JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים פרוטוקול פשוט לבידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי מדם שלם המתקבל מחולים שאובחנו עם תסמונת סזארי, ולאחר מכן בחירה של תאי CD4+ T, הגירוי שלהם עם phorbol12-myristate13-acetate ו-A23187 ionophore, והכנת RNA ליצירת פרופיל שעתוק.

Abstract

לימפומות של תאי T עוריים (CTCL) נגזרות מהטרנספורמציה וההתפשטות הבלתי מבוקרת של תאי T בוגרים ביות העור, ופטריות מיקוזיס (MF) ותסמונת סזארי (SS) מייצגות את תת-הסוגים הנפוצים ביותר. למרות מספר מחקרים על אפיון ביטוי גנים, שינויים גנטיים והפרעות אפיגנטיות של CTCL, הפתוגנזה המולקולרית של MF/SS עדיין אינה ברורה. MF מתייחס ל-CTCL הנפוץ יותר עם דומיננטיות בעור, ובדרך כלל מוגבל לעור, בעוד ש-SS הוא גרסה לוקמית אגרסיבית של CTCL עם מעורבות נרחבת בעור ומאופיין בהתפלגות ניאופלסטית המערבת בעיקר דם, עור וצומת לימפה. תוך התמקדות בפרקטיקה הקלינית, לזיהוי סמנים ביולוגיים לביטוי גנים יש פוטנציאל עצום לשיפור האבחון והטיפול ב-MF/SS. ואכן, מחקרי תעתיק שנערכו לאחרונה זיהו סמנים ביולוגיים אבחנתיים פוטנציאליים מהבדלים בביטוי גנים בין תאי T תקינים וממאירים, שעשויים לשפר את הבנתנו את הביולוגיה של האס-אס, ולחשוף מטרות טיפוליות פוטנציאליות. כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט הניתן לשחזור לבידוד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי מדם שלם טרי מחולים שאובחנו עם SS, בחירה של תאי T בזיכרון CD4+ (תאי CD4+CD45RO+ T), גירוי כימי והכנת רנ"א המתאים לפרופיל שעתוק כדי לגלות סמנים מולקולריים פרוגנוסטיים חדשים כדי לקבל תובנה נוספת באטיולוגיה של מחלות. הגירוי באמצעות אגוניסט כימי להפעלת ויסות גרעיני מספק הערכה ספציפית יותר למסלולים החשובים בוויסות שעתוק דינמי ובביטוי גנים ומבטל פגמים מבלבלים שעלולים לנבוע מפגמי איתות במעלה הזרם הנובעים מאובדן אנטיגן TCR בקרום התא. הנתונים המתקבלים מהשוואת תעתיק של תאי SS T לא מגורה לגירוי חושפים פגמים תפקודיים בביטוי גנים רגולטוריים שאינם ניכרים מניתוח של תאים לא מגירים. יתר על כן, ניתן להתאים את השיטה המתוארת מגישה זו לחקר פגמים בביטוי גנים של תאי T במחלות חיסוניות אחרות של תאי T.

Introduction

לימפומה עורית של תאי T (CTCL), הכוללת את תת-הסוגים הנפוצים ביותר של פטריות מיקוזיס (MF) ותסמונת סזארי (SS), היא קבוצה הטרוגנית של מחלות שמקורן בטרנספורמציה ובהתפשטות בלתי מבוקרת של תאי T בוגרים ביות העור 1,2. לתאי ה-T הניאופלסטיים יש CD4+CD45RO+בוגר, פנוטיפ זיכרון3, וסמני הידבקות מביעים את העור, מה שמגדיל את האפידרמוטרופיזם4, המתבטא בפריחה במיוחד במחלה מוקדמת. הקורס הקליני של MF הוא לעתים קרובות indolent כאשר תחת טיפול מנוהל שגרתי, אבל תת קבוצה של חולים יכולים להתקדם למחלה מתקדמת יותר. במקרים אלה של MF, נגעים בעור גדלים ומתעבים לגידולים גדולים, ותאי T ניאופלסטיים עשויים להתפשט לבלוטות לימפה ואיברים קרביים. לעומת זאת, SS היא גרסה אגרסיבית יותר, לוקמית יותר, של CTCL5, המאופיינת בשלישייה של תסמינים: אריתרודרמה כללית (המוגדרת כמשפיעה על >80% משטח הפנים הכולל של הגוף), לימפדנופתיה, ונוכחות של יותר מ-1000/מ"מ3 תאי T לא טיפוסיים קלונליים במחזור הדם עם גרעינים מוחיים, מה שנקרא תאי סזארי 6,77 . הפרוגנוזה לחולי SS גרועה משמעותית מ- MF. SS הוא נדיר עם שיעור תחלואה של 0.1/100,000, והוא מייצג כ-3% מכלל מקרי ה-CTCL 8,9. CTCL מופיע בדרך כלל אצל מבוגרים עם גיל חציוני של כ -60 שנים10. שיעור ההיארעות של CTCL עלה ובעוד הסיבה אינה ברורה, השיעור התייצב מאז 199811,12.

הפתוגנזה המולקולרית של SS עדיין אינה ברורה. מחקרים גנטיים, אפיגנטיים וביטוי גנים הניבו שפע של נתונים חדשים, אולם עדיין קיימים ממצאים לא עקביים, בעיקר בשל קבוצות המטופלים הקטנות שנחקרו2, כמו גם הבדלים בתכנון הניסויים ובאוכלוסיות הבקרה13,14. אפיון גנומי ותעתיק משופר עשוי לשפוך אור הן על מנגנוני המחלה והן על מטרות טיפוליות שלא נחקרו בעבר. לכן, יש צורך במחקרים נוספים מאוכלוסיית חולים גדולה יותר כדי להבין טוב יותר את הממאירות ההטרוגנית הזו. לוחות סמנים ביולוגיים רגישים וספציפיים מאוד בקבוצת SS אחת הציגו ביצועים פחות אחידים בקבוצות אחרות15, מה שמהווה מכשול רציני בפיתוח סמנים ביולוגיים אבחנתיים ופרוגנוסטיים אמינים עבור SS16. סמנים ביולוגיים אבחנתיים אידיאליים יבואו לידי ביטוי יתר באופן עקבי ומאוד גבוה בתאי T ממאירים, בעוד שהם נעדרים או כמעט נעדרים בתאי Tתקינים 17. גילוי סמנים ביולוגיים ספציפיים למחלה חשוב לקידום פרוטוקולים אבחוניים וטיפוליים עבור SS.

נתוני תעתיק באיכות גבוהה עבור תאי T ממאירים ונורמליים כאחד דורשים גישה יעילה ואמינה להכנת דגימה. כאן נדון באסטרטגיה מפורטת אך פשוטה להשגת דגימות RNA מאוכלוסיות תאי T הרלוונטיות ל-SS. נדון בבידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMC) מדם שלם, בבחירה מגנטית שלילית של אוכלוסיות תאי T CD4+CD45RO+ הרלוונטיות למחלות, בהפעלה כימית כדי לחשוף הבדלים בתגובות תפקודיות ובהכנת RNA ליצירת פרופיל תעתיק. בפרוטוקול הנוכחי, ההפעלה הכימית בוצעה באמצעות פורבול מיריסטאט אצטט (PMA) וסידן יונופור (A23187)18,19, מכיוון שמחקרים קודמים הראו איתות לקוי של קולטן תאי T ב-CTCL, וגירוי עם PMA/A23187 עוקף את קולטן תאי ה-T20,21. כמו כן, PMA/A23187 מאפשר הפעלה פרוקסימלית ישירה יותר של אותות גרעיניים הדרושים להפעלת גנים של ציטוקינים. לבסוף, גירוי של תאי T מספק רמה נוספת של תובנה לגבי ויסות ביטוי הגנים שלא ניתן היה להשיג מתאי T נחים שבהם נעדר שינוי דינמי.

Protocol

תאים אנושיים הם בעלי פוטנציאל מדבק. לכן, הניסויים מבוצעים אך ורק בהתאם לאמצעי הזהירות והנהלים הנדרשים שנדונו כמינהל בטיחות ובריאות תעסוקתית (OSHA) וציוד הגנה אישי (PPE).

