JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לציריפת פפטיד CD47 (pepCD47) סטנטים מתכת באמצעות כימיה פוליביספוספונט. פונקציונליזציה של סטנטים מתכת באמצעות pepCD47 מונע את ההחזקה וההפעלה של תאים דלקתיים ובכך לשפר את תאימות ביולוגית שלהם.

Abstract

הסיבוכים העיקריים הקשורים סטנטים מתכת חשופים סטנטים מבריחים סמים הם restenosis ב סטנט ופקקת סטנט מאוחר, בהתאמה. לכן, שיפור התוואת הביולוגית של סטנטים מתכת נשאר אתגר משמעותי. המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר טכניקה חזקה של שינוי פני משטח מתכת על ידי פפטידים פעילים ביולוגית כדי להגביר את תאימות ביולוגית של דם יצירת קשר עם שתלים רפואיים, כולל סטנטים אנדווסקולריים. CD47 הוא סמן אימונולוגי ספציפי למינים של עצמי ויש לו תכונות אנטי דלקתיות. מחקרים הראו כי פפטיד חומצת אמינו 22 המתאים לתחום Ig של CD47 באזור חוץ תאי (pepCD47), יש תכונות אנטי דלקתיות כמו חלבון באורך מלא. במחקרי vivo בחולדות, ובדיקות ויוו לשעבר במערכות ניסוי ארנב ודם אנושי מהמעבדה שלנו הראו כי pepCD47 immobilization על מתכות משפר את תאימות ביולוגית שלהם על ידי מניעת חיבור והפעלה של תאים דלקתיים. נייר זה מתאר את פרוטוקול שלב אחר שלב עבור פונקציונליזציה של משטחי מתכת וקובץ מצורף פפטיד. משטחי מתכת משתנים באמצעות ביספוספט פוליאלילמין עם קבוצות תיול סמוי (PABT) ואחריו פירוק של thiols והגדלה של אתרים תגובתיים תיול באמצעות תגובה עם פוליאתילן מותקן עם קבוצות pyridyldithio (PEI-PDT). לבסוף, pepCD47, שילוב שאריות ציסטאין מסוף המחוברים לרצף פפטיד הליבה באמצעות כפול 8-אמינו-3,6-dioxa-אוקטנויל spacer, מחוברים על פני המתכת באמצעות איגרות חוב disulfide. מתודולוגיה זו של חיבור פפטיד למשטח מתכת היא יעילה וזולת יחסית ולכן ניתן ליישם כדי לשפר את התואם הביולוגי של מספר חומרים ביולוגיים מתכתיים.

Introduction

התערבות כלילית מרדנית היא הקו הראשון של טיפול לטיפול במחלות עורקים כליליים (CAD) וכרוכה בעיקר בסטינג העורקים החולים. עם זאת, restenosis in-סטנט (ISR) ופקקת סטנט הם סיבוכים נפוצים הקשורים פריסת סטנט1. אינטראקציית דם בממשק סטנט הדם מאופיינת בהספיגה כמעט מיידית של חלבוני פלזמה על פני המתכת, ואחריו טסיות דם וחיבור תאי דלקתיותוהפעלה 2. שחרורו של ציטוקינות דלקתיות ו chemokines מתאי דלקתיים מופעלים מוביל לשינוי פנוטיפי של תאי שריר חלק כלי דם (VSMCs) בתקשורת tunica ומפעיל הנדידה הצנטריפטלית שלהם לתא אינטימי. התפשטות VSMC מופעל בתוצאות intima עיבוי שכבה אינטימית, לומן צמצום ו restenosis in-סטנט3. סטנטים לתרופה (DES) פותחו כדי למנוע התפשטות VSMC; עם זאת, תרופות אלה יש השפעה ציטוקסית מחוץ ליעד על תאי אנדותל4,,5. לכן, פקקת סטנט מאוחר הוא סיבוך נפוץ המשויך DES6,7. סטנטים עשויים פולימרים מתכלים, כגון poly-L-lactide הראו הבטחה רבה בניסויים בבעלי חיים וניסויים קליניים ראשוניים, אבל נזכרו בסופו של דבר כאשר השימוש הקליני "בחיים האמיתיים" הפגין נחיתותם 3rd דור DES8. לכן, יש צורך לשפר את התוואת הביולוגית של סטנטים מתכת חשופים לתוצאות טובות יותר של המטופל.

