Usando imunofluorescência para detectar danos de DNA induzidos por PM2.5em corações embrionários de zebrafish

Resumo

Este protocolo usa um ensaio de imunofluorescência para detectar danos de DNA induzidos por PM_2.5nos corações dissecados de embriões de zebrafish.

Resumo

A exposição de partículas finas ambientes (PM_2.5) pode levar à toxicidade do desenvolvimento cardíaco, mas os mecanismos moleculares subjacentes ainda não estão claros. 8-hidroxi-2'desoxygenase (8-OHdG) é um marcador de dano oxidativo de DNA e γH2AX é um marcador sensível para quebras de fios duplos de DNA. Neste estudo, tivemos como objetivo detectar alterações de PM_2.5-Induzidas 8-OHdG e γH2AX no coração de embriões de zebrafish usando um ensaio de imunofluorescência. Os embriões de zebrafish foram tratados com questões orgânicas extrativáveis (EOM) a partir de PM_2,5 a 5 μg/mL na presença ou ausência de antioxidante N-acetil-L-cisteína (NAC, 0,25 μM) a 2 h pós fertilização (hpf). O DMSO foi usado como controle de veículos. Com 72 cv, os corações foram dissecados a partir de embriões usando uma agulha de seringa e fixos e permeabilizados. Após serem bloqueadas, as amostras foram sondadas com anticorpos primários contra 8-OHdG e γH2AX. As amostras foram então lavadas e incubadas com anticorpos secundários. As imagens resultantes foram observadas sob microscopia de fluorescência e quantificadas por ImageJ. Os resultados mostram que os sinais de EOM de PM_2.5 aumentaram significativamente os sinais 8-OHdG e γH2AX no coração dos embriões de zebrafish. No entanto, o NAC, agindo como um carniceiro reativa de oxigênio (ROS), contra-ativou parcialmente o dano de DNA induzido pelo EOM. Aqui, apresentamos um protocolo de imunofluorescência para investigar o papel dos danos de DNA em defeitos cardíacos induzidos por PM_2,5que podem ser aplicados à detecção de mudanças de expressão de proteínas induzidas por químicos ambientais nos corações dos embriões de zebrafish.

Introdução

A poluição do ar é agora um sério problema ambiental enfrentado pelo mundo. Partículas finas ambientes (PM_2.5),que é um dos indicadores mais importantes da qualidade do ar, podem transportar um grande número de substâncias nocivas e entrar no sistema circulatório sanguíneo, causando sérios danos à saúde humana¹. Estudos epidemiológicos demonstraram que a exposição à PM_2,5 pode levar a um risco aumentado de defeitos cardíacos congênitos (CHDs)^2,3. Evidências de experimentos em animais também mostraram que a PM_2.5 pode causar desenvolvimento cardíaco anormal em embriões de zebrafish e na prole de camundongos, mas os mecanismos moleculares da toxicidade do desenvolvimento cardíaco de PM_2.5 ainda são amplamente desconhecidos^4,5,6.

Danos no DNA podem causar apreensão do ciclo celular e induzir apoptose, que pode destruir extensivamente o potencial das células progenitoras e, consequentemente, prejudicar o desenvolvimento cardíaco⁷⁾. Foi bem documentado que os poluentes ambientais, incluindo o PM_2.5,têm potencial para atacar o DNA através de mecanismos de estresse oxidativo^8,9. Tanto o desenvolvimento cardíaco humano quanto o zebrafish são sensíveis ao estresse oxidativo^10,11,12. 8-OHdG é um marcador de dano de DNA oxidativo, e o sinal γH2AX é um marcador de quebras duplas de dna. N-acetil-L-cisteína (NAC), um precursor sintético de cisteína intracelular e glutationa, é amplamente utilizado como um composto antioxidante. Neste estudo, utilizamos o NAC para investigar o papel do estresse oxidativo na PM_2.5- dano de DNA induzido¹³.

O zebrafish como vertebrado modelo tem sido amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento cardíaco e doenças cardiovasculares humanas porque os mecanismos de desenvolvimento cardíaco são altamente conservados entre vertebrados^14,15. As vantagens de usar o zebrafish como modelo incluem seu pequeno tamanho, forte capacidade reprodutiva e baixo custo de alimentação. De particular interesse para esses estudos, os embriões de zebrafish não dependem do sistema circulatório durante o desenvolvimento precoce e podem sobreviver à malformação cardíaca grave¹⁴. Além disso, sua transparência permite que todo o corpo seja diretamente observado sob um microscópio. Assim, os embriões de zebrafish proporcionam uma excelente oportunidade para avaliar os mecanismos moleculares envolvidos na indução da toxicidade do desenvolvimento cardíaco como resultado da exposição a diversos produtos químicos ambientais^5,16,17. Informamos anteriormente que o estresse oxidativo induzido por PM_2.5leva a danos no DNA e à apoptose, resultando em malformações cardíacas em zebrafish¹⁸. Neste estudo, fornecemos um protocolo detalhado para investigar danos de DNA induzidos por PM_2.5no coração de embriões de zebrafish.

Protocolo

Os zebrafish do tipo selvagem (AB) utilizados neste estudo foram obtidos no Centro Nacional de Recursos de Zebrafish em Wuhan, China. Todos os procedimentos de animais aqui descritos foram revisados e aprovados pela Instituição de Cuidados Com Animais do Comitê de Ética da Universidade de Soochow.

1. PM_2.5 amostragem e extração de compostos orgânicos

NOTA: PM_2.5 foi coletado em uma área urbana em Suzhou, China, 1-7 de agosto de 2015, como descrito anteriormente⁵.

1. Asse filtros de membrana de quartzo de 47 mm em um forno de muffle de 500 °C por 2 h para remover os componentes orgânicos.
2. Coloque um filtro em um amostrador PM_2.5 para 24 horas de amostragem ininterrupta.
3. Retire o filtro e seque por 24 horas em temperatura ambiente.
4. Quantifique o filtro com um equilíbrio analítico.
5. Extrair componentes orgânicos do filtro por extração soxhlet usando diclorometano como solvente¹⁹.
6. Seque o EOM por uma evaporação rotativa em um banho de água de 60 °C e fluxo de nitrogênio. Dissolver eOM no DMSO e armazenar a -20 °C.

2. Coleta e tratamento de embriões de zebrafish

1. Mantenha o zebrafish a 28,5 ± 0,5 °C em um sistema de aquicultura re-circulante com luz de 14 h e ciclo fotoperodo escuro de 10h.
2. Coloque zebrafish adulto saudável em um tanque a uma proporção de 2:1 masculino e feminino.
3. No dia seguinte, recolham os embriões e lave-os com água do sistema (ou seja, água de reprodução de zebrafish).
4. Selecione e divida aleatoriamente embriões de zebrafish demonstrando um desenvolvimento normal (tamanho uniforme, grãos completos e sem coagulação de ovos) em 4 grupos em pratos petri de vidro individuais com um diâmetro de 7 cm (cerca de 50 embriões por prato).
5. Trate os embriões com PM_2.5 (5 mg/L) na presença ou ausência de NAC a 0,25 μM de 2 cvf até 72 cvf. Use o DMSO como controle de veículo para uma concentração final de 0,1% (v/v).

3. Observação morfológica de embriões de zebrafish e dissecção cardíaca

1. A 72 cvf, transfira embriões para lâminas de vidro e observe sob um microscópio estéreo. Registra malformações cardíacas, como edema pericárdico, looping alterado e diminuição do tamanho.
2. Calcular taxas de malformação (a porcentagem de embriões com defeitos cardíacos fora do total de embriões vivos) e analisar diferenças entre grupos que utilizam ANOVA unidirecional seguido do Teste de Comparação Múltipla da Turquia (p < 0,05 = estatisticamente significante).
3. Anestesiar os embriões com 0,6 mg/mL MS-222 para imobilizá-los em lâminas de vidro.
4. Grave batimentos cardíacos para 30 s e quantifique as frequências cardíacas usando o software ImageJ^5,20.
5. Disseque corações de embriões de zebrafish com uma agulha de seringa descartável sob um microscópio estéreo. Atenção: Evite destruir a forma do coração.

4. Ensaio de imunofluorescência

1. Para usar um ensaio de imunofluorescência para detectar danos de DNA induzidos por PM_2.5 no coração de embriões de zebrafish, use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo em um lado de vidro limpo.
2. Adicione 50 μL de 4% de paraformaldeído a 1,25 mL de Salina Tamponada fosfato (PBS) para fazer uma solução fixa.
3. Coloque 3 corações dissecados em um círculo de caneta de barreira hidrofóbica e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente.
4. Decante a solução sob o microscópio e seque as amostras à temperatura ambiente por pelo menos 5 minutos, de modo que os corações se apeguem completamente aos slides de vidro.
5. Lave os slides três vezes em PBS com 0,1% Tween 20 (PBST) por 5 min por lavagem.
6. Adicione 50 μL de albumina de soro bovino (BSA) a 1000 μL de PBST para obter uma solução BSA de 5% e incubar os slides em uma câmara úmida por 1h para bloquear a ligação de anticorpos não específicos.
7. Decante a solução e lave as amostras três vezes com PBST por 5 minutos por lavagem.
8. Diluir 2 μL de anticorpo monoclonal do rato contra 8-OHdG e 2 μL de anticorpo policlonal de coelho contra γH2AX em 296 μL de PBST para obter uma solução de coquetel de anticorpos primários em funcionamento.
9. Incubar as amostras cardíacas com 50 μL da solução primária de coquetel de anticorpos contra 8-OHdG e γH2AX em uma câmara umidificada por pelo menos uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C (a incubação noturna pode aumentar a intensidade do sinal).
10. Decante a solução e lave as amostras três vezes com PBST por 5 minutos por lavagem.
11. Diluir 1 μL de anticorpo secundário anti-rato de cabra com rótulo FITC e 1 μL de anticorpo secundário anti-coelho de cabra cy3 em 498 μL de PBST para obter uma solução de coquetel de anticorpos secundários funcionando e incubar as amostras com os anticorpos secundários (1:500 em PBST) por 1 h à temperatura ambiente no escuro.
12. Decante a solução e lave as amostras três vezes com PBS por 5 minutos por lavagem protegida da luz.
13. Adicione 20 μL de DAPI (4',6-diamidino-2-fenildole) às amostras para coloração nuclear por 30 minutos à temperatura ambiente.
14. Aplique uma mancha de cobertura para deslizar e selar com esmalte para evitar secagem e movimento. Em seguida, imagem as amostras sob um microscópio de fluorescência e quantificar o sinal de fluorescência da área cardíaca usando o software ImageJ. Calcule as alterações relativas com a média das amostras de controle DMSO. Determinar a significância estatística dos dados como na etapa 3.2.

Resultados

Este ensaio de imunofluorescência é um método sensível e específico para medir mudanças de expressão proteica nos corações dos embriões de zebrafish expostos a produtos químicos ambientais.

Nesta análise representativa, foram avaliados embriões expostos à PM_2,5 na ausência ou presença do NAC antioxidante para a presença de malformações cardíacas(Figura 1). Como observa...

Discussão

Embora o zebrafish seja um excelente modelo vertebrado para estudar a toxicidade do desenvolvimento cardíaco de produtos químicos ambientais, devido ao pequeno tamanho do coração embrião, é difícil obter proteína suficiente para análise de manchas ocidentais. Por isso, apresentamos um método sensível de imunofluorescência para quantificar os níveis de expressão proteica dos biomarcadores de dano de DNA nos corações dos embriões de zebrafish expostos à PM_2.5.

Durant...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-OHdG Antibody	Santa Cruz Biotechnology, USA	sc-66036	Primary antibody
Analytical balance	Sartorius,China	BSA124S
BSA	Solarbio,Beijing,China	SW3015	For blocking
DAPI	Abcam, USA	ab104139	For nuclear counterstain.
DMSO	Solarbio,Beijing,China	D8371
Fluorescence microscope	Olympus, Japan	IX73	For imaging fluorescence signals/
Goat Anti-Rabbit IgG Cy3	Carlsbad,USA	CW0159	Secondary antibody
Goat Anti-Rabbit IgG FITC	Carlsbad,USA	RS0003	Secondary antibody
N-Acetyl-L-cysteine(NAC)	Adamas-Beta, Shanghai, China	616-91-1
Orbital shaker	QILINBEIER,China	TS-1
Paraformaldehyde	Sigma,China	P6148	Make 4% paraformaldehyde for fixation.
Phosphate Buffered Saline	HyClone,USA	SH30256.01	Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.
PM2.5 sampler	TianHong,Wuhan, China	TH-150C	For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.
Re-circulating aquaculture system	HaiSheng,Shanghai,China		The zebrafish was maintained in it.
Soxhlet extractor	ZhengQiao,Shanghai, China	BSXT-02	For organic components extraction.
Stereomicroscope	Nikon,Canada	SMZ645	For heart dissection from zebrafish embryos.
Tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma,China	E10521	To anesthetize zebrafish embryos
Tween 20	Sigma,China	P1379
γH2AX Antibody	Abcam, USA	ab26350	Primary antibody