1. בידוד של PBMCs מדם שלם

  1. אסוף את כל החומרים הדרושים מטבלה 1 והבא אותם לטמפרטורת החדר (RT). חם RP10F עד 37 °C (84 °F). התאם צנטריפוגה ל- RT. למעט צנטריפוגות וספירת תאים, בצע את כל השלבים באמצעות תאים בני קיימא בארון בטיחות ביולוגי.
  2. להשיג דם בחמישה צינורות 10 מ"ל (הכמות הרצויה) המכילים נוגדי קרישה. אחסנו את כל הדם בטמפרטורת הסביבה (18\u201224 °C). סמן צינורות הפרדה של 50 מ"ל עם מספר נושא המחקר האנושי לעיבוד דגימת הדם.
  3. העברת 10\u201215 מ"ל של דם לכל צינור(ים) הפרדה עם מספר הנושא התואם. יש לדלל את הדם לפחות פי 2 בעזרת תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS). אין לחרוג מ-35 מ"ל דם מדולל לכל צינור.
  4. בזהירות ובאיטיות מתחת לדם עם כ-13 מ"ל של מדיום צפיפות. שימו לב דרך מדיום הצפיפות השקוף בתחתית הצינור, והפסיקו לצנרת כאשר הפיפטה כמעט ריקה (כדי למנוע שחרור בועות). יש להסיר בזהירות את הפיפטה כדי למנוע ערבוב של שכבות דם וצפיפות בינונית.
  5. העבר בזהירות את צינורות ההפרדה המלאים לצנטריפוגה מבלי להפריע לשכבות.
  6. צנטריפוגה ב 500 x g במשך 30 דקות עם בלם צנטריפוגה כבוי (האטה מוגדרת לאפס).
    הערה: אם הצנטריפוגה מציגה רק סל"ד, עיין במפרטי הרוטור כדי להעריך את הסל"ד שווה ערך ל-500 x גרם.
  7. הסר בזהירות את צינורות ההפרדה מהצנטריפוגה מבלי להפריע לשכבות. שימו לב לפרווה הבאפית, שנוצרה בין מדיום הצפיפות לשכבות הפלזמה.
  8. פיפטה מלמעלה כדי להסיר ולהשליך את רוב שבר הפלזמה העליון, כך ש-10 מ"ל נשאר מעל ציפוי הבאפי. בזהירות ובאיטיות לאסוף את המעיל הבאפי. העבירו את ציפויי הבאפי משני צינורות הפרדה לצינור חדש עם תווית מוקדמת וסטרילית של 50 מ"ל, כפי שניתן לראות באיור 1.
  9. דיללו את מחשבי ה-PBMCs לפחות פי 2 באמצעות HBSS, והביאו את הנפח בכל צינור חדש עד 50 מ"ל. זכור להחליף את בלם הצנטריפוגה במלואו. PBMCs כדוריים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g במשך 10 דקות. מוציאים את ה-supernatant ככל האפשר ומקישים על החלק התחתון של הצינור כדי לשחרר את הכדור.
  10. כדי להפוך את שאריות תאי הדם האדומים (RBC), יש להחיות כל כדור תא ב-1\u20122 מ"ל של חיץ ליזה של אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) לכל נפח דם מקורי של 10 מ"ל. דגירה למשך 5 דקות בדיוק. הפסק מיד את הליזיס עם נפח שווה או גדול יותר של HBSS והתאם את עוצמת הקול ל- 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 400 x g במשך 10 דקות.
  11. הסר את ה-supernatant והקש על החלק התחתון של הצינור כדי לשחרר את גלולת התא. תאי בריכה מאותו תורם. העלה נפח של עד 50 מ"ל עם HBSS. צנטריפוגה ב 400 x g במשך 10 דקות.
  12. הסר את ה-supernatant והקש על החלק התחתון של הצינור כדי לשחרר את גלולת התא. יש לבצע החייאה של תאים ב-10 מ"ל של מדיום RP10F חם, ולקחת אליקוט לצורך ספירת תאים בת קיימא באמצעות טריפאן כחול.
  13. חשב את מספר התא הכולל בכל דגימה באמצעות המוציטומטר.

2. טיהור תאי CD4+CD45RO+ T מ-PBMCs

הערה: טיהור תאי CD4+CD45RO+ T מ-PBMCs נעשה באמצעות הפרדה מגנטית זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) עם שינויים קלים. עדיף לעקוב אחר מדריך הערכה לזמן הדגירה מכיוון שלכל ערכה מסחרית יש הוראות משלהם.

  1. לשטוף את הכמות הרצויה של PBMCs ב 10 מ"ל של מאגר בחירה. צנטריפוגה ב 400 x g במשך 10 דקות. הסר את הסופרנטנט והקש על החלק התחתון של הצינור כדי לשחרר את הכדור.
  2. דיללו את מחשבי ה-PBMCs ל-5 x 107 תאים/מ"ל במאגר בחירה והעבירו אותם ל-5 מ"ל של צינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה (12 x 75 מ"מ).
  3. מוסיפים 50 μL של קוקטייל נוגדנים לכל 1 מ"ל של דגימה, ומערבבים בעדינות. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  4. מיד לפני השימוש, מערבולת חלקיקים מגנטיים במשך 30 שניות במהירות גבוהה. הוסף 50 μL של חלקיקים מגנטיים לכל 1 מ"ל של דגימה לצינור המכיל PBMCs, וערבב בעדינות.
  5. העלו את עוצמת הקול עד 2.5 מ"ל עם מאגר בחירה וערבבו בעדינות. מניחים את הצינור (ללא מכסה) לתוך המגנט, ודוגרים ב-RT למשך 2.5 דקות.
  6. הרימו את המגנט, ובתנועה מתמשכת הפכו את המגנט והצינור כדי לשפוך את מתלה התאים המועשר לתוך צינור סטרילי חדש.
  7. כדי להגביר את ההתאוששות, הוסיפו 2.5 מ"ל של חיץ סלקציה לצינור שנותר במגנט, מבלי להפריע לחרוזים המשותקים. שמור את המגנט למשך 2.5 דקות נוספות, וחזור על שלב 2.6 כדי לשחזר תאים נוספים.
  8. קח aliquot לספירת תאים קיימא באמצעות כחול טריפאן. חשב את מספר התא הכולל באמצעות המוציטומטר או מונה תאים.
  9. אשרו את הטוהר על ידי ציטומטריית זרימה (איור 3).

3. הפעלה כימית

  1. התאימו את תאי ה-T CD4+CD45RO+ ל-5 x 106 תאים/מ"ל עם מדיום RP10F חם, ופיצו תאים למנות תרבית בגודל הרצוי. תאי מנוחה באינקובטור לח של 37 °C 5% CO2 בן לילה.
  2. כדור נח תאים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g במשך 10 דקות. הסר את ה-supernatant והקש על החלק התחתון של הצינור כדי לשחרר את גלולת התא.
  3. התאימו את ריכוז התאים ל-5 x 106 תאים/מ"ל עם תווך RP10F חם, ופיצו 0.5\u20121 x 107 תאים לכל אחד משלושת הצינורות הסטריליים עם מכסה הברגה.
    הערה: אם קיימים מספיק תאים זמינים, גירויים כפולים או נקודות זמן נוספות עשויים להיכלל בתכנון הניסוי.
  4. לעורר תאים בצינורות 2 ו -3 עם PMA ו- A23187. הוסיפו PMA ל-25 ננוגרם/מ"ל ו-A23187 עד 500 ננוגרם/מ"ל וערבבו בעדינות. הוסיפו נפח שווה של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לתאים בצינור 1 שישמשו ככלי (בקרה). לדוגמה, אם אתה משתמש ב- 1 μL של PMA ו- 1 μL של A23187, הוסף 2 μL של DMSO לצינור הרכב. שמור על הריכוז הסופי של DMSO מתחת ל-0.5% בכל הצינורות.
  5. שחררו את הפקקים על הצינורות, והחזירו את התאים לחממת 37 °C 5% CO2 למשך 2 שעות (צינור 2) ו-6 שעות (צינורות 1 ו-3). בזמן המצוין, תאי צנטריפוגה ב 500 x g במשך 10 דקות.
  6. לפני הליסטיקה, יש להשליך כמה שיותר מהסופרנטנט, מבלי להפריע לכדור התא.
  7. שחררו את התאים באופן מיידי, בהתאם להוראות של ערכת בידוד הרנ"א הזמינה באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים). המשך בבידוד RNA, או הקפיא את הליזאט בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי לעבד מאוחר יותר עם דגימות נוספות.
    הערה: ניתן לאמת את טוהר הרנ"א ואת שלמותו באמצעות אלקטרופורזה מיקרו-קפילרית.
  8. אופציונלי: כדי להסיר לחלוטין את כל עקבות הדנ"א מדגימת הרנ"א המטוהרת, השתמש בערכת ניקוי RNA (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.

תוצאות

פרוטוקול זה כולל נהלים לבידוד של PBMCs מדם SS, טיהור תאי CD4+CD45RO+ T על ידי בחירה שלילית, גירוי של תאי T מטוהרים ובידוד של RNA כולל לצורך פרופיל שעתוק. איור 1 מתאר את תהליך הבידוד של PBMC מדם שלם. שים לב כי התשואה הכוללת של SS PBMCs תשתנה עם נפח הדם ההתחלתי ועומס הגידול במחזור הדם של כל חולה. במעבדה שלנו, התשואה הממוצעת של SS PBMCs הייתה 4.6 × 106 תאים/מ"ל של דם שלם (1.85 × 106 – 3.25 x 107 תאים/מ"ל עבור 7 SS). הכדאיות הממוצעת של PBMCs מבודדים הייתה 95\u201299%. איור 2 מראה טוהר גבוה וכדאיות גבוהה של תאי T נבחרים של זיכרון CD4+CD45RO+. התפוקה הממוצעת של תאי CD4+CD45RO+ T מ-SS PBMCs הייתה 75% (75.6% – 84%), לעומת 15.9% (3% – 30%) מתורמים רגילים (ND) PBMCs שהתקבלו מתאי מערכת לוקורדוקציה (LRS). הכדאיות והטוהר של תאי CD4+CD45RO+ T שהתקבלו על-ידי פרוטוקול בחירה שלילי זה היו גבוהים באופן עקבי (איור 3).

בעבר שילבנו את פרוטוקול ההפעלה לעיל עם מיקרו-מערכים כדי לחקור את השינויים התפקודיים בתעתיקים של תאי SS ו-ND T, והוכחנו שתאי זיכרון SS T ו-SS PBMCs מבטאים בצורה גרועה את הציטוקינים וגנים אחרים של תגובה חיסונית בהשוואה לתאי ND T ו-PBMCs 19,22,23. איור 4 מראה את ההפעלה החזקה של כמה גנים של ציטוקינים, כולל IL4, IL 10, IL13 ו-IL22 בתאי ND T, אך לא בתאי SS T. פגם זה בביטוי גנים תפקודי בתאי SS T אושר מאז על ידי קבוצות אחרות24. בנוסף, גנים רבים שאינם באים לידי ביטוי באופן נורמלי בתאי ND T באים לידי ביטוי גבוה בתאי SS T, הן במנוחה והן בגירוי שלאחר מכן (איור 4). אלה כוללים את הגנים של סמנים ביולוגיים SS שתוארו בעבר DNM3, PLS3, TOX ו- TWIST1 25,26,27, כמו גם ANK1 ו- SGCE, שדווחו לראשונה על ידי הקבוצה שלנו. סמנים ביולוגיים חיוביים אלה באים לידי ביטוי גבוה ב-SS, אך לא ב-ND, ונמנעים ממלכודות טכניות הקשורות לסמנים ביולוגיים שליליים.

figure-results-2230
איור 1: בידוד PBMC מדם שלם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2567
איור 2: בחירה שלילית של תאי T של זיכרון CD4+ ממחשבי PBMCs מבודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2939
איור 3: טוהר תאי ה-T CD4+CD45RO+ אושר על-ידי ציטומטריית זרימה. לימפוציטים היו מגודרים על ידי פיזור אור (A), לימפוציטים חיים לא כללו צבע כדאיות eFluor780 (B), ו-(C) מייצג תורמים נורמליים שלא נבחרו (ND). בחירה שלילית הביאה לאוכלוסיות כמעט טהורות של תאי T CD45RO+ בחולי ND (D) ו-SS (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3613
איור 4: ביטוי גנים דיפרנציאלי בתאי T של זיכרון CD4+CD45RO+ במנוחה ובהפעלה של SS ו-ND. ביטוי גנים z-score מיוצג על ידי סולם צבעים מאדום (ביטוי גבוה) לירוק (ביטוי נמוך). פסים צבעוניים בחלק העליון של מפת החום מייצגים טיפולים בתאים: טיפול מדומה/רכב (אדום), 2 שעות מגורה (כחול) ו-6 שעות מגורה (צהוב). מספר גנים של סמנים ביולוגיים של SS באים לידי ביטוי גבוה וגנים של ציטוקינים באים לידי ביטוי בצורה גרועה בתאי SS T בהשוואה לתאי ND T. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

ריאגנטים
מדיום צפיפותמדיום הפרדת לימפוציטים, פיקול-היפק, או מדיום צפיפות שווה ערך עם צפיפות = 1.077-1.080 גרם/מ"ל ב-20מעלותצלזיוס.
HBSS1x תמיסת מלח מאוזנת של האנק, 4.2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7.2
RP10FRPMI 1640 בינוני, 10% חום מומת סרום בקר עוברי (FBS), תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין אחת, pH 7.2
מאגר ליזיס ACK155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, אין צורך להתאים pH. זה צריך להיות ~ 7.3.
מאגר בחירה1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA
phorbol12-myristate13-אצטט (PMA)50 מיקרוגרם/מ"ל ב-DMSO
A23187 יונופור500 מיקרוגרם/מ"ל ב-DMSO

טבלה 1: ריאגנטים.

Discussion

פותחו מספר דרכים לבידוד PBMCs, ולכל אחת מהן יתרונות ומגבלות משלה28. אנו אוספים באופן שגרתי עד 50 מ"ל דם בחמישה צינורות של 10 מ"ל המכילים נוגדי קרישה. נפח הדם לבידוד PBMC תלוי במספר גורמים כגון בריאות וגילו של נושא המחקר וגם במומחיות פלבוטומיסטית. שלב פרוצדורלי קריטי בפרוטוקול הוא היווצרות מדרגת הצעד. שכבות לקויות עלולות לגרום לכשל חלקי או מלא של PBMCs במשקעים בממשק. אנו מעדיפים את שיטת השכבות התחתונות המתוארת כאן, מכיוון שקל להתחיל את השכבה התחתונה. כדי לוותר לחלוטין על כל מדיום הצפיפות שמתחת לדם, חשוב מאוד להשתמש בעזר פיפטה ללא דליפות אוויר. זיהום של שבר PBMC על ידי סוגי תאים לא רצויים ניתן למזער על ידי איסוף זהיר ועקבי של שכבת buffy, אשר צריך להתבצע באותו אופן עבור כל בידוד. אם PBMCs לא יפוצלו עוד יותר, יש להימנע מאיסוף כמויות שונות של שיפוע הצפיפות ושכבות הפלזמה בין הבידודים. תזת RBC מבוצעת כדי למזער את ההשפעה הפוטנציאלית של זיהום RBC ו-RNA שמקורו ברטיקולוציטים על ניתוחי ביטוי גנים במורד הזרם. ליזה היפוטונית תעוכב על ידי עודף חיץ איזוטוני.

בידוד נוסף של תת-קבוצה של תאי T חשוב למחקרים מולקולריים. כאן תיארנו את בחירת תאי ה-T הבאים של CD4+CD45RO+ על-ידי בחירה שלילית כדי להסיר סוגי תאים לא רצויים. בחירה שלילית מסתמכת על נוגדנים המזהים סמני פני שטח ספציפיים של תאים עבור כל התאים הלא רצויים. תאים מצופים נוגדנים מוסרים לאחר מכן על ידי חרוזים מגנטיים. פרוטוקול בחירה זה מסיר תאים לא רצויים תוך שהוא מאפשר לתאי מטרה לא נגועים ולא מגירים להישאר צפים חופשיים, דבר חיוני לחקר הפעלת גנים. עם זאת, יש להקפיד על הימנעות מגושי תאים, המפחיתים את הטוהר הסופי של תאי CD4+ CD45RO+ T נבחרים. חומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA) הנמצאת במאגר הברירה ממזערת את גוש התא. תפוקת תאי T תלויה בגורמים כגון נפח ראשוני של הדם, משתנים של המטופל כגון הטיפול הניתן לחולה ושלב המחלה בזמן איסוף הדגימה. טיפול הניתן לחולים עשוי להשפיע גם על כדאיות התא. בנוסף, לאיסוף דגימות לפני כל הליך כגון פוטופרזיס יש גם השפעה חיובית על טוהר תאי T CD4+CD45RO+. ראינו כי לאיסוף דגימות לאחר הליך טיפול בפוטופרזיס יש השפעה שלילית על תפוקת תאי T CD4+CD45RO+.

שיבוטים של תאי T ניאופלסטיים מחולי SS מבטאים לרוב סמני פני שטח התואמים לפנוטיפ בוגר של תאי T CD4 Tבזיכרון 29,30. עם זאת, פלסטיות פנוטיפית נצפתה מדי פעם ביחס לסמני פני השטח כולל CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 ו/או CD2631. מחקרים קודמים הראו גם את ההטרוגניות בביטוי CD45RO ו-CD45RA בקרב חולי SS29, בעוד שרוב מקרי ה-SS הם עדיין CD45RO+. Roelens et al.31 הראו גם כי SS עשוי להפגין הטרוגניות בין-אישית ובלתי-אינדיווידואלית עם אוכלוסייה מעורבת של תתי-קבוצות של נאיביות (TN), זיכרון מרכזי (TCM), זיכרון מעבר (TTM), זיכרון אפקטור (TEM) ותת-קבוצות של זיכרון אפקטור מסוף (TEMRA). עם זאת, התוצאות שלהם מראות בבירור כי רוב תאי SS יש פנוטיפ TCM. מיקדנו את המחקר שלנו באימונופנוטיפ פני השטח CD45RO+ הנפוץ ביותר בחולי SS, ואישרנו את הפנוטיפ על ידי ציטומטריה של זרימה. בתכנון מחקרים על תת-קבוצות של תאי T בחולים, חשוב לקחת בחשבון את ההטרוגניות הפנוטיפית של המחלה הנחקרת, ולכן ניתן להתאים את אסטרטגיית הטיהור לפי הצורך כדי להשיג את אוכלוסיית תאי ה-T הרצויה לניתוח.

ישנן מספר דרכים לעורר תאי T ו-PBMCs כדי לבחון ביטוי גנים תפקודי. אנו מעדיפים הפעלה כימית (PMA + A23187 ionophore), מכיוון שאנו מעוניינים בוויסות גנים בגרעין. הפעלה כימית היא האפשרות הטובה ביותר למטרה זו מכיוון שהיא פועלת כמפעיל רחב והיא אחידה יותר בהשוואה לגירוי ספציפי לאנטיגן. PMA היא תרכובת אורגנית קטנה המתפזרת דרך קרום התא לתוך הציטופלסמה, ומפעילה ישירות את החלבון קינאז C. A23187 מאפשר לסידן לעבור דרך הממברנות. תרכובות אלה עוקפות את קולטני פני השטח, ויחד מחקות את ההשפעות של קשירת קולטן תאי T עם גירוי משותף המתווך על ידי CD28. הכימיקלים מפעילים מספר מסלולי איתות תוך-תאיים, וכתוצאה מכך מופעלים גורמי שעתוק גרעיניים ורגולציה של גנים ציטוקינים הנגישים להפעלת שעתוק. למרות שפעילות כימית וקשירת CD3CD28 מייצרות פרופילי ביטוי גנים גלובליים דומים להפליא בתאים רגילים32, הפעלה כימית עם PMA + A23187 היא בחירה טובה מכיוון שתאי SS T יכולים לאבד ביטוי של קולטני פני השטח כולל רכיבי TCR33. Chong et al.22 השוו את ההפעלה של גנים ציטוקינים בין PMA/A23187 לנוגדנים נגד CD3 ואנטי-CD28 ב-PBMCs מחולי MF/CTCL רגילים, מוקדמים, וחולי MF/CTCL מאוחרים. הם דיווחו כי PMA/A23187 גרם להפעלה מהירה ואינטנסיבית יותר של הגן IL-2 בהשוואה לגירוי אנטי-CD3/CD28. בנוסף, הם הראו כי הקינטיקה של ההפעלה האיטית יותר עם נוגדנים נגד CD3/CD28 היא אולי מקישור צולב ואיתות ממברנה הדרושים לגירוי. יתר על כן, מגמות בביטוי ציטוקינים בקרב אוכלוסיות התאים השונות שנחקרו השתמרו עם PMA/A23187. מכיוון שאנו מתעניינים בהפעלת ביטוי גנים, גירוי כימי הוא גישה אידיאלית מכיוון שהוא פועל כמפעיל רחב והוא עקבי יותר בהשוואה לגירוי ספציפי לאנטיגן. קשירת CD3/CD28 אידיאלית לחקר מסלולים החשובים בהעברת אותות מבוססת ממברנה. בנוסף, הפעלה כימית היא פחות יקרה ואינה דורשת ציוד מיוחד. במחקר הנוכחי, PMA + A23187 הפעילו באופן משמעותי גנים של ציטוקינים בתאי ND אך לא בתאי SS T, מה שמרמז על כך שלתאי SS T יש ליקויים תפקודיים במורד הזרם של ה-TCR.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק תאי T טהורים מבחינה פנוטיפית מדם יקר שמקורו בחולה, ושיטה להערכת שינויים כלל-גנומיים בביטוי גנים תפקודי. אנו מדגימים כי פרופיל שעתוק של תאי T מסוג SS בהשוואה לתאי T תקינים מסוג CD45RO+ חושף הבדלים עמוקים בהפעלת גנים בתאי T אנושיים טריים מחולים עם CTCL. מחקרים אלה יסייעו בפיתוח סמנים ביולוגיים אבחנתיים ואסטרטגיות טיפוליות המכוונות לסמנים חדשניים ב-CTCL. בנוסף, אסטרטגיה ופרוטוקול אלה בחקר תאי T אנושיים ראשוניים עשויים להיות בעלי ערך בהסתגלות למחקרים של מחלות אחרות בתיווך תאי T.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

גילוי אתי:
פרוטוקול מחקר זה אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של אוניברסיטת ארקנסו למדעי הרפואה (UAMS, Little Rock, AR) נתוני המיקרו-מערך שהוצגו במחקר זה נעשו על הדגימות שגויסו תחת פרוטוקול מחקר שאושר על ידי ה- IRB של בית החולים הנרי פורד (דטרויט, מישיגן).

Acknowledgements

אנו מודים למטופלים ולמתנדבים שהשתתפו במחקר שלנו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml microcentrifuge tubesFisher Scientific02-681-320
10 ml Disposable Plastic PipetteThermo Scientific170356
1000 ul Pipet tipsVWR10017-038
15 ml Conical TubesCorning352196
25 ml Disposable Plastic PipetteThermo Scientific170357
5 ml Disposable Plastic PipetteThermo Scientific170355
50 ml Conical TubesThermo Scientific339652
A23187 ionophoreFisher ScientificBP595
CentrifugeThermo Scientific75004381
DMSOSigmaD2650-5x5ml
EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment KitStemCell19157
FBSGIBCO16140-071
HBSSGIBCO14185-052
HEPESFisher BioreagentsBP310-500
KHCO3Fisher BioreagentsP184-500
Lymphocyte Separation MediumCorning25-072-CV
Na2EDTAACROS10378-23-1
NaHCO3Fisher BioreagentsS233-500
NH4ClFisher BioreagentsA661-500
Penicillin-streptomycin solutionGIBCO15140122
phorbol12-myristate13-acetate (PMA)SigmaP-8139
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+RAININ17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+RAININ17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+RAININ17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+RAININ17014392
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1013
Rneasy Plus Mini KitQiagen74136
RPMI 1640GIBCO31800-022
T-25 FlaskThermo Scientific2024-10

References

  1. Kim, E. J., et al. Immunopathogenesis and therapy of cutaneous T cell lymphoma. Journal of Clinical Investigation. 115, 798-812 (2005).
  2. Wong, H. K., et al. Evolving Insights in the Pathogenesis and Therapy of Cutaneous T-cell lymphoma (Mycosis Fungoides and Sezary Syndrome). British Journal of Haematology. 155 (2), 150-166 (2011).
  3. Whittaker, S. Biological insights into the pathogenesis of cutaneous T-cell lymphomas (CTCL). Seminars in oncology. 33 (3), 3-6 (2006).
  4. Kallinich, T., et al. Chemokine receptor expression on neoplastic and reactive T cells in the skin at different stages of Mucosis Fungoides. Journal of Investigative Dermatology. 121 (5), 1045-1052 (2003).
  5. Rodd, A. L., et al. Current and Emerging Therapeutics for Cutaneous T-Cell Lymphoma: Histone Deacetylase Inhibitors. Lymphoma. 2012, 1-10 (2012).
  6. Olsen, E., et al. Revisions to the staging and classification of mycosis fungoides and Sezary syndrome: a proposal of the International Society for Cutaneous Lymphomas (ISCL) and the cutaneous lymphoma task force of the European Organization of Research and Treatment of Cancer (EORTC). Blood. 110, 1713-1722 (2007).
  7. Hameetman, L., et al. EPHA4 is overexpressed but not functionally active in Sézary syndrome. Oncotarget. 6 (31), 31868-31876 (2015).
  8. Willemze, R., et al. WHO-EORTC classification for cutaneous lymphomas. Blood. 105, 3768-3785 (2005).
  9. Bradford, P. T., et al. Cutaneous lymphoma incidence patterns in the United States: a population-based study of 3884 cases. Blood. 113, 5064-5073 (2009).
  10. Wilson, L. D., et al. Age, race, sex, stage, and incidence of cutaneous lymphoma. Clinical Lymphoma Myeloma and Leukemia. 12, 291-296 (2012).
  11. Li, Y., et al. Management of cutaneous T cell lymphoma: new and emerging targets and treatment options. Cancer Management and Research. 4, 75-89 (2012).
  12. Korgavkar, K., et al. Changing incidence trends of cutaneous T-cell lymphoma. Jama Dertmatology. 149 (11), 1295-1299 (2013).
  13. Dulmage, B. O., Geskin, L. J. Lessons learned from gene expression profiling of cutaneous T-cell lymphoma. British Journal of Dermatology. 169 (6), 1188-1197 (2013).
  14. Boonk, S. E., et al. Evaluation of Immunophenotypic and Molecular Biomarkers for Sézary Syndrome Using Standard Operating Procedures: A Multicenter Study of 59 Patients. Journal of Investigative Dermatology. 136 (7), 1364-1372 (2016).
  15. Scarisbrick, J. J., et al. Cutaneous Lymphoma International Consortium Study of Outcome in Advanced Stages of Mycosis Fungoides and Sézary Syndrome: Effect of Specific Prognostic Markers on Survival and Development of a Prognostic Model. Journal of Clinical Oncology. 10 (33), 3766-3773 (2015).
  16. Benoit, B. M., et al. CD164 identifies CD4+ T cells highly expressing genes associated with malignancy in Sézary syndrome: the Sézary signature genes, FCRL3, Tox, and miR-214. Archives of Dermatological Research. 309, 11-19 (2017).
  17. Dulmage, B., et al. The biomarker landscape in mycosis fungoides and Sézary syndrome. Experimental Dermatology. 26 (8), 668-676 (2017).
  18. Pick, E., et al. Intracellular Mediation of Lymphokine Action: Mimicry of Migration Inhibitory Factor (MIF) Action by Phorbol Myristate Acetate (PMA) and the Ionophore A23187. Annals of the New York Academy of Sciences. 94 (332), 378-394 (1979).
  19. Chong, B. F., et al. Induced Sézary syndrome PBMCs poorly express immune response genes up-regulated in stimulated memory T cells. Journal of Dermatological Science. 60 (1), 8-20 (2010).
  20. Fargnoli, M. C., et al. Diminished TCR signaling in cutaneous T cell lymphoma is associated with decreased activities of Zap70, Syk and membrane-associated Csk. Leukemia. 11, 1338-1346 (1997).
  21. Hansen, E. R., et al. Leukemic T cells from patients with cutaneous T-cell lymphoma demonstrate enhanced activation through CDw60, CD2, and CD28 relative to activation through the T-cell antigen receptor complex. Journal of Investigative Dermatology. , 667-673 (1993).
  22. Chong, B. F., et al. Immune Function Abnormalities in Peripheral Blood Mononuclear Cell Cytokine Expression Differentiates Stages of Cutaneous T-Cell Lymphoma/Mycosis Fungoides. Clinical Cancer Research. 14 (3), 646-653 (2008).
  23. Moerman-Herzog, A. M., et al. Transcriptome analysis of Sézary syndrome and lymphocytic-variant hypereosinophilic syndrome T cells reveals common and divergent genes. Oncotarget. 10, 5052-5069 (2019).
  24. Fanok, M. H., et al. Role of Dysregulated Cytokine Signaling and Bacterial Triggers in the Pathogenesis of Cutaneous T-Cell Lymphoma. Journal of Investigative Dermatology. 138, 1116-1125 (2018).
  25. Su, M. W., et al. Aberrant expression of T-plastin in Sezary cells. Cancer Research. 63, 7122-7127 (2003).
  26. van Doorn, R., et al. Aberrant expression of the tyrosine kinase receptor EphA4 and the transcription factor twist in Sezary syndrome identified by gene expression analysis. Cancer Research. 64, 5578-5586 (2004).
  27. Booken, N., et al. Sezary syndrome is a unique cutaneous T-cell lymphoma as identified by an expanded gene signature including diagnostic marker molecules CDO1 and DNM3. Leukemia. 22, 393-399 (2008).
  28. Dagur, P. K., McCoy, J. P. Collection , storage, and preparation of human blood cells. Current Protocol Cytometry. 73, 1-16 (2016).
  29. Fierro, M. T., et al. Heterogeneity of Circulating CD4+ Memory T-cell Subsets in Erythrodermic Patients: CD27 Analysis Can Help to Distinguish Cutaneous T-cell Lymphomas From Inflammatory Erythroderma. Dermatology. 216 (3), 213-221 (2008).
  30. Campbell, J. J., et al. Sézary syndrome and mycosis fungoides arise from distinct T-cell subsets: a biologic rationale for their distinct clinical behaviors. Blood. 116 (5), 767-771 (2010).
  31. Roelens, M., et al. Circulating and skin-derived Sezary cells: clonal but with phenotypic plasticity. Blood. 130 (12), 1468-1471 (2017).
  32. Diehn, M., et al. Genomic expression programs and the integration of the CD28 costimulatory signal in T cell activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11796-11801 (2002).
  33. Fuji, K. New therapies and immunological findings in cutaneous T-cell lymphoma. Frontiers in Oncology. 8, 12-28 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

176T12 13A23187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved