Isolamento e cultura dei neuroni del Ganglione Ciliario

Riepilogo

I gangli ciliari (CG) fanno parte del sistema nervoso parasimpatico. Le colture neuronali dei neuroni CG del pulcino hanno dimostrato di essere modelli cellulari efficaci nello studio delle interazioni nervose del nervo. Descriviamo un protocollo dettagliato per la dissezione, la dissociazione e la cultura in vitro dei neuroni CG da embrioni di pulcino.

Abstract

I gangli ciliari (CG) fanno parte del sistema nervoso parasimpatico e sono responsabili dell'innervazione dei tessuti muscolari presenti nell'occhio. Questo ganglio è costituito da una popolazione omogenea di neuroni ciliari e conoidi che innervare fibre muscolari striate e lisce, rispettivamente. Ognuno di questi tipi neuronali regolano specifiche strutture e funzioni oculari. Nel corso degli anni, le colture neuronali dei gangli ai pulcini hanno dimostrato di essere efficaci modelli cellulari nello studio delle interazioni muscolo-nervosa del sistema, che comunicano attraverso le sinapsi colinergiche. I neuroni gangliari ciliari sono, nella sua maggioranza, colinergici. Questo modello cellulare ha dimostrato di essere utile in modo comparativo a modelli cellulari eterogenei usati in precedenza che comprendono diversi tipi neuronali, oltre al colinergico. Anatomicamente, il ganglio ciliare è localizzato tra il nervo ottico (ON) e la fessura corale (CF). Qui, descriviamo una procedura dettagliata per la dissezione, la dissociazione e la coltura in vitro dei neuroni gangliari ciliari da embrioni di pulcino. Forniamo un protocollo passo-passo al fine di ottenere colture cellulari altamente pure e stabili di neuroni CG, evidenziando le fasi chiave del processo. Queste culture possono essere mantenute in vitro per 15 giorni e, con la presente, mostriamo il normale sviluppo delle culture CG. I risultati mostrano anche che questi neuroni possono interagire con le fibre muscolari attraverso sinapsi colinergiche neuro-muscolari.

Introduzione

I neuroni gangliari cigliari (CG) appartengono al sistema nervoso parasimpatico. Questi neuroni sono colinergici, essendo in grado di stabilire sinapsi muscariche o nicotiniche^1,2,3. Anatomicamente, il CG si trova nella parte posteriore dell'occhio tra il nervo ottico (ON) e la fessura contoide (CF) e consiste di circa 6000 neuroni nei primi stadi embrionali^1,4. Per la prima settimana di cultura, i neuroni gangliari ciliari presentano una morfologia multipolare. Dopo una settimana, iniziano a passare a uno stato unipolare, con un neurite che estende e forma l'assone⁵. Inoltre, circa la metà dei neuroni CG muore tra l'8^e il 14^esimo giorno di sviluppo dell'embrione del pulcino, attraverso un processo programmato di morte cellulare. Questa diminuzione del numero di neuroni si traduce in una popolazione totale del ganglio ciliare di circa 3000 neuroni^6,7,8. In vitro, non c'è nessuna riduzione del numero di neuroni CG quando coltivato con le cellule muscolari⁹ e neuroni CG possono essere coltivati per diverse settimane^1,9.

Il ganglio ciliario è costituito da una popolazione omogenea di neuroni ciliari e neuroni conoidi, ognuno dei quali rappresenta la metà della popolazione neuronale nel CG, innervando il muscolo dell'occhio. Questi due tipi di neuroni sono strutturalmente, anatomicamente e funzionalmente distinti. I neuroni ciliari innervano le fibre muscolari striate sull'iride e sulla lente, essendo responsabili della contrazione della pupilla. I neuroni chioidali innervano il muscolo liscio della contoide^1,10,11,12.

Le colture di neuroni gangliari ciliari di pollo hanno dimostrato di essere strumenti utili per lo studio delle sinapsi neuromuscolari e della formazione di sinapsi^1,5,9. Considerando che le sinapsi neuromuscolari sono colinergiche¹³, utilizzando una popolazione neuronale che è colinergico – neuroni CG – emerso come una potenziale alternativa ai modelli cellulari precedenti¹⁴. Questi modelli consistevano in una popolazione neuronale eterogenea, in cui solo una piccola parte è colinergica. In alternativa, i neuroni gangliari ciliari si sviluppano relativamente veloce in vitro, e dopo circa 15 ore già formano sinapsi¹. I neuroni CG sono stati utilizzati come sistema modello nel corso degli anni per studi di ricerca distinti, a causa della sua relativamente facilità di isolamento e manipolazione. Queste applicazioni includono studi optogenetici, sviluppo di sinapsi, apoptosi e interazioni neuromuscolari^14,15.

Descriviamo una procedura dettagliata per la dissezione, la dissociazione e la coltura in vitro dei neuroni gangli ciliari provenienti dagli embrioni embrionali 7 (E7). Forniamo un protocollo passo-passo al fine di ottenere colture cellulari altamente pure e stabili di neuroni colinergici. Mettiamo inoltre in evidenza i passaggi chiave del protocollo che richiedono particolare attenzione e che miglioreranno la qualità delle colture neuronali. Queste culture possono essere mantenute in vitro per almeno 15 giorni.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

NOTA: I materiali necessari per questa procedura sono i seguenti: pinze (no 5 e no 55), pinzette chirurgiche, piatti Petri dissezione (fondo nero), piastrine di 24 pozzetti, pipetta pasteur in plastica, pasteur pipetta in vetro lucidato, siringa da 10 mL, filtro siringa 0,22 m.

1. Preparare e sterilizzare tutto il materiale necessario per il protocollo, tra cui coperture in vetro, pinze (no 5 e no 55), pinzette chirurgiche, piatti Petri (fondo nero), distillati H₂O, pipette e materiale per la chirurgia.
2. Preparare la soluzione PDL (Poly-D-Lysine) da 0,1 mg/mL.
   1. Ricostituire PDL in buffer di ritassio da 0,1 M (pH 8,2) a una concentrazione di 1 mg/mL (soluzione 10x).
   2. Diluire 1:10 in 166,6 mM di tampone di ricambio (pH 8,2) per ottenere una concentrazione finale di 0,1 mg/mL.
3. Preparare la soluzione lamin a 10 g/mL.
   1. Diluire 1 mg/mL di laminina in media neurobasale semplice per una concentrazione finale di 10 g/mL.
4. Preparare Hank's Balanced Salt Solution (HBSS): 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 4,16 mM NaHCO3, 0,34 mM Na₂HPO₄2H₂O, 5 mM di glucosio, 1 mM di pireva di sodio, 10 mM di buffer HEPES, 0,01% di fenolo rosso. Regolare pH a 7.2.
5. Preparare la soluzione trypsin dello 0,1%.
   1. Sciogliere 5 mg di trypsin 1:250 polvere in 5 mL di HBSS per una concentrazione finale di 0.1%.
   2. Mettere in un miscelatore a rulli a 4 gradi centigradi fino a completa dissoluzione.
   3. Filtrare utilizzando una siringa da 10 mL e un filtro di siringa da 0,22 m.
6. Preparare gangli cilia incompleto medio: mezzo neurobasale senza glutammina, 1X B27 (foto-sensibile), 10% siero di cavallo inattivato dal calore, 2% di FBS inattivato dal calore, 12,5 U/mL penicillina/streptomicina (0,25x) e 2 mM di glutammina. Utilizzare reagenti sterili e preparare il mezzo in condizioni sterili.
7. Preparare gangli a livello ciliario mezzo completo (integrato con fattori di crescita): al mezzo incompleto, aggiungere 5 ng/mL GDNF e 5 ng/mL CNTF.

2. Preparazione di vetro coprelips per piastre 24-bene

1. Posizionare il numero desiderato di coperture in vetro all'interno di un contenitore resistente all'acido e aggiungere 65% acido nitrico fino a quando tutti i copricopro sono sommersi. Mettere il contenitore in uno shaker orbitale e incubare durante la notte a temperatura ambiente (RT) ad una velocità di 1000 rpm.
2. Il giorno successivo, trasferire attentamente l'acido nitrico in un piccolo serbatoio e conservare per un ulteriore uso. L'acido nitrico può essere riutilizzato 2-3x.
3. Attentamente, aggiungere distillato H₂O ai coperchii per rimuovere l'acido nitrico rimanente. Mettere in agitazione per 30 minuti, scartare la soluzione di lavaggio e ripetere questo 5x.
4. Sciacquare i copriletti con il 75% di etanolo due volte.
5. Separare con cura e posizionare i singoli copricopre in una cremagliera metallica ricoperta di lamina di alluminio e incubare a 50 oC per 10-15 minuti o fino a quando completamente asciutto.
   NOTA: Non autoclave vetro coprelips come si attaccano l'uno all'altro.
6. Sterilizzare i copriletti sotto la luce UV per 10-15 minuti. Mantenere coverlips sterile per la coltura del tessuto neuronale.

3. Rivestimento di vetro coprelips per piastre 24-well

1. Utilizzando una pinzetta sterile, posizionare un coperchio in ogni pozzetto di una piastra di 24 pozzetti.
2. Aggiungete 500 l di 0,1 mg/mL PDL e incubate peruna pernottamento a 37 gradi centigradi.
3. Il giorno successivo, sciacquare le coverlips due volte con sterile distillato H₂O. Quindi, aggiungere 500 l di acqua distillata ad ogni coverslip e lasciare agire per 30 minuti a temperatura ambiente.
4. Scartare l'acqua e aggiungere 350 gradi di soluzione di laminina da 10 g/mL in ogni pozzo.
5. Mettere in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 2 h.
6. Prima della placcatura cellulare, rimuovere la soluzione di laminina e lavare due volte con un semplice mezzo neurobasale.
   NOTA: È importante che i coperchi non si asciughino in qualsiasi momento.
7. Aggiungere 300 l di mezzo completo e lasciare in un'incubatrice a 37 gradi centigradi e il 5% di CO₂ fino al tempo di placcatura. Prima di placcare le cellule, rimuovere questo mezzo.

4. Cultura di gangli ciliari da embrione di pollo (giorno embrionale 7)

1. Dissezione degli gangli ciliari (CG)
   1. Togliere le uova dall'incubatrice e spruzzarle con il 75% di etanolo.
      NOTA: Le uova vengono conservate a 16 gradi centigradi prima di essere incubate a 37,7 gradi centigradi per 7 giorni (o allo stadio embrionale desiderato). Le uova usate qui sono delle specie di pollo di Ross.
   2. Tagliare la parte superiore dell'uovo con una forbice e togliere l'embrione con un cucchiaio. Mettere l'embrione in una tela Petri con HBSS ghiacciata e separare la testa dal corpo tagliando la regione del collo.
      NOTA: Non appena l'embrione viene rimosso dall'uovo, può produrre proteasi responsabili della morte cellulare. È importante separare rapidamente la testa dal corpo una volta che l'embrione è al di fuori del guscio per ridurre al minimo la morte cellulare.
   3. Tenere la testa dell'embrione nell'HBSS ghiacciato.
   4. Tenere la testa dell'embrione e fissarlo nel becchino del pulcino con no 5 pinze. Poi con no 55 pinze, iniziare a rimuovere il sottile strato di pelle intorno all'occhio.
   5. Rimuovere con attenzione l'occhio e ruotarlo per accedere alla parte posteriore. Mentre separa l'occhio dalla testa del pulcino, notare il nervo ottico sezionato. Questo aiuterà a localizzare il ganglio ciliare.
   6. Una volta che l'occhio è separato, tenerlo con il lato posteriore verso l'alto e notare il ganglio ciliare adiacente al nervo ottico sezionato e la fessura della contoide. Il nervo preganglionico potrebbe ancora essere attaccato al ganglio ciliario, che ne facilita l'identificazione.
   7. Dissezionare il ganglio ciliare da ogni occhio e pulire molto bene rimuovendo il tessuto in eccesso intorno a ogni ganglio.
      NOTA: Per avere un rendimento di 1x10⁶ celle / mL, dissezionare 70 CG. Si prega di notare che la popolazione cellulare ottenuta contiene cellule non neuronali pure. Per diminuire il numero di cellule non-neuronali e, di conseguenza, aumentare la purezza della popolazione neuronale, è molto importante pulire i gangli ai cilia il più possibile, rimuovendo tutto il tessuto in eccesso.
2. Dissociazione e cultura dei gangli ciliari
   1. Raccogli tutti gli gangli ciliari in un tubo da 15 mL usando una pipetta Pasteur in plastica sterile.
      NOTA: È importante pre-bagnare la pipetta Pasteur per ridurre al minimo l'attaccamento dei gangli alla parete della pipetta.
   2. Centrifugare gli gangli ciliari per 2 minuti a 200 x g.
   3. Rimuovere con attenzione tutto il mezzo HBSS utilizzando una pipetta Pasteur e poi una micropipetta P1000. Aggiungere 1 mL di 0,1% soluzione di prova e incubare per 20 minuti a 37 gradi centigradi in un bagno d'acqua, senza agitazione.
   4. Centrifuga per 2 minuti a 200 x g.
   5. Rimuovere immediatamente la soluzione trypsin e aggiungere 1 mL di mezzo incompleto.
      NOTA: Il supporto incompleto contiene il siero che interromperà immediatamente l'effetto della trypsin.
   6. Centrifuga per 2 minuti a 200 x g e rimuovere tutto il mezzo.
   7. Aggiungere 350-500 l di mezzo completo.
      NOTA: Il volume necessario per dissociare le cellule dipende dal numero di gangli ciliari ottenuti e, quindi, dalla dimensione del pellet ottenuta. Per 70 CG si consiglia di utilizzare 500 .
   8. Dissociare i CG pipettando su e giù 10-15volte utilizzando prima un P1000 seguito da 10-15x utilizzando una pasteurpipe in vetro lucidato al fuoco. Evitare la formazione di bolle d'aria per ridurre al minimo la perdita di cellule.
      NOTA: Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio fino alla placcatura.
   9. Determina la densità cellulare utilizzando una soluzione blu Trypan e una camera Neubauer standard.
   10. Piastra 1 x 10⁴ celle/mL in ogni pozzo della piastra di 24 pozze di scalo diluindo il volume appropriato della sospensione cellulare in 500 - L di mezzo completo (completato con 10 M 5'-FDU).
   11. Incubare le cellule in un incubatore di CO₂ a 37 gradi centigradi.

5. Immunocitochimica e analisi delle immagini dei neuroni ciliari

1. Eseguire il saggio di immunocitochimica presentato in questo articolo come descritto in precedenza^16,17.
2. Utilizzare i seguenti anticorpi primari: tubulina b-III monoclonale del topo (1:1000, T8578), neurofilamento monoclonale di pollo M (1:1000, AB5735), topo monoclonale SV2 (1:1000, AB2315387).
3. Come anticorpi secondari, utilizzare Alexa Fluor 568-coniugato capra anti-toro anticorpo (1:1000, A11031), Alexa Fluor 568-coniugato capra anti-pollo anticorpo (1:1000, A11041), Alexa Fluor 647-concatenato capra anti-tono anti-tono anti-tono anti-tono (1:10000, A2151).
4. Montare i coprilabbra utilizzando un supporto di montaggio con DAPI, per la colorazione nucleare (P36935).

Risultati

La durata stimata di questa procedura dipende strettamente dalla resa necessaria per ogni esperimento specifico e, di conseguenza, dal numero di gangli ciliari che devono essere isolati. Per una resa stimata di 1 x 10⁶ cellule/mL, isolare circa 70 gangli ciliari (35 uova). Per questo numero di gangli, ci vorranno 2-3 ore per la procedura di dissezione e un totale di 4-5 ore per la procedura totale. Un'illustrazione dettagliata del protocollo di isolamento è illustrata nella Figura 1A

Discussione

In questo protocollo, abbiamo dimostrato come preparare e cultura neuroni CG. L'identificazione e la dissezione del ganglio ciliario può essere difficile per gli utenti inesperti. Pertanto, presentiamo una procedura dettagliata e graduale per sezionare in modo efficiente i gangli ciliari dei pulcini E7, dissociare il tessuto e preparare colture neuronali che possono essere mantenute per almeno 15 giorni. I neuroni gangliari ciliari ottenuti con questo protocollo sono adatti anche per la co-coltura con le cellule muscola...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluoro-2’-deoxiuridina (5'-FDU)	Merck (Sigma Aldrich)	F0503
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-chicken antibody	Thermo Fisher Scientific	A11041
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11031
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A21235
B27 supplement (50x), serum free	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Chicken monoclonal neurofilament M	Merck (Sigma Aldrich)	AB5735
D-(+)-Glucose monohydrate	VWR	24371.297
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, Brazil	Invitrogen (Gibco)	10270-106
HEPES, fine white crystals, for molecular biology	Fisher Scientific	10397023
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin	Invitrogen (Gibco)	26050-070
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
Mouse laminin I	Cultrex (R&D systems)	3400-010-02
Mouse monoclonal b-III tubulin	Merck (Sigma Aldrich)	T8578
Mouse monoclonal SV2	DSHB	AB2315387
Multidishes, cell culture treated, BioLite, MW24 (50x)	Thermo Fisher Scientific	11874235
Neurobasal medium without glutamine	Invitrogen (Gibco)	21103-049
Penicillin/streptomycin (5,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15070-063
Phenol red, bioreagent, suitable for cell culture	Merck (Sigma Aldrich)	P3532
Poly-D-Lysine	Merck (Sigma Aldrich)	P7886
Potassium chloride	Fluka (Honeywell Reaarch Chemicals)	31248-1KG
Potassium di-hydrogen phosphate (KH2PO4) for analysis, ACS	Panreac Applichem	131509-1000
Prolong Gold Antifade mounting medium with DAPI	Invitrogen (Gibco)	P36935
Puradisc FP 30mm Syringe Filter, Cellulose Acetate, 0.2µm, sterile 50/pk	Fisher Scientific	10462200
Recombinant human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Peprotech	450-13
Recombinant human glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)	Peprotech	450-10
Sodium chloride for analysis, ACS, ISO	Panreac Applichem	131659-1000
Sodium dihydrogen phosphate 2-hydrate (Na2HPO4·2H2O), pure, pharma grade	Panreac Applichem	141677-1000
Sodium Pyruvate 100 mM (100x)	Thermo Fisher	11360039
Syringe without needle, 10 mL	Thermo Fisher	11587292
Trypsin 1:250 powder	Invitrogen (Gibco)	27250-018