JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

גנגוליה (CG) היא חלק ממערכת העצבים הפאראסימפתטית. תרבויות נוירואליות של אפרוח CG הנוירונים הוכחו להיות מודלים תא יעיל במחקר של אינטראקציות שרירים עצביים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור הניתוח, דיסוציאציה ותרבות מבחנה של CG נוירונים מ עוברי האפרוח.

Abstract

גרעינים צ'יק (CG) הם חלק ממערכת העצבים הפאראסימפתטית ואחראים לאינבציה של רקמות השריר הקיימות בעין. גנגליון זה הוא היווה על ידי אוכלוסיה הומוגנית של choroidal ונוירונים הinnervate שרירי וחלקה סיבים, בהתאמה. כל אחד מסוגי עצבי אלה לווסת מבנים העין ספציפיים פונקציות. במהלך השנים, תרבויות עצביות של גנגוליה חומוס האפרוח הוכחו להיות מודלים תא יעיל במחקר של אינטראקציות שרירים מערכת העצבים, אשר מתקשרים דרך הסינפסות cholinergic. . ברוב הcholinergic מודל תא זה הוכח להיות שימושי יחסית בשימוש בעבר דגמי תאים הטרוגנית המהווים מספר סוגים עצביים, מלבד cholinergic. מבחינה אנטומית, גנגליון הסילארי מקומי בין העצב האופטי (ON) לבין הקרע הדמית (CF). כאן, אנו מתארים הליך מפורט עבור הניתוח, הדיסוציאציה ובתרבות מבחנה של הנוירונים גנגליה גרעינים מעוברי האפרוח. אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי להשיג תרבויות הסלולר טהור ויציב מאוד של CG נוירונים, הדגשת צעדי מפתח של התהליך. תרבויות אלה ניתן לשמור על מבחנה במשך 15 ימים, בזאת, אנו מראים את ההתפתחות הנורמלית של התרבויות CG. התוצאות מראות גם כי הנוירונים האלה יכולים לתקשר עם סיבי השריר באמצעות שרירי cholinergic הסינפסות הנוירולוגית.

Introduction

גנגליון (CG) נוירונים שייכים למערכת העצבים הפאראסימפתטית. הנוירונים האלה הם cholinergic, להיות מסוגל להקים מוסריריתיים או הסינפסות ניקולט1,2,3. אנטומית, CG ממוקם בחלק האחורי של העין בין העצב האופטי (על) ואת הקרע דמית (CF) ומורכב סביב 6000 נוירונים בשלבים העובריים המוקדמים1,4. בשבוע הראשון בתרבות, הניריונים גנגליון נוירונים להציג מורפולוגיה רב קוטבי. לאחר שבוע, הם מתחילים לעבור למצב חד קוטבי, עם אחד neurite הרחבה ויצירת אקסון5. בנוסף, כמחצית של הנוירונים למות CG בין היוםה -8 ו -14 של התפתחות העובר צ'יק, באמצעות תהליך מתוכנת של מוות התאים. ירידה זו מספר הנוירונים תוצאות באוכלוסייה הכוללת של גנגליון הגאנגרי של סביב 3000 נוירונים6,7,8. בתוך מבחנה, אין ירידה במספר של CG נוירונים כאשר גדל עם תאים שרירים9 ו-cg נוירונים יכול להיות מתורבת במשך מספר שבועות1,9.

גנגאריה מורכב מאוכלוסיה הומוגנית של נוירונים סיליברי ונוירונים choroidal, כל אחד מייצג חצי מהאוכלוסייה העצבית ב-CG, innervating שריר העין. שני סוגים אלה של נוירונים הם מבנית, מאנטומית ומבחינה פונקציונלית. הנוירונים סיליברי innervate סיבי השריר הסטריבטים על הקשתית והעדשה, האחראים על התכווצות האישון. Choroidal נוירונים innervate השריר החלק של הדמית1,10,11,12.

תרבויות של עוף בצורת גנגליון נוירונים הוכחו להיות כלים שימושיים לחקר הסינפסות נוירוסכולריות והיווצרות סינפסה1,5,9. בהתחשב בעובדה כי סינפסות נוירו-מולקולרית הם cholinergic13, באמצעות אוכלוסייה עצבית כי הוא CHOLINERGIC – CG נוירונים – התפתחה כחלופה פוטנציאלית דגמי התא הקודם14. מודלים אלה היו באוכלוסיה עצבית הטרוסוגלית, שבה רק חלק קטן הוא cholinergic. לחילופין, הנוירונים מתפתחים בצורה מהירה יחסית בתוך מבחנה, ולאחר כ -15 שעות כבר יוצרים את הסינפסות1. הנוירונים CG שימשו מערכת מודל לאורך השנים למחקרים מחקר ברורים, בשל קלות יחסית של בידוד ומניפולציה. יישומים אלה כוללים מחקרים אלקטרואופטיקה, התפתחות סינפסה, אפופטוזיס ואינטראקציות נוירוסקולריות14,15.

אנו מתארים הליך מפורט עבור הניתוח, הדיסוציאציה בתרבות מבחנה של הנוירונים גרעינים של מיום העובריים 7 (E7) בחורה עוברים. אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי לקבל תרבויות סלולר טהור ויציב מאוד של נוירונים cholinergic. אנו מדגישים גם את צעדי המפתח של הפרוטוקול הדורשים תשומת לב מיוחדת, ושישפרו את איכות התרבויות הנוירואליות. התרבויות הללו יכולות להישמר. באופן מתורבת לפחות 15 יום

Protocol

1. הכנת ריאגנטים

הערה: החומרים הנחוצים להליך זה הם הבאים: מלקחיים (n º 5 ו-n º 55), מלקחיים כירורגיים, לחיתוך מנות פטרי (שחור תחתון), 24-צלחות, מזרקים פסטר מפלסטיק, זכוכית מלוטשת פסטר הצינורות, 10 מ"ל מזרק, 0.22 יקרומטר מזרק מסנן.

  1. להכין ולעקר את כל החומר הדרוש לפרוטוקול כולל שמיכות זכוכית, מלקחיים (n º 5 ו-n º 55), מלקחיים כירורגיים, מנות פטרי (שחור תחתון), מזוקק H2O, פיפטות וחומר לניתוח.
  2. להכין את 0.1 mg/mL פולי-D ליזין (PDL) פתרון.
    1. מהווים מחדש PDL ב 0.1 M בוראט מאגר (pH 8.2) לריכוז של 1 מ"ג/mL (פתרון 10x).
    2. לדלל 1:10 ב 166.6 mM בוראט מאגר (pH 8.2) כדי לקבל ריכוז סופי של 0.1 mg/mL.
  3. הכנת 10 μg/mL פתרון למינציה.
    1. לדלל 1 מ"ג/mL למינציה במדיום נוירובסיס רגיל לריכוז הסופי של 10 μg/mL.
  4. להכין את הפתרון של מלח מאוזן של האנק (HBSS): 5.36 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 137 mm הנאקל, 4.16 mM NaHCO3, 0.34 mm Na2hpo4· 2h2O, 5 מ"מ גלוקוז, 1 מ"מ נתרן פירובט, 10 מ"מ מאגר hepes, 0.001 x פנול אדום. התאם את ה-pH ל-7.2.
  5. הכינו 0.1% טריפסין פתרון.
    1. לפזר 5 מ ג טריפסין 1:250 אבקה ב 5 מ ל של HBSS עבור ריכוז סופי של 0.1%.
    2. הציבו מערבל רולר ב -4 ° c עד התפרקה לחלוטין.
    3. מסנן באמצעות מזרק 10 מ ל ו-0.22 יקרומטר מסנן מזרק.
  6. הכנת מדיום בינוני בלתי מושלם: neurobasal סיס מדיום ללא גלוטמין, 1X B27 (תמונה תלויית), 10% מחממים סרום הסוס, 2% חום המופעל fbs, 12.5 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין (0.25 x) ו 2 מ"מ גלוטמין. השתמש ריאגנטים סטרילי ולהכין את המדיום תחת תנאים סטריליים.
  7. הכינו מדיום בינונית להשלים (בתוספת גורמי צמיחה): למדיום לא שלם, להוסיף 5 Ng/ML gdnf ו 5 Ng/ML CNTF.

2. הכנת שמיכות זכוכית עבור צלחות 24-טוב

  1. מניחים את המספר הרצוי של שמיכות זכוכית בתוך מיכל עמיד חומצה ולהוסיף 65% חומצה חנקתית עד כל הכיסויים מתחת לפני השטח. מניחים את המיכל ב שייקר מסלולית ו-דגירה לילה בטמפרטורת החדר (RT) במהירות של 1000 סל ד.
  2. למחרת, בזהירות להעביר את החומצה החנקנית למאגר קטן וחנות לשימוש נוסף. חומצה חנקתית ניתן להשתמש מחדש 2-3x.
  3. בזהירות, להוסיף H מזוקקים2O כדי שמיכות כדי להסיר את החומצה החנקתית שנותרו. מניחים בעצבנות למשך 30 דקות, זורקים את פתרון הכביסה וחוזרים על 5x.
  4. לשטוף את הכיסויים עם 75% אתנול פעמיים.
  5. בזהירות נפרד ומקום שמיכות בודדים בארון מתכת מכוסה רדיד אלומיניום ו דגירה ב 50 º C עבור 10-15 דקות או עד באופן מלא יבש.
    הערה: אין לבצע כיסוי שמיכות זכוכית כפי שהם נדבקים זה לזה.
  6. לחטא את שמיכות תחת אור UV עבור 10-15 דקות. שמור על כיסוי סטרילי. לתרבות הרקמה העצבית

3. ציפוי שמיכות זכוכית לצלחות 24 שעות ביממה

  1. באמצעות tweezer סטרילי, המקום שמיכות אחד בכל טוב של הצלחת 24.
  2. הוסף 500 μL של 0.1 mg/mL PDL ו-דגירה לילה ב 37 ° c.
  3. למחרת, לשטוף את שמיכות פעמיים עם מזוקק H2O סטרילי. לאחר מכן, הוסף 500 μL של מים מזוקקים לכל שמיכות ולעזוב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. להיפטר המים ולהוסיף 350 μL של 10 μg/mL הפתרון בכל טוב.
  5. מניחים בחממה 37 ° c במשך 2 שעות.
  6. לפני ציפוי התא, להסיר את התמיסה למינציה ולשטוף פעמיים עם מדיום נוירובסיס רגיל.
    הערה: חשוב שהכיסויים לא יהיו יבשים בכל עת.
  7. הוסף 300 μL של בינוני מלא ולעזוב בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עד הציפוי הזמן. לפני הציפוי של תאים, הסר מדיום זה.

4. תרבות של גנגוליה מתוך עוף עובר (יום מעובז 7)

  1. חיתוך גנגליה (CG)
    1. להסיר ביצים מאינקובטור ולרסס אותם עם 75% אתנול.
      הערה: הביציות מאוחסנות ב-~ 16 ° c לפני היותה מודחלת ב-37.7 ° c במשך 7 ימים (או בשלב העובריים הרצוי). ביצים שמשמשות כאן. הן ממין עוף רוס
    2. חותכים את החלק העליון של הביצה עם מספריים ולהוציא את העובר באמצעות כפית. מניחים את העובר בצלחת פטרי עם HBSS קר קרח ומפרידים את הראש מהגוף על ידי חיתוך באזור הצוואר.
      הערה: ברגע שהעובר יוסר מן הביצה, הוא יכול לייצר פרוטסים האחראים למוות התאים. חשוב להפריד במהירות את הראש מן הגוף ברגע העובר מחוץ למעטפת כדי למזער את מוות התאים.
    3. שמרו על ראש העובר. בתוך הקרח הקר
    4. תחזיק את ראש העובר למעלה ותתקן אותו. במקור של האפרוח עם מלקחיים משנת 5 ואז עם n º 55 מלקחיים, להתחיל להסיר את השכבה הדק של העור סביב העין.
    5. הסר בזהירות את העין וסובב אותו כדי לגשת לחלק האחורי. , בזמן שהפרדת העין מראש האפרוח. הבחנתי בעצב הראייה מוכן זה יעזור להתאים את. הגנגליון הסילארי
    6. ברגע שהעין מופרדת, שמור אותו עם הצד האחורי ושים לב גנגליון החד הסמוך לעצב הראייה השולי ולסדק הדמית העין. העצב הטרום-גנגיוני עשוי עדיין להיות מחובר לגאנגליון הסיליברי, המקל על זיהויו.
    7. לנתח את גנגליון הסילארי מכל עין ולנקות טוב מאוד על ידי הסרת הרקמה העודפת סביב כל גנגליון.
      הערה: כדי לקבל תשואה של ~ 1x106 תאים/mL, נתח ~ 70 cgs. הינכם מתבקשים לשים לב כי אוכלוסיית התא המתקבלת מכילה גם תאים לא-עצביים. כדי להקטין את מספר התאים הלא-עצביים, וכתוצאה מכך, הגדילו את טוהר האוכלוסיה העצבית, חשוב מאוד לנקות את הגאנגליה הסילרית ככל האפשר, ולהסיר את כל הרקמה העודפת.
  2. דיסוציאציה ותרבות של גנגליה
    1. לאסוף את כל גרעינים כדי 15 מ ל שפופרת באמצעות פיפטה פלסטיק סטרילי פסטר.
      הערה: חשוב להרטיב מראש את הפיפטה הפסטר כדי למזער את ההחזקה של הגאנגליה לקיר הפיפטה.
    2. צנטריפוגה את הגאנגליה הסיליגיתבמשך 2 דקות ב 200 x g.
    3. בזהירות, להסיר את כל מדיום HBSS באמצעות פיפטה פסטר ולאחר מכן P1000 מיקרופיפטה. הוסף 1 מ ל של 0.1% טריפסין פתרון ו הדגירה למשך 20 דקות ב 37 ° c באמבט מים, ללא עצבנות.
    4. צנטריפוגה 2 דקות ב 200 x g.
    5. הסר באופן מיידי את התמיסה טריפסין והוסף 1 mL של אמצעי בינוני לא שלם.
      הערה: המדיום השלם מכיל סרום אשר יעצור באופן מיידי את השפעת טריפסין.
    6. צנטריפוגה 2 דקות ב 200 x g ולהסיר את כל המדיום.
    7. הוסף 350-500 μL של בינוני מלא.
      הערה: הנפח הדרוש כדי לנתק את התאים תלוי במספר גרעינים המתקבל, ובכך, על גודל גלולה שהושג. עבור ~ 70 CG מומלץ להשתמש 500 μL של בינוני.
    8. הנתק CGs על ידי ליטוף למעלה ולמטה 10-15x הראשון באמצעות P1000 ואחריו 10-15x באמצעות אש-מלוטש זכוכית פסטר. להימנע היווצרות בועות אוויר כדי למזער את אובדן התאים.
      הערה: השאר את ההשעיה התאית על הקרח עד לציפוי.
    9. קביעת הדחיסות התאית באמצעות פתרון כחול של טריבאואר ובחדר רגיל של נובאוור.
    10. צלחת 1 x 104 תאים/mL בכל באר של הצלחת 24-באר על ידי דילול הנפח המתאים של ההשעיה התא ב 500 μl של בינוני מלא (בתוספת עם 10 μm 5 '-fdu).
    11. התאים הדגירה ב 37 ° צ', 5% החממה CO2 .

5. אימונוציטוכימיה וניתוח תמונה של נוירונים סילברי

  1. בצע את השיטת האימונוציטוכימיה המוצגת במאמר זה כמתואר בעבר16,17.
  2. השתמש בנוגדנים העיקריים הבאים: מונושבטים בעכבר b-III טובולין (1:1000, T8578), עוף בטיים שבטים נוירופילמנט M (1:1000, AB5735), מונושבטים של העכבר SV2 (1:1000, AB2315387).
  3. כמו נוגדנים משנית, להשתמש אלקסה Fluor 568-עז מצומדת נגד העכבר נוגדנים (1:1000, A11031), אלקסה Fluor 568-עז מצומדת נגד העוף נוגדן (1:1000, A11041), אלקסה Fluor 647-עז מצומדת נגד העכבר נוגדנים (1:1000, A21235).
  4. שמיכות הר באמצעות הרכבה בינוני עם DAPI, עבור כתמים גרעיניים (P36935).

תוצאות

המשך המשוער של הליך זה תלוי בתשואה הדרושה עבור כל ניסוי מסוים, ולפיכך, על מספר גנגוליה הניתן לבידוד. עבור תשואה מוערכת של 1 x 106 תאים/mL, בודד סביב 70 ביצים (35). עבור מספר זה של ganglia, זה ייקח 2-3 שעות עבור הליך הניתוח ו סך של 4-5 שעות עבור ההליך הכולל. אילוסטרציה צעד-אחר-צעד של פרוטוקול הבידוד מוצ?...

