שימוש בחיסון כדי לזהות נזק לדנ"א2.5המושרה בלבבות העוברים של דגי הזברה

Summary

פרוטוקול זה משתמש ב בדיקת אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות נזק DNA המושרה PM_2.5בלבם הניתח של עוברים דגי זברה.

Abstract

חשיפה חלקיקית עדינה סביבתית (PM_2.5)עלולה להוביל לרעילות התפתחותית של הלב, אך המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין אינם ברורים. 8-הידרוקסי-2'deoxygenase (8-OHdG) הוא סמן של נזק DNA חמצוני ו γH2AX הוא סמן רגיש עבור שברי גדיל כפול DNA. במחקר זה, אנו שואפים לזהות PM_2.5-המושרה 8-OHdG ו γH2AX שינויים בלב של עוברים דג זברה באמצעות בדיקת אימונופלואורסצנטיות. עוברים דגי זברה טופלו בעניינים אורגניים הניתנים לחילוץ (EOM) מ PM_2.5 ב 5 מיקרוגרם / מ"ל בנוכחות או היעדר נוגד חמצון N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC, 0.25 מיקרומטר) ב 2 שעות לאחר ההפריה (hpf). DMSO שימש כפקד רכב. ב 72 כ"ס, לבבות נותחו מעוברים באמצעות מחט מזרק קבוע וחלחל. לאחר שנחסמו, דגימות נבדקו עם נוגדנים ראשוניים נגד 8-OHdG ו γH2AX. לאחר מכן נשטפו הדגימות ודגרו בנוגדנים משניים. התמונות שהתקבלו נצפו תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וכימותו באמצעות ImageJ. התוצאות מראות כי EOM מ PM_2.5 משופר באופן משמעותי 8-OHdG ו γH2AX אותות בלב העוברים של דגי זברה. עם זאת, NAC, הפועל כנבלות חמצן תגובתי (ROS), נטרל חלקית את נזק ה- DNA שנגרם על ידי EOM. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אימונופלואורסצנטיות לחקירת תפקידו של נזק לדנ"א ב- PM 2.5 - מומים בלב הנגרמים על ידי PM_2.5שניתן להחיל על גילוי שינויים בביטוי חלבון סביבתי המושרה כימי בלבם של עוברים דגי זברה.

Introduction

זיהום אוויר הוא כיום בעיה סביבתית חמורה העומדת בפני העולם. חומר חלקיקי הסביבה בסדר (PM_2.5), שהוא אחד האינדיקטורים החשובים ביותר של איכות האוויר, יכול לשאת מספר רב של חומרים מזיקים ולהיכנס למערכת הדם, גרימת נזק חמור לבריאות^{האדם 1}. מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי חשיפה PM_2.5 יכול להוביל לסיכון מוגבר של מומים מולדים בלב (CHDs)^2,3. עדויות מניסויים בבעלי חיים הראו גם כי PM_2.5 יכול לגרום להתפתחות לב חריגה בעוברי דגי זברה וצאצאים של עכברים, אבל המנגנונים המולקולריים של הרעילות ההתפתחותית הלבבית של PM_2.5 עדיין לא ידוע במידה רבה^4,5,6.

נזק לדנ"א יכול לגרום למעצר מחזור התא ולגרום לאפופטוזיס, אשר עלול להרוס בהרחבה את הפוטנציאל של תאים אבות, וכתוצאה מכך, לפגוע בהתפתחות הלב⁷⁾. זה כבר מתועד היטב כי מזהמים סביבתיים, כולל PM_2.5, יש פוטנציאל לתקוף DNA באמצעות מנגנוני עקה חמצונית^8,9. הן התפתחות הלב האנושי והן של דג הזברה רגישים ללחץ חמצוני^10,11,12. 8-OHdG הוא סמן נזק DNA חמצוני, ואות γH2AX הוא סמן של שברי גדיל כפול DNA. N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC), מבשר סינתטי של ציסטאין תאי וגלוטתיון, נמצא בשימוש נרחב כתרכובת נוגד חמצון. במחקר זה, אנו משתמשים NAC כדי לחקור את התפקיד של עקה חמצונית PM_2.5- נזק DNA המושרה¹³.

דגי זברה כעליית חוליות מודל שימשו באופן נרחב לחקר התפתחות הלב ומחלות לב וכלי דם אנושיים מכיוון שמנגנונים של התפתחות הלב נשמרים מאוד בקרב בעלי חוליות^14,15. היתרונות של שימוש בדגי זברה כמודל כוללים את גודלם הקטן, יכולת הרבייה החזקה ועלות האכלה נמוכה. עניין מיוחד במחקרים אלה, עוברים דג זברה אינם תלויים במערכת הדם במהלך ההתפתחות המוקדמת ויכולים לשרוד מום לב חמור¹⁴. יתר על כן, השקיפות שלהם מאפשרת את כל הגוף להיות נצפה ישירות תחת מיקרוסקופ. לכן, עוברים דגי זברה מספקים הזדמנות יוצאת דופן להערכת המנגנונים המולקולריים המעורבים בגיוס רעילות התפתחותית לבבית כתוצאה מחשיפה לכימיקלים סביבתיים שונים^5,16,17. דיווחנו בעבר כי PM_2.5- סטרס חמצוני המושרה מוביל לנזק DNA אפופטוזיס, וכתוצאה מכך מומים בלב דג זברה¹⁸. במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחקירת נזק DNA המושרה PM_2.5בלב העוברים של דגי זברה.

Protocol

דגי זברה מסוג בר (AB) המשמשים במחקר זה התקבלו ממרכז המשאבים הלאומי לדגי זברה בווהאן, סין. כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן נבדקו ואושרו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים של ועדת האתיקה של אוניברסיטת סוכו.

1._2.5 דגימה ומיצוי תרכובות אורגניות

הערה: PM_2.5 נאסף באזור עירוני בסוז'ואו, סין, 1-7 באוגוסט 2015, כפי שתואר קודם לכן⁵.

1. אופים מסנני קרום קוורץ 47 מ"מ בכבשן עמעם של 500 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי להסיר את הרכיבים האורגניים.
2. מקם מסנן בסמפלר PM_2.5 למשך 24 שעות של דגימה ללא הפרעה.
3. מוציאים את המסנן ומייבשים למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
4. כימת את המסנן עם איזון אנליטי.
5. לחלץ רכיבים אורגניים מהמסנן על ידי מיצוי Soxhlet באמצעות dichloromethane כמו ממס¹⁹.
6. יבש את EOM על ידי אידוי סיבובי באמבט מים 60 °C וזרימת חנקן. להמיס EOM ב- DMSO ולאחסן ב -20 °C (70 °F).

2. איסוף וטיפול בעוברי דגי זברה

1. שמור על דג הזברה ב 28.5 ± 0.5 °C (5 °F) במערכת חקלאות ימית במחזור מחדש עם מחזור פוטופריוד 14 שעות ו 10 שעות כהה photoperiod.
2. הניחו דגי זברה בוגרים בריאים במיכל ביחס של 2:1 בין זכר לנקבה.
3. למחרת, לאסוף את העוברים ולשטוף אותם עם מי מערכת (כלומר, מי רבייה של דגי זברה).
4. בחר וחלק באופן אקראי עוברי דגי זברה המדגים התפתחות נורמלית (גודל אחיד, דגנים מלאים וללא קרישת ביצים) ל-4 קבוצות בצלחות פטרי מזכוכית בודדות בקוטר של 7 ס"מ (כ-50 עוברים למנה).
5. לטפל בעוברים עם PM_2.5 (5 מ"ג / ליטר) בנוכחות או היעדר NAC ב 0.25 מיקרומטר מ 2 כ"ס עד 72 כ"ס. השתמש ב- DMSO כפקד רכב לריכוז סופי של 0.1% (v/v).

3. תצפית מורפולוגית של עוברים דגי זברה ניתור לב

1. ב 72 כ"ס, להעביר עוברים שקופיות זכוכית להתבונן תחת מיקרוסקופ סטריאו. הקלט מומים בלב, כגון בצורת קרום הלב, לולאה שונה, וירידה בגודל.
2. חשב שיעורי מום (אחוז העוברים עם מומים בלב מתוך סך העוברים החיים) ולנתח הבדלים בין קבוצות באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של טורקיה (p < 0.05 = מובהק סטטיסטית).
3. למרדים את העוברים עם 0.6 מ"ג / מ"ל MS-222 כדי לשתק אותם על מגלשות זכוכית.
4. הקלט פעימות לב עבור 30 s ולכומת את קצב הלב באמצעות תוכנת ImageJ^5,20.
5. לנתח לבבות מעוברי דגי זברה עם מחט מזרק חד פעמית תחת מיקרוסקופ סטריאו. אזהרה: הימנעו מהריסת צורת הלב.

4. אימונופלואורסצנטיות

1. כדי להשתמש בבדיקת אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות נזק DNA המושרה PM_2.5 בלב העוברים של דגי זברה, השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול בצד זכוכית נקי.
2. הוסף 50 μL של 4% paraformaldehyde כדי 1.25 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי להפוך פתרון קבוע.
3. מניחים 3 לבבות ניתחו לתוך מעגל עט מחסום הידרופובי אחד ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
4. דקת הפתרון מתחת למיקרוסקופ ולייבש את הדגימות בטמפרטורת החדר לפחות 5 דקות, כך הלבבות מחוברים לחלוטין שקופיות זכוכית.
5. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS עם 0.1% Tween 20 (PBST) במשך 5 דקות לכביסה.
6. הוסף 50 μL של אלבומין סרום בקר (BSA) כדי 1000 μL של PBST כדי להשיג פתרון 5% BSA ודגורת השקופיות בתא לח עבור 1 שעה כדי לחסום כריכת נוגדנים ספציפית.
7. Decant הפתרון לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות לכל לשטוף.
8. לדלל 2 μL של נוגדן חד שבטי עכבר נגד 8-OHdG ו 2 μL של נוגדן פוליקלונלי ארנב נגד γH2AX ב 296 μL של PBST כדי להשיג פתרון קוקטייל נוגדנים ראשוני עובד.
9. לדגור את דגימות הלב עם 50 μL של פתרון קוקטייל הנוגדנים העיקרי נגד 8-OHdG ו γH2AX בתא לח לפחות שעה אחת בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (דגירה לילה יכול להגביר את עוצמת האות).
10. Decant הפתרון לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות לכל לשטוף.
11. לדלל 1 μL של נוגדן משני נגד עכבר עיזים תווית FITC ו 1 μL של נוגדן משני נגד ארנב עז cy3 ב 498 μL של PBST כדי להשיג פתרון קוקטייל נוגדנים משני עובד ודגורת הדגימות עם הנוגדנים המשניים (1:500 ב PBST) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
12. פירוק הפתרון ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות לכל לשטוף מוגן מפני אור.
13. הוסף 20 μL של DAPI (4',6-diamidino-2-פנילינדול) לדגימות עבור כתמים גרעיניים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
14. יש למרוח כיסוי על החלקה ולאטום עם לק כדי למנוע ייבוש ותנועה. לאחר מכן צלם את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכמת את אות הפלואורסצנטיות של אזור הלב באמצעות תוכנת ImageJ. חשב את השינויים היחסיים עם הממוצע של דגימות פקד DMSO. קבע את המשמעות הסטטיסטית של הנתונים כמו בשלב 3.2.

תוצאות

בדיקה חיסונית זו היא שיטה רגישה וספציפית למדידת שינויים בביטוי חלבונים בליבם של עוברים דגי זברה החשופים לכימיקלים סביבתיים.

בניתוח מייצג זה, עוברים שנחשפו PM_2.5 בהיעדר או נוכחות של NAC נוגד חמצון הוערכו לנוכחות של מומים בלב (

Discussion

למרות דג זברה הוא מודל בעל חוליות מצוין לחקר הרעילות ההתפתחותית הלבבית של כימיקלים סביבתיים, בשל הגודל הקטן של הלב העובר, קשה להשיג מספיק חלבון לניתוח כתם מערבי. לכן, אנו מציגים שיטה חיסונית רגישה לכימות רמות ביטוי החלבון של סמנים ביולוגיים נזק DNA בלבם של עוברים דג זברה חשוף PM_2.5.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-OHdG Antibody	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-66036	Primary antibody
Analytical balance	Sartorius,China	BSA124S
BSA	Solarbio,Beijing,China	SW3015	For blocking
DAPI	Abcam, USA	ab104139	For nuclear counterstain.
DMSO	Solarbio,Beijing,China	D8371
Fluorescence microscope	Olympus, Japan	IX73	For imaging fluorescence signals/
Goat Anti-Rabbit IgG Cy3	Carlsbad,USA	CW0159	Secondary antibody
Goat Anti-Rabbit IgG FITC	Carlsbad,USA	RS0003	Secondary antibody
N-Acetyl-L-cysteine(NAC)	Adamas-Beta, Shanghai, China	616-91-1
Orbital shaker	QILINBEIER,China	TS-1
Paraformaldehyde	Sigma,China	P6148	Make 4% paraformaldehyde for fixation.
Phosphate Buffered Saline	HyClone,USA	SH30256.01	Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.
PM2.5 sampler	TianHong,Wuhan, China	TH-150C	For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.
Re-circulating aquaculture system	HaiSheng,Shanghai,China		The zebrafish was maintained in it.
Soxhlet extractor	ZhengQiao,Shanghai, China	BSXT-02	For organic components extraction.
Stereomicroscope	Nikon,Canada	SMZ645	For heart dissection from zebrafish embryos.
Tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma,China	E10521	To anesthetize zebrafish embryos
Tween 20	Sigma,China	P1379
γH2AX Antibody	Abcam, USA	ab26350	Primary antibody