CD47 הוא חלבון transmembrane מבוטא בכל מקום המעכב את התגובה החיסונית המולדת כאשר קשור קולטן הקוניט שלה אות רגולציה חלבון אלפא (SIRPα)9. קולטן SIRPα יש תא חיסוני מעכב טירוסין מוטיב (ITIM) תחום ואת אירועי איתות על SIRPα - אינטראקציה CD47 בסופו של דבר לגרום ל downregulation של הפעלת תאים דלקתיים10,,11,,12,,13. מחקרים במעבדה שלנו הראו כי CD47 רקומביננטי או נגזרת פפטיד שלה, המקביל 22 חומצת אמינו איג תחום של האזור החוץ תאי של CD47 (pepCD47), יכול להפחית את התגובה החיסונית המארח למגוון של חומרים ביולוגייםרלוונטיים קלינית 14,15,,16. לאחרונה, הוכחנו כי pepCD47 יכול להיות משותק למשטחי סטנט נירוסטה ולהפחית באופן משמעותי את התגובה הפתופיזיולוגית הקשורים restenosis. שים לב, pepCD47 משטחים שונה הם מותאים לתנאי שימוש רלוונטיים כגון אחסון לטווח ארוך ועיקור תחמוצת אתילן17. כתוצאה מכך, pepCD47 עשוי להיות יעד טיפולי שימושי כדי לטפל במגבלות הקליניות של סטנטים אנדווסקולריים.

האסטרטגיה עבור ההחזקה הקוולנטית של pepCD47 למשטח מתכת כרוכה בסדרה של שינויים כימיים חדשניים של פני המתכת. משטחי מתכת מצופים תחילה ביספוספונט פוליאלילמין עם קבוצות thiol סמוי (PABT) ואחריו פירוק של thiols וחיבור של פוליאתילן (PEI) עם קבוצות פיריילדיתיו מותקן (PDT). קבוצות PDT של PEI לא קוסם בתגובה עם thiols PABT לא מוגן לאחר מכן מגיבים עם pepCD47 שילוב תיול במסוף שאריות ציסטאין, וכתוצאה מכך pepCD47 מחייב על פני משטח המתכת באמצעות אג"ח disulfide14,17,18. השתמשנו pepCD47 פלואורופור התואם (TAMRA-pepCD47) כדי לקבוע את ריכוז הקלט של פפטיד שתוצאות אי-תנועה המרבית של פני השטח של פפטיד. לבסוף, הערכנו את הקיבולת האנטי דלקתית חריפה וכרונית של משטחי מתכת מצופים pepCD47, ex vivo, באמצעות חלונית לולאה צ'נדלר, וחיבור מונוציט / התרחבות מקרופאג', בהתאמה.

נייר זה מספק פרוטוקול שיטתי לחיבור פפטידים thiolated על פני משטח המתכת; קביעת צפיפות ההשתקה המרבית של הפפטיד; והערכת המאפיינים האנטי דלקתיים של משטחי מתכת מצופים pepCD47 חשופים לדם שלם ומונוציטים מבודדים.

Protocol

כל הדגימות האנושיות לניסוי זה הושגו בהתאם ל-IRB של בית החולים לילדים של פילדלפיה. כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור IACUC של בית החולים לילדים של פילדלפיה.

1. ציפוי משטחי מתכת חשופים עם PEI-PDT

  1. לשטוף את קופוני רדיד פלדת אל-חלד (1 ס"מ x 1 ס"מ או 0.65 ס"מ x 1 ס"מ) או דיסקים רשת נירוסטה עם 2-isopropanol בשייקר (60 °C, מהירות של 200 סל"ד) במשך 5 דקות. בצע שלב זה 2x. לאחר מכן לשטוף 2x עם כלורופורם (60 °C, מהירות של 200 סל"ד) עבור 10 דקות כל אחד.
  2. מניחים את דגימות הנירודה הנקיות בתנור ב-220 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. להכין 5 מ"ל של 0.5% של פתרון PABT על ידי המסת 25 מ"ג של ביספוספונט פוליאלילמין עם קבוצות תיול סמוי (PABT) ו 5 מ"ג של אשלגן ביקרבונט (KHCO3)ב 5 מ"ל של DDW ולדגור ב 72 מעלות צלזיוס ב שייקר ב 200 סל"ד במשך 30 דקות.
    הערה: עבור סינתזת PABT עיין בספרות שפורסמה בעבר18.
  4. לטבול את רדידות אפוי או רשת שינוי דיסקים בתמיסה מדומה 0.5% של PABT דגירה שייקר (72 °C, מהירות של 200 סל"ד) עבור 1 שעה.
  5. לשטוף את דגימות PABT שונה עם מים מזוקקים deionized (DDW) עבור 5x, להעביר את הדגימות בבקנה חדשה ולשטוף שוב עם DDW עבור 5x.
  6. להכין סך של 5 מ"ל של פתרון TCEP (12 מ"ג / מ"ל) על ידי המסת 60 מ"ג של Tris (2-carboxyethyl) פוספין הידרוכלוריד (TCEP) ב 5 מ"ל של 0.1 M מאגר אצטי (0.57 מ"ל של חומצה אצטית קרחוני, 820 מ"ג נתרן אצטט ב 100 מ"ל של DDW).
  7. טפל בדגימות ששונו על-ידי PABT עם TCEP למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר.
    הערה: TCEP משמש כדי להגן על קבוצות thiol.
  8. Degas DDW בקבוקון תחתון עגול באמצעות התקן ייצור ואקום, כגון lyophilizer ולשטוף את רדידות TCEP שטופלו או דיסקים רשת עם DDW degassed עבור 5x. העבר את הדגימות במבען חדש, ובנוסף לשטוף פי 5 עם DDW degassed.
    הערה: זה בעל חשיבות עליונה לעבוד מהר כדי למנוע חמצון של thiols על פני משטח המתכת על ידי חמצן אטמוספרי.
  9. להכין 5 מ"ל של 1% פתרון PEI-PDT על ידי דילול 212.5 μL של מניות PEI-PDT ו 125 μL של 0.4 M נתרן אצטט ב DDW degassed. לבצע שלב 1.9 בו-זמנית עם שלב 1.8 כדי למזער את החשיפה של הדגימות לאוויר אטמוספרי.
    הערה: הסינתזה של PEI-PDT מתוארת בספרות שפורסמה בעבר18.
  10. דגירה דגימות נירוסטה שטופות עם 1% PEI-PDT. החליפו את האוויר בגז ארגון, אטמו את הבקבוקונים היטב ומערבבים על שייקר ב-RT למשך שעה אחת. או להמשיך מיד עם ההתייחדות פפטיד או לאחסן ב 4 ° C עד שבוע אחד.

2. החזקה והערכה איכותית/כמותית של שימור pepCD47 פלואורופור על משטח מתכת באמצעות מיקרוסקופית פלואורסצנט ופלואורומטריה

  1. לשטוף קופונים רדיד או דיסקים רשת שינוי מוכן כמתואר בסעיף 1, שלבים 1.1-1.10 לעיל עם DDW 5x. העבר את הדגימות למבען חדש ושטוף עם DDW לקבלת פי 5 נוספים. לבסוף לשטוף 2x עם אתנול degassed ו 2x עם degassed דימתיל formamide (DMF).
  2. להכין טטרמתילרודאמין (TAMRA)-conjugated פפסיקה פפסיקה פתרון מניות על ידי המסת אבקת pepCD47 pepCD47 ב- degassed dimethylformamide (DMF) לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל. אליקוט פתרון המניות בהקצאות 1 מ"ל. לאחסן בצינורות אטומים היטב תחת אווירת ארגון ב -20 מעלות צלזיוס.
  3. לדלל 1 מ"ג/מ"ל של פתרון המניות של PEPCD47 בהדפס TAMRA באמצעות DMF degassed כדי להכין את הריכוזים הבאים של pepCD47 פלואורופור - 10, 30, 100, ו 200 μg/mL.
    הערה: אם PEPCD47 tamra-conjugated נראה זירז, להפחית את המניה TAMRA-conjugated pepCD47 פתרון באמצעות חרוזי TCEP ביחס 1:1, ב RT במשך 20 דקות. שים לב כי לפני הוספת pepCD47 התואם-התואם לחרוזי TCEP, לסובב את פתרון חרוזי TCEP, להסיר את supernatant ולאחר מכן להמשיך עם תוספת של pepCD47 TAMRA-conjugated.
  4. דגירה PEI-PST שונה רדיד קופונים עם 10, 30, 100 או 200 μg / מ"ל של pepCD47 בהדפסים tamra-conjugated בשלושה מקרים עבור כל תנאי על שייקר ב RT תחת אווירת ארגון במשך 1 שעה. דגירה PEI-PST שונה רשת דיסקים, כמו גם דיסק רשת שינוי לא השתנה מעבר לשלב 1.2 (פקדי מתכת חשופים) עם 100 μg / מ"ל של pepCD47 tamra-conjugated בשלושה ב RT תחת אווירת ארגון על שייקר במשך 1 שעות.
    הערה: ממדרגה זו ואילך, הבקבוקונים עטופים בנייר אלומיניום כדי להגן על התוכן מפני אור.
  5. לשטוף את המשטחים מצופה pepCD47 פלואורופור כדי להסיר את הפפטיד שאינו מחובר covalentented בסדר הבא: DMF (3x), DMF / DDW ב 1:1, DDW (3x), 0.3% SDS ב- 20 mM Tris pH 7.4 (3x, 5 דקות כל אחד ב- 70 °C על שייקר), DDW (3x), בקבוקונים שינוי, ושטיפה DDW הסופי.
  6. מקם את הבקרה ואת הדיסקים רשת שינוי covalent באופן קוצני על זכוכית מיקרוסקופ, להוסיף 50 μL של PBS ולמקם כיסוי. דיסקים רשת שינוי תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנס הפוך מצויד סט מסנן רודמין. לצלם תמונות מייצגות בהגדלה של פי 100.
  7. להכין 15 מ"ל של 12 מ"ג /מ"ל TCEP פתרון על ידי המסת 180 מ"ג של TCEP ב 1:1 v / v תערובת של מתנול ו 0.1 M מאגר אצטי.
  8. דגירה כל רדיד שטף עם 1 מ"ל של פתרון TCEP על שייקר ב RT במשך 15 דקות.
  9. הכן את הסטנדרטים הבאים על-ידי דילול סדרתי של מניית PEPCD47 (1 מ"ג/מ"ל) – 100 μg/mL, 10 μg/mL, 1 μg/mL, 0.1 μg/mL, ו- 0.01 μg/mL. השתמש בפתרון TCEP כדלול.
  10. נתח את pepCD47 המופרך על-ידי TAMRA ששוחרר מפני משטח המתכת כנגד עקומת הכיול שנוצרה באמצעות הסטנדרטים על ידי פלואורימיה ב 544/590 מילימטרים מילימטרים לאורכי גל פליטה.

3. הצמדת pepCD47 אנושי למשטחים מותאמים PEI-PDT

  1. לשטוף PEI-PDT מצופה דגימות ניסח כמתואר בסעיף 1, שלבים 1.1-1.10 לעיל, עם DDW degassed 5x, לשנות את הבקבוקון ולשטוף עם DDW degassed 5x.
  2. להכין פתרון מלאי pepCD47 אנושי (1 מ"ג / מ"ל) על ידי המסת אבקת pepCD47 אדם בחומצה אצטית degassed 50% כדי להשיג ריכוז 1 מ"ג/ מ"ל.
  3. להכין ריכוז עבודה של pepCD47 אנושי (100 μg / מ"ל) על ידי המסת 500 μL של המלאי של pepCD47 אנושי ב 4,500 μL של degassed 1x פוספט חוצץ תמיסת מלח (PBS).
  4. דגירה דגימות מצופה PEI-PDT שטף עם 100 μg / מ"ל של pepCD47 ב RT עם רועד במשך 1 שעות.
  5. לשטוף את הדוגמאות האנושית pepCD47 מצופה כדי להסיר פפטיד עודף בסדר הבא PBS (3x), DDW (3x), 0.2% Tween-20 (3x, 5 דקות כל אחד), DDW (3x), שינוי בקבוקונים ושטיפה DDW הסופי.
    הערה: משטחים מצופים pepCD47 אנושיים ניתן לאחסן יבש ב 4 ° C עד 6 חודשים.

4. ציפוי משטחי PEI-PDT שונה עם רצף מקושקשות (Scr)

  1. להמיס את אבקת רצף מקושקשת בחומצה אצטית degassed 0.1% כדי להכין פתרון מניות של 1 מ"ג/ מ"ל.
  2. להכין פתרון של 100 μg / מ"ל של פפטיד מקושקשת על ידי המסת 500 μL של ב 4,500 μL של חומצה אצטית degassed 0.1%.
  3. לכסות את דגימות PEI-PDT שטף עם 100 μg / מ"ל של פפטיד מקושקשת ב RT עם רועד במשך 1 שעות.
  4. כדי להסיר פפטיד מקושקשות לא מחובר, שטפו את המשטחים בסדר הבא 0.01% חומצה אצטית (3x), DDW (3x), 0.2% Tween-20 (3x, 5 דקות), DDW (3x), בקבוקונים שינוי ושטיפה DDW אחת.

5. לולאת צ'נדלר לניתוח חיבור תאי למשטחי מתכת

  1. ציפוי רדידות המתכת (0.65 ס"מ x 1 ס"מ) עם פפסיק47 אנושי או פפטיד מקושקשת לפי התיאור בסעיף 1 ואחריו 3 או 4.
  2. חותכים צינורות PVC "1/4 לשלוש חתיכות באורך 38 ס"מ.
  3. הכנס עד 8 רדיד מתכת לא שונה, מקושקשות או pepCD47 שונה בשלושה צינורות שונים.
  4. לאסוף 30 מ"ל של דם מתורמים אנושיים בריאים ללא כל תרופות נגד טסיות דם לפי פרוטוקול IRB מוסדי. מזרק preload עם 1 מ"ל של 4% נתרן ציטראט כדי למנוע קרישה של דם שנאסף.
  5. לשים 10 מ"ל של דם לתוך כל צינור באמצעות מזרק 10 מ"ל ולחבר את הקצוות עם מתאמי מתכת. שים את הצינורות המלאים בדם על הגלגלים של אפליקציית הלולאה של צ'נדלר.
  6. להעביר את הדם לאורך רדידות מתכת על ידי סיבוב גלגל ב 37 ° C במהירות מחושב כדי לייצר את גימה של 25 dyns / ס"מ2 עבור 4 שעות.
  7. לנקז את הדם מהצינורות ולהיפטר מהדם על פי דרישות IRB.
  8. חותכים את הצינורות באמצעות האזמל כדי לאחזר את הרדידות מכל צינור.
  9. להכין 2% תמיסת גלוטרלדהייד על ידי דילול 10 מ"ל של 4% גלוטרלדהייד פתרון באמצעות 10 מ"ל של נתרן cacodylate מאגר עם 0.1 M נתרן כלוריד.
  10. דגירה רדידות בתמיסת גלוטראלדהייד 2% במשך 15 דקות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לילה. לפני הניתוח, לשטוף את המתכת רדידות 3x עם PBS.

6. ניתוח קובץ מצורף תאי למשטחי מתכת באמצעות צבע CFDA

  1. חם 8 מ"ל של PBS בצינור 15 מ"ל באמבט מים להגדיר 37 מעלות צלזיוס.
  2. להכין את פתרון הצבע CFDA (carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester) כדלקמן - להוסיף 90 μL של DMSO למבחנה אחת של צבע CFDA כדי להשיג ריכוז מלאי של 10 מ"ר. לאחר מכן, להכין את ריכוז העבודה של 93.75 μM על ידי הוספת 75 μL של CFDA המניה ל 8 מ"ל של PBS חם. מערבבים על ידי היפוך הצינורות כמה פעמים ולכסות את הצינור עם רדיד אלומיניום.
    הערה: מומלץ להכין מחדש את צבע CFDA לפני כל שימוש.
  3. דגירה כל רדיד עם 1 מ"ל של צבע CFDA בצלחת 24 באר. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומדגירה את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  4. שוטפים את המתכת מברדות פי 3 עם PBS כדי להסיר צבע עודף. תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנס הפוך.

7. מצורף מונוצייט והרחבת מקרופאג על משטחי מתכת pepCD47 ששונו וחשופים

  1. לאסוף 10 מ"ל של דם היקפי באמצעות גישה קאווה וונה במהלך ההקרבה של 400-450 גרם זכר ספראג-Dawley חולדה. מערבבים מיד עם 1,000 IU של נתרן הפרין כדי למנוע קרישה.
  2. פיפט 10 מ"ל של צפיפות הדרגתית בינונית לתוך צינור חסין 50 מ"ל. מערבבים את הדם עם 5 מ"ל של PBS, ובזהירות שכבה מדוללת דם על מדיום הדרגתי צפיפות באמצעות פיפטה פסטר. צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד ב 800 x g ו 18-25 ° C במשך 20 דקות עם הגדרות מינימליות של האצה והאטה.
  3. באמצעות פיפטה פסטר, לאסוף שכבה אטומה של מעיל באפי על הממשק בין פלזמה Ficoll. דילל מעיל באפי 1:3 עם PBS וצנטריפוגה ב 550 x g ו 4 ° C עבור 10 דקות לתאי מעיל באפי.
  4. להשעות מחדש תאי מעיל באפי ב 3 מ"ל של מאגר lysis ACK כדי lyse אריתרושיטים מזהמים. דגירה על קרח במשך 4 דקות. הוסף 12 מ"ל של מאגר הפרדת תאים (CSB; 0.5% BSA, 0.5% FBS, 2 mM EDTA/PBS).
  5. צנטריפוגה ב-550 x g ו-4°C למשך 10 דקות. x g להשעות מחדש את הכדור ב 10 מ"ל של CSB.
  6. צנטריפוגה ב-200 x g ו-4°C למשך 10 דקות כדי למנוע טסיות דם. x g חזור על זה פעמיים.
  7. להשעות מחדש את הכדור ב 500 μL של CSB. הוסף 10 μg של כל אחד מהנוגדנים הבאים נגד חולדות עכבר: CD8a (משובוט OX-8), אנטי CD5 (משוכפל OX-19), אנטי CD45RA (משוכפל OX-33), ואנטי CD6 (משובוט OX-52).
  8. דגירה ב 4 °C על מסובב צינור אנכי עבור 1 שעה. להוסיף 9.5 מ"ל של CSB. צנטריפוגה ב-300 x g ו-4°C למשך 10 דקות. x g השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-10 מ"ל של CSB וחזרו על צנטריפוגציה.
  9. להשעות מחדש את הכדור ב 500 μL של CSB. להוסיף 150 μL של מיקרו-חרוזים IgG אנטי-עכבר עז. דגירה ב 4 °C על מסובב צינור אנכי במשך 20 דקות. הוסף 9.5 מ"ל של CSB. צנטריפוגה ב-300 x g ו-4°C למשך 10 דקות. x g
  10. זרוק את הסופרנטנט. להשעות מחדש את הכדור ב 1 מ"ל של CSB.
  11. מקם עמודת LS במפריד מגנטי.  ראש עמודת LS עם 3 מ"ל של CSB. בטל את תפוקת העמודה. הוסף 1 מ"ל של גלולת תא מושהה מחדש מהצעד 7.10. תתחיל לאסוף את התפוקה. לאחר שהזרימה נעצרת, הוסף 5 מ"ל של CSB והמשיך לאסוף את תפוקת העמודה עד שהזרימה תיפסק.
  12. צנטריפוגה בתפוקת העמודה (6 מ"ל) המכילה מונוציטים שנבחרו באופן שלילי ב- 300 x g ו- 4 °C למשך 10 דקות. להשעות מחדש את הכדור הקטן שנוצר ב 2 מ"ל של RPMI-1640 בינוני בתוספת עם 10% FCS, 1% עט / סטרפטוקוקוס ו 100 ng/mL עכברוש מקרופאים מושבת מגרה גורם מגרה (M-CSF).
  13. ספור את המונוציטים באמצעות המוציטומטר. כוונן את ריכוז המונוציט ל- 5 x10 5 תאים/מ"ל.
  14. הוסף 1 מ"ל נפחים של מתלה monocyte לבארות בודדות של צלחת 12 גם עם דגימות רדיד נירוסטה חשופה (N = 3) או דוגמאות נירוסטה שונה עם pepCD47 חולדה (N = 3) לפי 1.1-1.10 ו 3.1-3.6.
  15. שנה את המדיום בימים 3 ו-5 לאחר זריעה. ביום 6 לאחר זריעה לשטוף את התאים עם PBS ולתקן עם 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות.
  16. הסר את רדידות נירוסטה ולמקם אותם בנפרד לתוך צלחת חדשה 12 באר. אל תהפוך את נייר הכסף.
  17. דגירה ב 0.5% Tween-20/PBS במשך 15 דקות כדי לחלחל לתאים. לשטוף פעמיים עם PBS במשך 5 דקות.
  18. לחסום 10% סרום עיזים / PBS במשך 20 דקות. תאטפי את הנסיוב. אל תתרחץ. הוסף נוגדן CD68 נגד עכברים (מדולל 1:100 ב- 1%BSA/PBS). דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לשטוף 3x ב PBS במשך 5 דקות כל אחד.
  19. הוסף עז נגד העכבר IgG אלקסה פלור 546 (מדולל 1:200 ב 1% BSA / PBS). דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות. לשטוף PBS במשך 5 דקות. נגד עם 1 μg / מ"ל Hoechst 33342 צבע בחושך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לשטוף 3x ב PBS במשך 5 דקות כל אחד.
  20. הפוך את הרדידות והתמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט עם האופטיקה הפוכה. לכוד תמונות בהגדלה של 200x עם הגדרות מסנן כחול ואדום.
  21. ספור את המונוציטים המצורפים בתמונות הבודדות ותחשב את ממוצעי הקבוצה ואת סטיות התקן.

תוצאות

משטחי מתכת מעובדים thiol-תגובתי עבור חיבור פפטיד באמצעות סדרה של שינויים כימיים, כפי שמוצג איור 1. דגירה PABT ואחריו טיפול PEI-PDT עושה את פני המתכת ניתן לחיבור פפטיד. פפטיד CD47 (pepCD47) המכיל שאריות ציסטאין ב C-terminus הצטרף לרצף פפסיק47 הליבה באמצעות גשר AEEAc כפול גמיש מחובר באופן קוולנטי ל?...

Discussion

אנו מדגימים ומתארים אסטרטגיה כימית חדשנית יחסית לצרף moieties פפטיד טיפולית על משטח נירוסטה במטרה overarching של הפחתת תגובתיות פני השטח עם תאים דלקתיים נמצאו בדם. הכימיה ביספוספונט המתואר בזאת כרוך תיאום היווצרות קשר בין תחמוצות מתכת וקבוצות ביספוספונט של PABT. העובי של מונושכבה פוליביספונט נוצר ?...

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

פיתוח פרוטוקולים מחקרים שהוצגו בנייר זה נתמכו על ידי מימון NIH (NBIB) R01 (# EB023921) ל- IF ו- SJS, ומימון NIH (NHLBI) R01 (# HL137762) ל- IF ו- RJL.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 M Tris-HCLInvitrogen15567-027pH - 7.5
4% GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16539-07
4% Sodium CitrateSigmaS5770
ACK lysing bufferQuality Biologicals118-156-721
anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)Biolegend202301
anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)Biolegend203501
anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)BD Biosciences550979
anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)BioRadMCA341
anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)Biolegend201701
Chloroform Certified ACSFisher ChemicalC298-500
Dimethyl Formammide (DMF)Alfa Aesar39117
Embra stainless steel gridElectron Microscopy SciencesE200-SSstainless steel mesh mesh disks
Ficoll HypaqueGE Healthcare17-1440-02
Glacial acetic acidACROS organic148930025
goat anti-mouse IgG Alexa FluorThermoFisherA11030
Heparin sodiumSagent Pharmaceuticals402-01
Human pepCD47Bachem4099101
IsopropanolFisher ChemicalA426P-4
Metal adaptersLeur Fitting6515IND1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end
MethanolRICCA chemical company4829-32
MicroscopeNikon EclipseTE300
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco14190-136
Pottasium Bicarbonate (KHCO3)Fisher ChemicalP184-500
PVC tubesTerumo-CVS600501/4" X 1/16 8'
sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chlorideElectron Microscopy Sciences11653
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Bio-Rad laboratories161-0302
Sodum actetate (C2H3NaO2)Alfa AesarA13184
Src peptideBachem4092599
Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumenMicrogroup, Medway, MA200973281 cm X 6 mm OD
Stainless steel foils (AISI 316L)Goodfellow, Coraopolis, PA100 mm X 100 mm X 0.05 mm
Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)Bachem4100277
TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Thermo ScientificPG82089
Tween-20Bio-Rad laboratories170-6531
Vybrant CFDA SE Cell Tracer KitInvitrogenV12883

References

  1. Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
  2. van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, 392584 (2013).
  3. Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
  4. Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
  5. Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
  6. Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
  7. Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
  8. Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
  9. Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
  10. Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
  11. vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  12. Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
  13. Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
  14. Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
  15. Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
  16. Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
  17. Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
  18. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
  19. Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
  20. vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
  21. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
  22. Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
  23. Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
  24. Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

166CD47

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved