצי הכדור במוח כדי להעריך בצקת במוח וביצענו כתמי TTC כדי לחשב אזור אוטם באותו מוח להגדיר¹⁵.

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מציגים טכניקת MCAO שונה המודדת פגיעה מוחית איסכמית באמצעות קביעת חדירות IZ, BE ו- BBB באותה קבוצה של מוחות מכרסמים. IZ נמדד על ידי כתמי TTC, BE נקבע על ידי חישוב נפח hemispheric, וחדירות BBB מתקבלת על ידי שיטות ספקטרומטריה¹⁹. בפרוטוקול זה, השתמשנו במודל MCAO שונה, המבוסס על החדרה ישירה וקיבעון של קטטר המונופילמנט לתוך עורק העורק הראשי הפנימי (ICA) וחסימת זרימת דם נוספת לעורק המוחי האמצעי (MCA)²². שיטה זו שונה מראה שיעור ירידה של תמותה ותחלואה לעומת שיטת MCAO המסורתית^16,22.

גישה חדשה זו מספקת מודל כלכלי ואתי למדידת פגיעה נוירולוגית לאחר MCAO. הערכה זו של הפרמטרים העיקריים של פגיעה מוחית איסכמית תסייע לחקור באופן מקיף את הפתופיזיולוגיה שלה.

Protocol

ההליכים הבאים נערכו בהתאם להמלצות הצהרת הלסינקי וטוקיו וההנחיות לשימוש בבעלי חיים ניסיוניים של הקהילה האירופית. הניסויים אושרו גם על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת בן-גוריון בנגב.

1. הכנת חולדות להליך הניסויי

1. בחר חולדות Sprague-Dawley זכר בוגר ללא פתולוגיה גלויה, כל אחד במשקל בין 300 ל 350 גרם.
2. יש לשמור על כל החולדות בטמפרטורת החדר בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס, עם 12 שעות של מחזורים בהירים וחשוכים לפני הניסוי.
3. ודא כי מזון ומים זמינים libitum המודעה.
4. בצע את כל ההליכים בין השעות 06:00 .m עד 14:00.m.

2. הכנת חולדות לניתוח

1. יש להרדים את החולדות במשך 30 דקות עם isoflurane (4% לאינסדוקציה ו-2% לתחזוקה) ו-24% חמצן (1.5 ל' לדקה).
   1. בדוק את רמת ההרדמה בחולדות על ידי הבטחת אין להם רפלקס נסיגה דוושה.
2. הכנס את הקטטר 24-מד לתוך וריד הזנב.
   הערה: התחממות הזנב עבור vasodilation אינו מבוצע.
   1. מניחים את החולדות על השולחן בתנוחה על-חושית. השתמש בקלטת רפואית כדי להדביק את כל ארבעת הגפיים של החולדות.
3. מניחים את הגשוש למדידת טמפרטורה בפי הטבעת של החולדה לפני הניתוח.
4. במהלך ההליך, לשמור על צלחת חימום כדי לתמוך 37 °C (70 °F) טמפרטורת הגוף הליבה.
5. הוסף משחה בשתי עיניו של החולדה להגנה.
6. לגלח את האזור הכירורגי ולחטא עם שלושה יישומים של 10% povidone-יוד ואחריו 70% אלכוהול איזופרופיל.

3. חסימת עורק המוח האמצעי בצד ימין

הערה: מקאו מבוצע על ידי טכניקה שונה, כפי שתואר קודם לכן^16,22,23, עם שימוש בכלים המתוארים על ידי McGarry ואח^'24 ו Uluç ואח^'25.

1. לנתח את העור ואת fascia שטחית בקו האמצע הגחוני של הצוואר עם פינצטה כירורגית ומספריים עם להבים מעוגלים.
2. זהה את משולש השרירים, המורכב מה- ICA, עורק הראשי החיצוני (ECA) ועורק הראשי המשותף (CCA).
3. בזהירות להפריד את CCA הנכון ICA מן העצב vagus עם microforceps לניתוח כלי דם.
4. חשוף את CCA הנכון ואת ICA. חסום את זרימת הדם המגיעה מ- CCA ל- ICA באמצעות מיקרו-קליפים או חוסמי עורקים מיוחדים לניתוח כלי דם. בצע חתך (כ 1 מ"מ) על ICA באמצעות microscissors לניתוח כלי דם.
5. הכנס קטטר monofilament (4-0 ניילון) ישירות דרך ICA, על 18.5-19 מ"מ מנקודת bifurcation של CCA הימני לתוך המעגל של ויליס עד להגיע התנגדות קלה, כדי לחסום את MCA²⁶.
6. ליגייט סביב ICA מעל bifurcation של CCA.
7. עבור קבוצת הביקורת המופעלת באמצעות sham, בצע הוספה של חוט ניילון במקום שלבים 3.5 ו- 3.6^16,22.
8. לנהל 5 מ"ל של 0.9% נתרן כלורי על ידי הזרקה תוך-פריטונית.
9. סגור את הפצע על ידי תפר ולקחת את החולדה לאזור התאוששות.
   הערה: כמה דקות לאחר תום ההרדמה, החולדה תתעורר ותנוע באופן עצמאי סביב הכלוב.
10. ב 23 שעות לאחר MCAO, להזריק 2% אוונס כחול מלוחים (4 מ"ל / קילוגרם)^23,26 לתוך וריד הזנב עבור שתי הקבוצות המופעלות באמצעות קנולה²⁷.
    הערה: זה משמש כמעקב חדירות דם - מוח. אפשר להסתובב במשך 60 דקות.

4. קביעת אזור אוטם

1. מידה IZ ב 24 שעות לאחר MCAO כמתואר קודם לכן^{9,15,18,19,26}.
   הערה: חולדות שאיבדו יותר מ -20% ממשקל משקלן או פיתחו התקפים או hemiplegia אינן נכללות בניסוי.
2. המתת לחות החולדה על ידי החלפת תערובת הגז בהשראת 20% חמצן ו 80% פחמן דו חמצני עד החולדה מפסיק לנשום באופן ספונטני.
3. פתח את החזה עם חתך רוחבי 5-6 ס"מ דרך דופן הבטן מתחת לכלוב הצלעות באמצעות מספריים ומלקחיים כירורגיים.
4. בצע חתך סרעפתי לאורך כל כל כלוב הצלעות עם מספריים ומלקחיים כירורגיים.
5. בזהירות עקירת הריאות, לחתוך דרך כלוב הצלעות עד עצם הבריח בצד ימין ושמאל²⁸.
6. לחלחל עם 200 מ"ל של מלוחים נורמלי דרך החדר השמאלי של הלב.
7. לנקב או להסית את האטריום הנכון של הלב עם מספריים.
8. בצע עריפת ראש באמצעות גיליוטינה ולאסוף רקמת מוח.
9. באמצעות מספריים איריס, לחתוך מן מגנום foramen לקצה דיסטלי של משטח הגולגולת האחורי משני הצדדים.
10. להפריד את נורות הריח, חיבורים עצביים לאורך פני השטח הגחוניים ואת פני השטח הגביים של הגולגולת מהמוח.
11. הסר את המוח מהראש.
12. הפק 6 פרוסות מוח על-ידי יצירת מקטעים אופקיים בעובי 2 מ"מ עם פלדת אל-חלד "0.009, לא צ'יצוק, סכין גילוח בעל קצה יחיד.
13. דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (69 °F) ב 0.05% TTC.
14. הנח את רקמת המוח על שקופיות המיקרוסקופ ובצע סריקה אופטית של 6 פרוסות מוח אלה ברזולוציה של 1600x1600 dpi (ראה תוספת 1 למשל).
15. הוסיפו מסנן כחול עם עורך תמונות (למשל, Adobe Photoshop CS2) באמצעות הפונקציה Channel Mixer (Image > Adjustments > Channel Mixer)ושמרו את התמונה כתבנית קובץ JPEG.
    הערה: לאחר החלת המסנן הכחול, התמונה תופיע בגווני אפור.
16. פתח את התמונה השמורה ב- ImageJ 1.37v^29,30.
    הערה: תוכנית מחשב זו משתמשת בפונקציית סף כדי לבודד ולחשב את הפיקסלים בשחור-לבן (ראו איור 1).
17. עבור כל אחת מ-6 פרוסות המוח של התמונה, בחרו ושמרו כל חצי כדור (ימין פצוע ipsilateral ושמאלה ללא פגע) כקובץ תמונה נפרד באמצעות הכלי "בחירת מצולע" מהתפריט הראשי.
18. קבעו את הניתוק לקביעת IZ באמצעות פונקציית סף אוטומטית מהתפריט הראשי של תוכנת ImageJ באמצעות בחירה באפשרות 'תמונה' > 'התאם' > 'סף'ומדידת מספר הפיקסלים בכל חצי כדור של ערכת מוח אחת.
    הערה: ניתן להשתמש בפקודות מאקרו עבור שלב זה בתוכנת ImageJ (ראה תוספת 2 עבור הקוד). החיתוך הוא פרמטר קריטי לקביעת הפיקסלים שיש להמיר ללבן ואיזה להמיר לשחור בהתאם לגוון האפור (ראה תוספת 3 ו-תוסף 4 כדוגמאות). לאחר מכן ImageJ משווה פיקסלים לבנים ושחורים כדי לקבוע IZ. בהתבסס על פרוטוקול הכתמים והגדרות הסורק, השתמשנו בערך מנותק קבוע של 0.220.
19. בצע מדידה של תיקון IZ לנפיחות ברקמות באמצעות היחסים של חצי הכדור המוחי Ipsilateral ו Contralateral (RICH) שיטה^13,23 (ראה דוגמה תוספת 5).
    
    הערה: גודל האוטם מוערך כאחוז מחצי הכדור הנגדי.

5. קביעת בצקת במוח³¹

הערה: השתמש ImageJ 1.37v למדידה של BE^32,33.

1. מידה BE 24 שעות אחרי מקאו. לחישוב BE, השתמש בנתונים מאמצעי אחסון בחצי הכדור השמאלי והימני (ביחידות).
2. בצע סריקה אופטית ברזולוציה של 1600x1600 dpi (ראה תוספת 1 למשל).
3. בחר את ההמיספרות במוח והגדר את הניתוק לקביעת BE עם ImageJ 1.37v, כמתואר לעיל בסעיפים 4.17-4.19.
4. בטא את אזור BE כאחוז מהאזורים הסטנדרטיים בחצי הכדור הנגדי שלא הושפע, המחושב על-ידי שיטת RICH באמצעות המשוואה הבאה (ראה דוגמה בתוספת 5)^23,34.
   
   הערה: היקף BE מוערך כאחוז מחצי הכדור הנגדי.

6. קביעת שיבוש BBB

1. למדוד שיבוש BBB 24 שעות אחרי MCAO.
2. מחלקים את ההמיספרות הימנית והשמאלית לשש פרוסות ומכניסים כל אחת מהן לצינור מיקרוצנטריפוגה.
3. הומוגניזציה כל פרוסה של רקמת המוח בחומצה טריכלורואצטית, בהתבסס על חישוב של 1 גרם של רקמת המוח ב 4 מ"ל של 50% חומצה טריכלורואצטית.
4. צנטריפוגה ב 10,000 x g במשך 20 דקות.
5. לדלל נוזל על טבעי 1:3 עם 96% אתנול.
6. בצע ספקטרופוטומיות זוהרת על ידי שימוש בתוכנת ספקטרופוטומטריה, התקנת הצלחת וביצוע קריאה לדוגמה באמצעות הפרמטרים הבאים: אורך גל עירור עוצמת פלואורסצנטי של 620 ננומטר (רוחב פס 10 ננומטר) ואורך גל פליטה של 680 ננומטר (רוחב פס 10 ננומטר)^23,35 ; Mod העליון; מספר בשר 25; מדריך 100; רועד 1 שניות, 1 מ"מ.
   הערה: השתמש באורך גל עירור של 620 ננומטר (רוחב פס 10 ננומטר) ואורך גל פליטה של 680 ננומטר (רוחב פס 10 ננומטר). ^23,35

תוצאות

מדידת אזור אוטם

בדיקת T מדגם עצמאי הצביעה על כך ש-19 חולדות שעברו MCAO קבוע הראו עלייה משמעותית בנפח אוטם המוח בהשוואה ל-16 החולדות המופעלות על ידי זיוף (MCAO=7.49% ± 3.57 לעומת 3.57 לעומת. שאם = 0.31% ± 1.9, t(28.49) = 7.56, p < 0.01 (ראה איור 2A)). הנתונים באים לידי ביטוי כ...

Discussion

המטרה העיקרית של הפרוטוקול הנוכחי הייתה להפגין מדידות עקביות של שלושה פרמטרים עיקריים של פגיעה איסכמית: חדירות IZ, BE ו- BBB. מחקרים קודמים בתחום זה הראו את האפשרות לבצע אחד או שניים של פרמטרים אלה יחד באותו מדגם. מלבד הפחתת העלויות שמציעה שיטה בת שלושה חלקים זו, היא גם מספקת מודל ביו-אתי רצוי י?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Syringe	Braun	4606027V
2% chlorhexidine in 70% alcohol solution	Sigma-Aldrich	500 cc	Provides general antisepsis of the skin in the operatory field
27 G Needle with Syringe	Braun	305620
3-0 Silk sutures	Henry Schein	1007842
4-0 Nylon suture	4-00
Brain & Tissue Matrices	Sigma-Aldrich	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	183603985447
Centrifuge Sigma 2-16P	Sigma-Aldrich	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	Sigma-Aldrich	HR-AZ/HR-A
Digital weighing scale	Sigma-Aldrich	Rs 4,000
Dissecting scissors	Sigma-Aldrich	Z265969
Eppendorf pipette	Sigma-Aldrich	Z683884
Eppendorf tube	Sigma-Aldrich	EP0030119460
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	Model: Infinite 200 PRO multimode reader	Optional.
Fluorescence detector	Molecular Devices LLC	VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument	Optional.
Gauze sponges	Fisher	22-362-178
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Hemostatic microclips	Sigma-Aldrich
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Infusion cuff	ABN	IC-500
Micro forceps	Sigma-Aldrich
Micro scissors	Sigma-Aldrich
Multiset	Teva Medical	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Operating forceps	Sigma-Aldrich
Operating scissors	Sigma-Aldrich
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F	Resolution 3200 x 6400 dpi
Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5606
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical research for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment.
Rat cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Cages were used for housing rats throughout the experiment
Scalpel blades #11	Sigma-Aldrich	S2771
Software
Adobe Photoshop CS2 for Windows	Adobe
ImageJ 1.37v	NIH		The source code is freely available. The author, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), is at the Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA
SPSS Statistics 22	IBM
Office 365 ProPlus	Microsoft	-	Microsoft Office Excel
Windows 10	Microsoft
Reagents
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	298-96-4
50% trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9
Ethanol 96 %	Romical		Flammable liquid
Evans blue 2%	Sigma-Aldrich	314-13-6
Isoflurane, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017