Discussion

בפרוטוקול זה, הדגמנו כיצד להכין ותרבות CG הנוירונים. הזיהוי והניתוח של גנגאריה יכול להיות קשה עבור משתמשים לא מנוסים. לכן, אנו מציגים הליך מפורט צעד אחר צעד כדי לנתח ביעילות E7 צ'יק בחורה, הנתק את הרקמה ולהכין תרבויות נוירואליות כי ניתן לשמור לפחות 15 ימים. הנוירונים בתאי גנגאריה המתקבלים עם פ?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו ממומנת על ידי הקרן האירופית לפיתוח האזור (ERDF), באמצעות המרכז 2020 הפעילות האזורית במסגרת פרויקטים סנטרו-01-0145-פדר-000008: בריאות המוח 2020, CENTRO2020 CENTRO-01-0145-000003 פדר: עמוד, מרכז-01-0246-פדר-00018: MEDISIS, ודרך להתחרות 2020-תוכנית מבצעית לתחרותיות ובאינטראוליזציה ופורטוגזית כספים באמצעות FCT – Fundação באמצעות פרויקטים UIDB/04539/2020, UIDB/04501/2020, POCI-01-0145-פדר-022122: PPBI, לפטין/סאו-ניו/104100/2008, ומענקים בודדים SFRH/BD/141092/2018 (md), DL57/2016/CP1448/CT0009 (R.O.C.), SFRH/BD/77789/2011 (J.R.P.) ועל ידי פעולות מארי קירי-IRG, תוכנית המסגרת השביעית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU)Merck (Sigma Aldrich)F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibodyThermo Fisher ScientificA11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibodyThermo Fisher ScientificA11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibodyThermo Fisher ScientificA21235
B27 supplement (50x), serum freeInvitrogen (Gibco)17504-044
Chicken monoclonal neurofilament MMerck (Sigma Aldrich)AB5735
D-(+)-Glucose monohydrateVWR24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, BrazilInvitrogen (Gibco)10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biologyFisher Scientific10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand originInvitrogen (Gibco)26050-070
L-Glutamine (200 mM)Invitrogen (Gibco)25030-081
Mouse laminin ICultrex (R&D systems)3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulinMerck (Sigma Aldrich)T8578
Mouse monoclonal SV2DSHBAB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x)Thermo Fisher Scientific11874235
Neurobasal medium without glutamineInvitrogen (Gibco)21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL)Invitrogen (Gibco)15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell cultureMerck (Sigma Aldrich)P3532
Poly-D-LysineMerck (Sigma Aldrich)P7886
Potassium chlorideFluka (Honeywell Reaarch Chemicals)31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACSPanreac Applichem131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPIInvitrogen (Gibco)P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pkFisher Scientific10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF)Peprotech450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)Peprotech450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISOPanreac Applichem131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma gradePanreac Applichem141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x)Thermo Fisher11360039
Syringe without needle, 10 mLThermo Fisher11587292
Trypsin 1:250 powderInvitrogen (Gibco)27250-018

References

  1. Betz, W. The Formation of Synapses between Chick Embryo Skeletal Muscle and Ciliary Ganglia Grown in vitro. Journal of Physiology. 254, 63-73 (1976).
  2. Fischbach, G. D. Synapse Formation between Dissociated Nerve and Muscle Cells in Low Density Cell Cultures. Developmental Biology. 28, 407-429 (1972).
  3. Bernstein, B. W. Dissection and Culturing of Chick Ciliary Ganglion Neurons: A System well Suited to Synaptic Study. Methods in Cell Biology. 71, 37-50 (2003).
  4. Marwitt, R., Pilar, G., Weakly, J. N. Characterization of Two Ganglion Cell Populations in Avian Ciliary Ganglia. Brain Research. 25, 317-334 (1971).
  5. Role, L. W., Fishbach, G. D. Changes in the Number of Chick Ciliary Ganglion. Neuron Processes with Time in Cell Culture. Journal of Cell Biology. 104, 363-370 (1987).
  6. Landmesser, L., Pilar, G. Synaptic Transmission and Cell Death During Normal Ganglionic Development. Journal of Physiology. , 737-749 (1974).
  7. Koszinowski, S., et al. Bid Expression Network Controls Neuronal Cell Fate During Avian Ciliary Ganglion Development. Frontiers in Physiology. 9, 1-10 (2018).
  8. Landmesser, L., Pilar, G. Synapse Formation During Embryogenesis on Ganglion Cells Lacking a Periphery. Journal of Physiology. 241, 715-736 (1974).
  9. Nishi, R., Berg, D. K. Dissociated Ciliary Ganglion Neurons in vitro: Survival and Synapse Formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5171-5175 (1977).
  10. Nishi, R., Berg, D. K. Two Components from Eye Tissue that Differentially Stimulate the Growth and Development of Ciliary Ganglion Neurons in Cell Culture. Journal of Neuroscience. 1, 505-513 (1981).
  11. Pilar, G., Vaughan, P. C. Electrophysiological Investigations of the Pigeon iris Neuromuscular Junctions. Comparative Biochemistry and Physiology B. 29, 51-72 (1969).
  12. Landmesser, L., Pilar, G. Selective Reinnervation of Two Cell Populations in the Adult Pigeon Ciliary Ganglion. Journal of Physiology. , 203-216 (1970).
  13. Pinto, M. J., Almeida, R. D. Puzzling Out Presynaptic Differentiation. Journal of Neurochemistry. 139, 921-942 (2016).
  14. Dryer, S. E. Functional Development of the Parasympathetic Neurons of the Avian Ciliary Ganglion: A Classic Model System for the Study of Neuronal Differentiation and Development. Progress in Neurobiology. 43, 281-322 (1994).
  15. Egawa, R., Yawo, H. Analysis of Neuro-Neuronal Synapses using Embryonic Chick Ciliary Ganglion via Single-Axon Tracing, Electrophysiology, and Optogenetic Techniques. Current Protocols in Neuroscience. 87, 1-22 (2019).
  16. Pinto, M. J., Pedro, J. R., Costa, R. O., Almeida, R. D. Visualizing K48 Ubiquitination during Presynaptic Formation by Ubiquitination-Induced Fluorescence Complementation (UiFC). Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 1-19 (2016).
  17. Martins, L. F., et al. Mesenchymal Stem Cells Secretome-Induced Axonal Outgrowth is Mediated by BDNF. Scientific Reports. 7, 1-13 (2017).
  18. Nishi, R. Autonomic and Sensory Neuron. Methods in Cell Biology. , 249-263 (1996).
  19. Rojo, J. M., De Ojeda, G., Portolés, P. Inhibitory Mechanisms of 5-fluorodeoxyuridine on Mitogen-induced Blastogenesis of Lymphocytes. International Journal of Immunopharmacology. 6, 61-65 (1984).
  20. Hui, C. W., Zhang, Y., Herrup, K. Non-Neuronal Cells are Required to Mediate the Effects of Neuroinflammation: Results from a Neuron-Enriched Culture System. PLoS One. 11, 1-17 (2016).
  21. Crain, S. M., Alfei, L., Peterson, E. R. Neuromuscular Transmission in Cultures of Adult Human and Rodent Skeletal Muscle After Innervation in vitro by Fetal Rodent Spinal Cord. Journal of Neurobiology. 1, 471-489 (1970).
  22. Kano, M., Shimada, Y. Innervation and Acetylcholine Sensitivity of Skeletal Muscle Cells Differentiated in vitro from Chick Embryo. Journal of Cellular Physiology. 78, 233-242 (1971).
  23. Robbins, N., Yonezawa, T. Developing Neuromuscular Juctions: First Sings of Chemical Transmission during Formation in Tissue Culture. Science. 80, 395-398 (1971).
  24. Squire, L. R. . Encyclopedia of Neuroscience. , (2010).
  25. Hooisma, J., Slaaf, D. W., Meeter, E., Stevens, W. F. The Innervation of Chick Striated Muscle Fibers by the Chick Ciliary Ganglion in Tissue Culture. Brain Research. 85, 79-85 (1975).
  26. Morrison, B. M. Neuromuscular Diseases. Seminars in Neurology. , 409-418 (2016).
  27. Davies, A. M. The Trigeminal System: An Advantageous Experimental Model for Studying Neuronal Development. Development. 103, 175-183 (1988).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

162

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved