JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada sunulan peptid CD47 (pepCD47) polibisfosfonat kimya kullanarak metal stentler için ekiçin bir protokoldür. PepCD47 kullanarak metal stentlerin fonksiyonelleştirilmesi inflamatuar hücrelerin bağlanmasını ve aktivasyonunu önler ve böylece biyouyumluluğunu artırır.

Özet

Çıplak metal stentler ve ilaç eluting stentleri ile ilişkili önemli komplikasyonlar sırasıyla in-stent restenozisi ve geç stent trombozudur. Bu nedenle, metal stentlerin biyouyumluluğunun iyileştirilmesi önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu protokolün amacı, endovasküler stentler de dahil olmak üzere, kanla temas eden tıbbi implantların biyouyumluluğunu artırmak için biyolojik olarak aktif peptidler tarafından metal yüzey modifikasyonu için sağlam bir teknik tanımlamaktır. CD47 kendini bir immünolojik tür-özgü belirteç ve anti-inflamatuar özelliklere sahiptir. Çalışmalar, ekstrasellüler bölgede CD47'nin Ig etki alanına karşılık gelen 22 amino asit peptidin (pepCD47), tam uzunlukta protein gibi anti-inflamatuar özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. Farelerde in vivo çalışmalar, ve bizim laboratuvardan tavşan ve insan kanı deneysel sistemlerde ex vivo çalışmalar metaller üzerinde pepCD47 immobilizasyon inflamatuar hücre eki ve aktivasyon önleyerek biyouyumluluğu artırdığını göstermiştir. Bu makalede, metal yüzeylerin ve peptit eki işlevselleştirilmesi için adım adım protokol açıklanmaktadır. Metal yüzeyler, gizli tiyol grupları (PABT) ile poliallilin bifosfat kullanılarak modifiye edilir ve ardından tiyollerin korunması ve piriyldithio grupları (PEI-PDT) ile yüklü polietileninile reaksiyon yoluyla tiyol-reaktif bölgelerin güçlendirilmesi sağlanır. Son olarak, pepCD47, bir çift 8-amino-3,6-dioksan-oktavoil spacer ile çekirdek peptid dizisine bağlı terminal sistein artıkları içeren, disülfür bağları ile metal yüzeye bağlı. Metal yüzeye peptit eki Bu metodoloji verimli ve nispeten ucuz ve böylece çeşitli metalik biyomalzemelerin biyouyumluluğu artırmak için uygulanabilir.

Giriş

Perkütan koroner girişim koroner arter hastalıkları (CAD) tedavisinde tedavinin ilk satırı ve öncelikle hastalıklı arterler stentleme içerir. Ancak stent restenozisi (ISR) ve stent trombozu stent konuşlandırma ile ilişkili sık karşılaşılan komplikasyonlardır1. Kan stent arayüzünde kan etkileşimi metal yüzeyinde plazma proteinlerinin neredeyse hemen adsorpsiyon ile karakterizedir, trombosit ve inflamatuar hücre eki ve aktivasyon takip2. Aktive inflamatuar hücrelerden inflamatuar sitokinler ve kemokinlerin salınımı, tunica media'daki vasküler düz kas hücrelerinin (VSMC) fenotibik modifikasyonuna yol açar ve merkezsel intimal bölmeye merkezsel göçlerini tetikler. İntimada aktive vsmc'nin çoğalması intimal tabaka kalınlaşması, lümen daralması3ve stent içi restenoz 3 ile sonuçlanır. VSMC proliferasyonlarını önlemek için uyuşturucu eluting stentleri (DES) geliştirilmiştir; ancak, bu ilaçların endotel hücreleri üzerinde hedef dışı sitotoksik etkisi var4,5. Bu nedenle, geç stent trombozu DESileilişkili sık görülen bir komplikasyondur6 ,7. Poli-L-laktit gibi biyolojik olarak parçalanabilir polimerlerden yapılmış stentler hayvan deneylerinde ve ilk klinik çalışmalarda çok umut vaat etmiş, ancak "gerçek hayattaki" klinik8kullanım3. Bu nedenle, daha iyi hasta sonuçları için çıplak metal stentbiyouyumluluğunu artırmak için bir ihtiyaç vardır.

CD47, konjenital reseptörSignal Regulatory Protein alpha (SIRPα)9'abağlandığında doğuştan gelen bağışıklık yanıtını inhibe eden her yerde ifade edilen transmembran proteinidir. SIRPα reseptörü bir bağışıklık hücresi tirozin inhibitör motifi vardır (ITIM) etki alanı ve SIRPα üzerine sinyal olaylar - CD47 etkileşimsonuçta inflamatuar hücre aktivasyonu10downregulation neden10 ,11,12,13. Laboratuarımızda araştırma rekombinant CD47 veya peptit türevi, CD47 (pepCD47) ekstrasellüler bölgenin 22 amino asit Ig etki alanına karşılık, klinik olarak ilgili biyomalzemeler14bir dizi ev sahibi bağışıklık yanıtı azaltabilir göstermiştir 14,15,16. Son zamanlarda, pepCD47 paslanmaz çelik stent yüzeylere hareketsiz olabilir ve önemli ölçüde restenosis ile ilişkili patofizyolojik yanıtı azaltmak göstermiştir. Not, pepCD47 modifiye yüzeyler uzun süreli depolama ve etilen oksit sterilizasyonu17gibi ilgili kullanım koşullarına uygundur. Bu amaçla, pepCD47 endovasküler stentlerin klinik sınırlamaları gidermek için yararlı bir terapötik hedef olabilir.

PepCD47'nin metal bir yüzeye kovalent bağlanması için strateji, metal yüzeyin inyeni kimyasal modifikasyonları içerir. Metal yüzeyler ilk olarak poliallilin bifosfonat ile gizli tiyol grupları (PABT) ile kaplanır ve ardından tiyollerin korunması ve polietilenin (PEI) yüklü piriyldithio grupları (PDT) ile bağlanması nı sağlar. PEI PDT grupları deprotected PABT tiols ile reaksiyonda tüketilmemiş sonra pepCD47 terminal sistein artıkları thiols içeren ile tepki, bir disülfür bağı ile metal yüzeyine bağlayıcı pepCD47 sonuçlanan14,17,18. Biz peptid maksimum yüzey immobilizasyonu ile sonuçlanan peptit giriş konsantrasyonu belirlemek için bir florofor konjuge pepCD47 (TAMRA-pepCD47) kullanılır. Son olarak, pepCD47 kaplı metal yüzeylerin akut ve kronik anti-inflamatuar kapasitesi, chandler döngü aparatı kullanılarak ex vivo ve monosit eki/makrofaj genleşme tayini sırasıyla değerlendirildi.

Bu kağıt, metal yüzeye tiolated peptidlerin bağlanması için sistematik bir protokol sağlar; peptidin maksimum hareketsizlik yoğunluğunun belirlenmesi; ve tam kan ve izole monositlere maruz kalan pepCD47 kaplamalı metal yüzeylerin anti-inflamatuar özelliklerini değerlendirmek.

Protokol

Bu deney için tüm insan örnekleri Philadelphia Çocuk Hastanesi IRB uyarınca elde edildi. Tüm hayvan deneyleri Philadelphia Çocuk Hastanesi IACUC onayı üzerine yapıldı.

1. Çıplak metal yüzeylerin PEI-PDT ile kapasımı

  1. Paslanmaz çelik folyo kuponları (1 cm x 1 cm veya 0,65 cm x 1 cm) veya paslanmaz çelik kafes diskleri bir shaker 'da (60 °C, 200 rpm hız) 5 dakika boyunca 2 izopropanol ile yıkayın. Bu adımı 2x gerçekleştirin. Daha sonra 2x kloroform (60 °C, hız 200 rpm) ile 10 dakika boyunca yıkayın.
  2. Temizlenmiş paslanmaz çelik numuneleri 220 °C'de 30 dk fırında pişirin.
  3. 25 mg poliallilin bifosfonat'ı latent tiyol grupları (PABT) ve 5 mg potasyum bikarbonat (KHCO3)5 mL DDW'de eriterek PABT çözeltisinin %0,5'inin 5 mL'sini hazırlayın ve 72 °C'de 30 dakika boyunca çalkalayıcı olarak kuluçkaya yatın.
    NOT: PABT sentezi için daha önce yayınlanmış literatür18bakın.
  4. Pişmiş folyoları veya kafes diskleri PABT'nin %0,5 sulu çözeltisi içine batırın ve 1 saat boyunca bir çalkalayıcıya (72 °C, 200 rpm hız) inkübatın.
  5. PABT modifiye edilmiş numuneleri 5 kat deiyonize edilmiş distile su (DDW) ile yıkayın, numuneleri yeni bir şişeye aktarın ve 5 kat için DDW ile tekrar yıkayın.
  6. 60 mg Tris (2 karboksitil) fosfin hidroklorür (TCEP) 5 mL 0,1 M asetik tampon (0,57 mL buzul asetik asit, 820 mg sodyum asetat 100 mL DDW) eriterek toplam 5 mL TCEP çözeltisi (12 mg/mL) hazırlayın.
  7. PABT modifiye edilmiş numuneleri 15 dakika oda sıcaklığında (RT) çalkalayıcı üzerinde TCEP ile tedavi edin.
    NOT: TCEP tiyol gruplarını korumak için kullanılır.
  8. Bir lyophilizer gibi bir vakum üreten cihaz kullanarak yuvarlak bir alt şişede Degas DDW ve 5x için gazsız DDW ile TCEP tedavi folyo veya örgü diskler yıkayın. Örnekleri yeni bir şişeye aktarın ve ayrıca gazsız DDW ile 5 kat yıkayın.
    NOT: Metal yüzeyindeki tiyollerin atmosferik oksijen le oksidasyonunu önlemek için hızlı çalışmak çok önemlidir.
  9. Gazsız DDW'de 212,5 μL pei-PDT ve 0,4 M sodyum asetat 212,5 μL seyrelterek %1 PEI-PDT çözeltisinin 5 mL'sini hazırlayın. Numunelerin atmosferik havaya maruz kalmasını en aza indirmek için adım 1.9'u adım 1.8 ile aynı anda gerçekleştirin.
    NOT: PEI-PDT sentezi daha önce yayınlanmışliteratürde 18açıklanmıştır.
  10. Yıkanmış paslanmaz çelik numuneleri %1 PEI-PDT ile kuluçkaya yatırın. Havayı argon gazıyla değiştirin, şişeleri hava geçirmez kapatın ve RT'de 1 saat çalkalayın. Ya hemen peptit çekimi ile devam edin ya da 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.

2. Florosemik mikroskopi ve florimetri kullanılarak metal yüzeyinde florofor konjuge pepCD47 retansiyonunun bağlanması ve nitel/nicel değerlendirilmesi

  1. Yıkama folyo kuponlar veya örgü diskler bölüm 1 açıklandığı gibi hazırlanan, ddw 5x ile yukarıda adımlar 1.1-1.10. Örnekleri yeni bir şişeye aktarın ve ek 5x için DDW ile yıkayın. Son olarak degassed etanol ve gazlı dimetil formamid (DMF) ile 2x yıkayın.
  2. Tamra konjuge pepCD47 tozunu gazsız dimetilformamid (DMF) içinde eriterek tetrametiloid (TAMRA)-konjuge pepCD47 stok çözeltisini 1 mg/mL'lik son konsantrasyona hazırlayın. Aliquot stok çözeltisi 1 mL tahsisatta. -20 °C'de argon atmosferinin altında iyi kapatılmış tüplerde saklayın.
  3. Tamra konjuge pepCD47 stok çözeltisinin seyreltilmesini 1 mg/mL ile gazsız DMF kullanarak aşağıdaki florofofor konjuge pepCD47 - 10, 30, 100 ve 200 μg/mL konsantrasyonlarını hazırlayın.
    NOT: TAMRA konjuge pepCD47 çöktürülmüş gibi görünüyorsa, 20 dk için RT, oran 1:1 TCEP boncukkullanarak stok TAMRA konjuge pepCD47 çözüm azaltmak. TCEP boncuklar için TAMRA konjuge pepCD47 eklemeden önce, TCEP boncuk çözeltisi spin, supernatant kaldırmak ve sonra TAMRA konjuge pepCD47 eklenmesi ile devam unutmayın.
  4. PEI-PDT modifiye folyo kuponları 1 saat boyunca argon atmosferi altında RT'de bir çalkalayıcı üzerinde her durum için triplicates TAMRA konjuge pepCD47 10, 30, 100 veya 200 μg/mL ile inkübon. Incubate PEI-PDT değiştirilmiş örgü diskler, yanı sıra 1 saat için bir shaker argon atmosfer altında RT de trilicates TAMRA konjuge pepCD47 100 μg/mL ile adım 1.2 (çıplak metal kontroller) ötesinde modifiye değil örgü disk.
    NOT: Bu adımdan itibaren şişeler, içindekileri ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarılır.
  5. Aşağıdaki sırayla kovalent bağlı olmayan peptid kaldırmak için florofor konjuge pepCD47 kaplı yüzeyleri yıkayın: DMF (3x), DMF/DDW 1:1, DDW (3x), 20 mM Tris pH 7.4'te %0.3 SDS (shaker'da 70 °C'de 3x, 5 dk), DDW (3x), şişeleri değiştirin ve son bir DDW yıkayın.
  6. Kontrol ve kovalent konjuge örgü diskleri bir mikroskop camı üzerine yerleştirin, 50 μL PBS ekleyin ve bir kapak kayması yerleştirin. Eşkenar dörtgen filtre seti ile donatılmış ters floresan mikroskobu kullanarak kafes diskleri görüntüleyin. 100x büyütmede temsili görüntüler alın.
  7. 1:1 v/v metanol ve 0.1 M asetik tampon karışımında 180 mg TCEP eriterek 12 mg/mL TCEP çözeltisinin 15 mL'sini hazırlayın.
  8. Her yıkanmış folyo15 dakika boyunca RT bir shaker üzerinde 1 mL TCEP çözeltisi ile inkübün.
  9. TAMRA konjuge pepCD47 stokunun (1 mg/mL) – 100 μg/mL, 10 g/mL, 1 μg/mL, 0.1 μg/mL ve 0.01 μg/mL'yi seri olarak seyrelterek aşağıdaki standartları hazırlayın. TCEP çözeltisini dilüent olarak kullanın.
  10. 544/590 nm uyarma ve emisyon dalga boylarında florimetri tarafından standartlar kullanılarak oluşturulan kalibrasyon eğrisine karşı metal yüzeyinden salınan TAMRA konjuge pepCD47'yi analiz edin.

3. PEI-PDT modifiye yüzeylere insan pepCD47 takmak

  1. PeI-PDT kaplamalı numuneleri bölüm 1'de açıklandığı gibi, yukarıdaki adım 1.1-1.10'u, gazdan arındırılmış DDW 5x ile yıkayın, şişeyi değiştirin ve gazdan arındırılmış DDW 5x ile yıkayın.
  2. İnsan pepCD47 stok çözeltisi (1 mg/mL) kurutarak insan pepCD47 tozunu gazsız %50 asetik asiter leyerek konsantrasyon1 mg/mL'yi elde edin.
  3. İnsan pepCD47 (100 μg/mL) insan pepCD47 stokunun 500 μL'sini 4.500 μL gazsız 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde eriterek çalışma konsantrasyonu hazırlayın.
  4. Yıkanmış PEI-PDT kaplı numuneleri 1 saat boyunca titreyerek RT'de 100 μg/mL pepCD47 ile inkübedin.
  5. Aşağıdaki sırada PBS (3x), DDW (3x), 0.2% Tween-20 (3x, 5 dk her), DDW (3x), şişeleri değiştirmek ve son DDW yıkama fazla peptid kaldırmak için insan pepCD47 kaplı örnekleri yıkayın.
    NOT: İnsan pepCD47 kaplamalı yüzeyler 4 °C'de 6 aya kadar kuru olarak saklanabilir.

4. PEI-PDT modifiye edilmiş yüzeylerin karıştırılmış sıra (Scr) ile kaplandırılma

  1. 1 mg/mL'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için çırpılmış sıra tozunu gazdan arındırılmış %0,1 asetik asitte çözün.
  2. 4.500 μL'lik gaz giderilmiş %0.1 asetik asitin 500 μL'sini eriterek 100 μg/mL'lik çırpılmış peptid çözeltisi hazırlayın.
  3. Yıkanmış PEI-PDT numunelerini RT'de 1 00 0g/mL'lik çırpılmış peptid ile 1 saat sallayarak katın.
  4. Bekar çırpılmış peptidkaldırmak için, aşağıdaki sırayla yüzeyleri yıkayın 0.01% asetik asit (3x), DDW (3x), 0.2% Tween-20 (3x, 5 dk), DDW (3x), şişeleri değiştirmek ve bir DDW yıkama.

5. Metal yüzeylere hücresel bağlanmayı analiz etmek için Chandler döngüsü

  1. Kat metal folyolar (0.65 cm x 1cm) ya insan pepCD47 veya 3 veya 4 takip bölüm 1 açıklamasına göre çırpılmış peptid ile.
  2. Üç 38 cm uzunluğunda parçalar halinde 1/4 "PVC tüpler kesin.
  3. Üç farklı tüpe 8 adete kadar değiştirilmemiş, karıştırılmış peptid veya pepCD47 modifiye edilmiş metal folyo yerleştirin.
  4. Kurumsal IRB protokolü uyarınca herhangi bir anti-trombosit ilaç ücretsiz sağlıklı insan donörlerden kan 30 mL toplamak. Toplanan kanın pıhtılaşmasını önlemek için 1 mL%4 sodyum sitrat içeren şırınganın önceden yüklenmesi.
  5. 10 mL şırınga kullanarak her tüpe 10 mL kan koyun ve uçları metal adaptörlerle bağlayın. Chandler döngü aparatının tekerleklerine kan dolu tüpler yerleştirin.
  6. 4 saat boyunca 25 dyns/cm2 makası üretmek için hesaplanan hızda 37 °C'de tekerlek rotasyonu ile metal folyolar boyunca kan geçirin.
  7. Tüplerden kan drenaj ve IRB gereksinimlerine göre kan atmak.
  8. Her tüpten folyo almak için neşter kullanarak tüpleri kesin.
  9. 0,1 M sodyum klorür ile 10 mL sodyum kacodylate tampon kullanarak% 4 glutaraldehit çözeltisi 10 ml seyrelterek% 2 glutaraldehit çözeltisi hazırlayın.
  10. Folyoları 15 dakika boyunca %2 glutaraldehit çözeltisi içinde kuluçkaya yatırın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Analiz etmeden önce metal folyoları PBS ile 3x yıkayın.

6. CFDA boya kullanarak metal yüzeylere hücresel bağlanmanın analizi

  1. 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosunda 15 mL tüpte 8 mL PBS Sıcak.
  2. 10 mM'lik stok konsantrasyonu elde etmek için CFDA (karboksi-floresan disetat, succinimidyl ester) boya çözeltisini hazırlayın - 10 mM'lik bir stok konsantrasyonu elde etmek için bir CFDA boya şişesine 90 μL DMSO ekleyin. Daha sonra, 8 mL sıcak PBS'ye CFDA stokunun 75 μL'sini ekleyerek 93,75 μM'lik çalışma konsantrasyonuna hazırlayın. Tüpleri birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve tüpü alüminyum folyo ile kaplayın.
    NOT: CfDA boyasını her kullanımdan önce taze olarak hazırlamak tavsiye edilir.
  3. Her folyoyu 24 kuyu plakalı 1 mL CFDA boya ile kuluçkaya yatırın. Plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Fazla boyayı çıkarmak için metal folyoları 3x PBS ile yıkayın. Ters floresan mikroskobu kullanarak görüntü.

7. PepCD47-modifiye edilmiş ve çıplak metal yüzeylerde monosit eki ve makrofaj genleşmesi

  1. 400-450 g erkek Sprague-Dawley sıçan kurban sırasında vena kava erişim yoluyla periferik kan 10 mL toplamak. Pıhtılaşmayı önlemek için hemen 1.000 IU sodyum heparin ile karıştırın.
  2. Pipet 10 mL yoğunluk gradyan orta 50 mL konik tüp içine. Pasteur pipeti kullanarak kanı 5 mL PBS ile karıştırın ve yoğunluk gradyan ortamının üzerinde dikkatlice seyreltilmiş kanı katlayın. 800 x g ve 18-25 °C'de 20 dk hızlanma ve yavaşlama ayarlarıyla sallanan kova rotorunda santrifüj.
  3. Pasteur pipeti kullanarak, plazma ve Ficoll arasındaki arayüz üzerinde buffy ceket opak bir tabaka toplamak. Seyreltik buffy kat 1:3 PBS ve santrifüj ile 550 x g ve 4 ° C için 10 dakika buffy kat hücreleri için.
  4. Kontamine eritrositleri lyse için 3 mL ACK lysis tamponundaki buffy coat hücrelerini yeniden askıya alın. 4 dakika buz üzerinde kuluçka. Hücre ayırma tamponunun 12 mL'sini ekleyin (CSB; %0.5 BSA, %0.5 FBS, 2 mM EDTA/PBS).
  5. Santrifüj 550 x g ve 4 °C 10 dakika. CSB'nin 10 mL'lik peletini yeniden askıya alın.
  6. Trombositleri ortadan kaldırmak için 10 dk için 200 x g ve 4 °C'de santrifüj. İki kez tekrarlayın.
  7. 500 μL CSB'de peleti yeniden askıya alın. Aşağıdaki fare anti-sıçan antikorlarının her biri 10 μg ekleyin: CD8a (klon OX-8), anti-CD5 (klon OX-19), anti-CD45RA (klon OX-33), ve anti-CD6 (klon OX-52).
  8. 1 saat boyunca dikey bir tüp rotatörü üzerinde 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Santrifüj 300 x g ve 4 °C 10 dakika. Supernatant atın, CSB 10 mL pelet yeniden askıya ve tekrar santrifüj.
  9. 500 μL CSB'de peleti yeniden askıya alın. Keçi anti-fare IgG mikroboncuklar 150 μL ekleyin. 20 dk. CSB 9,5 mL ekleyin dikey bir tüp rotator üzerinde 4 °C'de kuluçka. Santrifüj 300 x g ve 4 °C 10 dakika.
  10. Supernatant atın. CSB'nin 1 mL'lik peletini yeniden askıya alın.
  11. Manyetik ayırıcıya bir LS sütunu yerleştirin.  3 mL CSB ile LS sütununa asal. Sütun masını atın. Adım 7.10 yeniden askıya hücre pelet 1 mL ekleyin. Elde edilen işeyin isini toplamaya başlayın. Akış durduktan sonra, 5 mL CSB ekleyin ve akış durana kadar sütun çıkışını toplamaya devam edin.
  12. Negatif olarak seçilmiş monositleri içeren kolon çıkışını (6 mL) 300 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin. RPMI-1640 orta 2 mL ortaya çıkan küçük pelet yeniden askıya 10% FCS, 1% kalem / strep ve 100 ng / mL sıçan makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile desteklenmektedir.
  13. Hemositometre kullanarak monositleri say. Monosit konsantrasyonu 5 x 105 hücre/mL olarak ayarlayın.
  14. 1.1-1.10 ve 3.1-3.6 uyarınca fare pepCD47 (N=3) ile modifiye edilmiş çıplak paslanmaz çelik folyo numuneleri (N=3) veya paslanmaz çelik numuneleri ile 12 kuyu plakasının bireysel kuyularına 1 mL monosit süspansiyon ekleyin.
  15. 3 ve 5 gün sonra tohumlama orta değiştirin. Gün 6 post-tohumlama PBS ile hücreleri yıkayın ve 15 dakika oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit ile düzeltmek. 5 dakika PBS ile iki kez yıkayın.
  16. Paslanmaz çelik folyoları çıkarın ve yeni bir 12 kuyu plaka içine ayrı ayrı yerleştirin. Folyoları çevirmeyin.
  17. Hücreleri permeabilize etmek için 15 dakika için% 0.5 Tween-20/PBS inkübat. 5 dakika PBS ile iki kez yıkayın.
  18. 20 dk için % 10 keçi serumu/PBS blok. Serumu aspire edin. Yıkamayın. Fare anti-rat CD68 antikor (seyreltilmiş 1:100% 1 BSA / PBS) ekleyin. 1 saat oda sıcaklığında kuluçka. Her biri 5 dakika boyunca PBS'de 3 x yıkayın.
  19. Keçi anti-fare IgG Alexa Fluor 546 (seyreltilmiş 1:200% 1 BSA / PBS) ekleyin. 45 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. 5 dakika PBS'de yıkayın. 10 dakika oda sıcaklığında karanlıkta 1 μg/mL Hoechst 33342 boya ile karşı lekesi. Her biri 5 dakika boyunca PBS'de 3 x yıkayın.
  20. Ters optik ile floresan mikroskop kullanarak folyo ve görüntü çevirin. Mavi ve kırmızı filtre ayarlarıyla 200x büyütmede görüntüleri yakalayın.
  21. Tek tek görüntülerdeki ekli monositleri sayın ve grup ortalamalarını ve standart sapmaları hesapla.

Sonuçlar

Metal yüzeyler, Şekil 1'degösterildiği gibi bir dizi kimyasal modifikasyon yoluyla peptit eki için tiyol-reaktif hale getirilir. PEI-PDT tedavisinin ardından PABT kuluçka makinesi metal yüzeyini peptit eki için uygun hale getirir. C-terminus'ta sistein kalıntısı içeren peptid CD47 (pepCD47) esnek bir çift AEEAc köprüsü ile çekirdek pepCD47 dizisine katıldı ve disülfür bağları ile tiyol-reaktif yüzeylere kovalent olarak bağlıdır. Bu protokolü kullanarak, pepCD47'n...

Tartışmalar

Biz göstermek ve kanda bulunan inflamatuar hücreler ile yüzeyin reaktivitesini azaltmak için kapsamlı amacı ile paslanmaz çelik bir yüzeye terapötik peptid moieties eklemek için nispeten yeni bir kimyasal strateji açıklar. Burada açıklanan bifosfonat kimyası, metal oksitler ve PABT'nin bifosfonat grupları arasındaki koordinat bağı oluşumunu içerir. Metal yüzeyde oluşan polibisfosfonat monolayer kalınlığı 5 nm18aşmaz, ve bu nedenle, kalın polimer kaplamaların potansiye...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu makalede sunulan protokol geliştirme ve çalışmalar NIH (NBIB) R01 finansmanı (# EB023921) tarafından IF ve SJS'e, NIH (NHLBI) R01 finansmanı (# HL137762) ile IF ve RJL'ye desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 M Tris-HCLInvitrogen15567-027pH - 7.5
4% GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16539-07
4% Sodium CitrateSigmaS5770
ACK lysing bufferQuality Biologicals118-156-721
anti-CD45RA Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)Biolegend202301
anti-CD5 Ab (mouse anti-rat; clone OX-19)Biolegend203501
anti-CD6 Ab (mouse anti-rat; clone OX-52)BD Biosciences550979
anti-CD68 Ab (mouse anti-rat; clone ED-1)BioRadMCA341
anti-CD8a Ab (mouse anti-rat; clone OX-8)Biolegend201701
Chloroform Certified ACSFisher ChemicalC298-500
Dimethyl Formammide (DMF)Alfa Aesar39117
Embra stainless steel gridElectron Microscopy SciencesE200-SSstainless steel mesh mesh disks
Ficoll HypaqueGE Healthcare17-1440-02
Glacial acetic acidACROS organic148930025
goat anti-mouse IgG Alexa FluorThermoFisherA11030
Heparin sodiumSagent Pharmaceuticals402-01
Human pepCD47Bachem4099101
IsopropanolFisher ChemicalA426P-4
Metal adaptersLeur Fitting6515IND1 way adapter 316 ss 1/4"-5/16" hoes end
MethanolRICCA chemical company4829-32
MicroscopeNikon EclipseTE300
Phosphate buffered saline (PBS)Gibco14190-136
Pottasium Bicarbonate (KHCO3)Fisher ChemicalP184-500
PVC tubesTerumo-CVS600501/4" X 1/16 8'
sodium cacodylate buffer with 0.1M sodium chlorideElectron Microscopy Sciences11653
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Bio-Rad laboratories161-0302
Sodum actetate (C2H3NaO2)Alfa AesarA13184
Src peptideBachem4092599
Stainless steel (AISI 304) cylinder-shaped samples with a lumenMicrogroup, Medway, MA200973281 cm X 6 mm OD
Stainless steel foils (AISI 316L)Goodfellow, Coraopolis, PA100 mm X 100 mm X 0.05 mm
Tetramethylrhodamine-conjugated pepCD47 (TAMRA-pepCD47)Bachem4100277
TMB (3,3’ ,5,5’ -tetramethylbenzidine) substrate and tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Thermo ScientificPG82089
Tween-20Bio-Rad laboratories170-6531
Vybrant CFDA SE Cell Tracer KitInvitrogenV12883

Referanslar

  1. Buccheri, D., Piraino, D., Andolina, G., Cortese, B. Understanding and managing in-stent restenosis: a review of clinical data, from pathogenesis to treatment. Journal Thoracic Disease. 8 (10), 1150-1162 (2016).
  2. van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica. 2013, 392584 (2013).
  3. Mitra, A. K., Agrawal, D. K. In stent restenosis: bane of the stent era. Journal of Clinical Pathology. 59 (3), 232-239 (2006).
  4. Iqbal, J., Gunn, J., Serruys, P. W. Coronary stents: historical development, current status and future directions. British Medical Bulletin. 106, 193-211 (2013).
  5. Hoffmann, R., et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis. A serial intravascular ultrasound study. Circulation. 94 (6), 1247-1254 (1996).
  6. Stefanini, G. G., Windecker, S. Stent thrombosis: no longer an issue with newer-generation drug-eluting stents. Circulation: Cardiovascular Interventions. 5 (3), 332-335 (2012).
  7. Palmerini, T., et al. Clinical outcomes with bioabsorbable polymer- versus durable polymer-based drug-eluting and bare-metal stents: evidence from a comprehensive network meta-analysis. Journal of the American College of Cardiology. 63 (4), 299-307 (2014).
  8. Omar, W. A., Kumbhani, D. J. The Current Literature on Bioabsorbable Stents: a Review. Current Atherosclerosis Reports. 21 (12), 54 (2019).
  9. Slee, J. B., Christian, A. J., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Addressing the Inflammatory Response to Clinically Relevant Polymers by Manipulating the Host Response Using ITIM Domain-Containing Receptors. Polymers (Basel). 6 (10), 2526-2551 (2014).
  10. Oldenborg, P. A., et al. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. Science. 288 (5473), 2051-2054 (2000).
  11. vanden Berg, T. K., vander Schoot, C. E. Innate immune 'self' recognition: a role for CD47-SIRPalpha interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
  12. Tengood, J. E., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of CD47-modified biomaterials to mitigate the immune response. Experimental Biology Medicine (Maywood). 241 (10), 1033-1041 (2016).
  13. Tsai, R. K., Rodriguez, P. L., Discher, D. E. Self inhibition of phagocytosis: the affinity of 'marker of self' CD47 for SIRPalpha dictates potency of inhibition but only at low expression levels. Blood Cells, Molecules and Diseases. 45 (1), 67-74 (2010).
  14. Slee, J. B., et al. Enhanced biocompatibility of CD47-functionalized vascular stents. Biomaterials. 87, 82-92 (2016).
  15. Finley, M. J., et al. Diminished adhesion and activation of platelets and neutrophils with CD47 functionalized blood contacting surfaces. Biomaterials. 33 (24), 5803-5811 (2012).
  16. Stachelek, S. J., et al. The effect of CD47 modified polymer surfaces on inflammatory cell attachment and activation. Biomaterials. 32 (19), 4317-4326 (2011).
  17. Inamdar, V. V., et al. Stability and bioactivity of pepCD47 attachment on stainless steel surfaces. Acta Biomaterialia. 104, 231-240 (2020).
  18. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117 (16), 2096-2103 (2008).
  19. Moser, K. V., Humpel, C. Primary rat monocytes migrate through a BCEC-monolayer and express microglia-markers at the basolateral side. Brain Research Bulletin. 74 (5), 336-343 (2007).
  20. vander Giessen, W. J., et al. Marked inflammatory sequelae to implantation of biodegradable and nonbiodegradable polymers in porcine coronary arteries. Circulation. 94 (7), 1690-1697 (1996).
  21. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (1), 159-164 (2006).
  22. Mouro-Chanteloup, I., et al. Evidence that the red cell skeleton protein 4.2 interacts with the Rh membrane complex member CD47. Blood. 101 (1), 338-344 (2003).
  23. Finley, M. J., Clark, K. A., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. Intracellular signaling mechanisms associated with CD47 modified surfaces. Biomaterials. 34 (34), 8640-8649 (2013).
  24. Slee, J. B., Alferiev, I. S., Levy, R. J., Stachelek, S. J. The use of the ex vivo Chandler Loop Apparatus to assess the biocompatibility of modified polymeric blood conduits. Journal of Visualized Experiments. (90), e51871 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 166y zey i levselle tirmemetalimplantlarstentlerCD47inflamasyontrombozpeptidlerbiyokonjugasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır