השתלת מקרופאגים לב של עכבר יילודים בעכברים בוגרים

Summary

אנו מספקים פרוטוקול להפרדת מקרופאג ' לב יילודים והשתלה ללב עכבר מבוגר, אשר יכול להיות דרך מבטיחה לקדם תיקון לב.

Abstract

בשריר הלב בילודים הפצוע, מקרופאגים מקלים על התפשטות קרדיומיוצית ואנגיוגנזה ומקדמים התחדשות לב. המחקר הנוכחי מגלה כי השתלת מקרופאגים לב ילודים שגויסו על ידי פגיעה מקדמת התחדשות הלב למבוגרים לאחר אוטם שריר הלב עם שיפור תפקוד הלב והתפשטות cardiomyocyte. התוצאות מצביעות על כך השתלת מקרופאג ' לב יילודים יכול להיות אסטרטגיה מבטיחה לטיפול בפציעות לב. כאן, אנו מספקים את הפרטים הטכניים, כולל בידוד של מקרופאגים לב יילודים מלבבות עכבר יילודים פגועי כריתה אפיקלית, השתלת מקרופאגים לעכברים בוגרים עם שריר הלב, והערכה של התחדשות הלב לאחר השתלת מקרופאג '.

Introduction

התחדשות הלב היא אסטרטגיה מבטיחה לשחזר את תפקוד הלב לאחר פגיעה לבבית ולהגן מפני אי ספיקת לב^1,2,3. בעקבות פציעה בשריר הלב, מקרופאגים לחדור ללב הפגרע ונחקרו כגורמים העיקריים במהלך התחדשות הלב יילודים^4,5,6. מלבד ניקוי פסולת תאית נמקית וגרימת דלקת, מקרופאגים מקדמים אנגיוגנזה⁵ והתפשטות קרדיומיוצית⁷ לאחר אוטם שריר הלב של עכברי יילודים.

המחקר הקודם שלנו ממחיש כי השתלת מקרופאגים לב יילודים מבודדים מלב יילודים פצוע משפר התחדשות הלב למבוגרים⁷, המציין כי השתלת מקרופאג 'לב יילודים יכול להיות אסטרטגיה מבטיחה לטיפול בפגיעה לבבית. כאן אנו מספקים את הפרטים הטכניים, כולל בידוד של מקרופאגים לב ילודים מלבבות עכבר יילודים פגועי כריתה, השתלת מקרופאגים לעכברים בוגרים עם שריר הלב, והערכת התחדשות הלב לאחר השתלת המקרופאג ' (איור 1).

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם למדריך לשימוש וטיפול בחיות מעבדה. כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC), בית החולים Fuwai, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה. טכניקה אספטית נדרשת לאורך כל ההליך כדי למנוע זיהום של האתר הכירורגי.

1. פעולת כריתה אפית בעכבר Cx3cr1 ^GFP/+ בן יום יילודים (רקעC57BL/6)

1. הרדמה
   1. תוציא את כל גורי העכברים מהכלובים ותכניס אותם לקופסה יבשה ונקייה.
   2. הטמע כל עכבר בקרח במשך כ 2-3 דקות. ודא שיש מחסום דק כגון לטקס או גזה בין הקרח לבין גור העכבר כדי למנוע כוויות קור.
   3. זהה הרדמה מספקת על ידי התבוננות בסימנים הבאים: עור חיוור, חוסר תנועת גפיים, וחוסר רפלקס דוושה.
2. בית החזה
   1. יש להקדים את פלטפורמת ההפעלה של הברונזה למשך הלילה ב-20 מעלות צלזיוס כדי לסייע בשמירה על הרדמה.
   2. הוציאו את העכבר המרדים מקופסת הקרח ושמו אותו על משטח הפעלה מברונזה. עגן את העכבר על פלטפורמת ההפעלה בתנוחה על-סופית באמצעות סרט הדבקה רפואי.
   3. שים את פלטפורמת ההפעלה עם העכבר עליה מתחת לסטריאוסקופ.
   4. לחטא את תיבת העכבר באמצעות כרית הכנה ספוג betadine ו 70% אלכוהול או עולה בקנה אחד עם מדיניות מוסדית.
   5. יש להסית את העור עם חתך של 1 ס"מ באזור הבין-צילוגי הרביעי של חלל החזה ולאחר מכן להפריד את השרירים הבין-ציליים באמצעות מספריים מיקרו-כירורגיים עד שהלב נגיש.
   6. לחלופין לחץ על החזה והבטן בעזרת שני מלקחיים עד הלב הוא חיצוני מתוך החזה ללא כל נזק מכני.
   7. הגדר את הצלעות מתחת ומעל החתירה הקטנה כקיבעון טבעי כדי לשתק את הלב.
3. כריתת פסגת חדרית
   1. אתר את פסגת החדר השמאלי. חותכים קוטר של 1 מ"מ של רקמת פסגת חדרית באמצעות מספריים iridectomy מתחת לסטריאוסקופ.
   2. אשר כי חדר הלב השמאלי חשוף, ולהתחיל נוטף.
   3. לחץ בעדינות על הלב בחזרה לחלל החזה באמצעות צמר גפן.
   4. לתפור את השרירים, הצלעות והעור באמצעות 8-0 תפרים פרוליים.
   5. נקה את העכבר ביסודיות לאחר הפעולה.
4. טיפול לאחר הניתוח
   1. העבר את העכבר מפלטפורמת ההפעלה לשמיכת חימום של 37 מעלות צלזיוס כדי לחמם את הגוף מיד לאחר הניתוח.
   2. אשר אנביוזיס של העכבר על ידי התבוננות בסימנים הבאים: שחזור נשימה ספונטני, שינוי צבע העור חיוור לוורוד, ותנועה של גפיים.
   3. קח את העכבר המופעל בחזרה לאמו ברגע שהוא התאושש.
   4. יש לתלמוד את העכבר המופעל עם חומרי הקינון של אמו במידת הצורך.
      הערה: חשוב להסיר את כל הגורים בני יום אחד מהאם בבת אחת ואז להחזיר את כולם בבת אחת לאחר שכל הגורים מתאוששים.

2. הכנת השעיית המקרופאג' הלבי של הילודים

הערה: כל ההליכים הניסיוניים האלה צריכים להתבצע במקום חשוך ובתנאים סטריליים.

1. קציר הלב של עכבר Cx3cr1^GFP/+ יילודים יום לאחר כריתה אפית
   1. המת חסד את עכבר Cx3cr1^GFP/+ יום אחד לאחר כריתת האפסים. השתמש בעודף של פחמן דו חמצני לערוף את ראש העכבר ברצף כדי להחיל המתת חסד.
   2. מוציאים את הלב מהחזה וטובלים אותו בצלחת של 10 ס"מ עם PBS.
   3. חותכים את כלי הדם ואת רקמת החיבור הנותרת הרחק מהחומים. חותכים את התוספתן האוזרי ואת דרכי היציאה מהלב.
   4. לאחר שהלב מפסיק לפעום, חתוך את הלב ל-1-2 מ"מ³ חתיכות במאגר PBS באמצעות מספריים מיקרו-כירורגיות(איור 2A).
2. ניתוק לב עכבר יילודים
   1. העבר את רקמת הלב שנקטפה לצינור המכיל 2.5 מ"ל של תערובת אנזימים שחוממה מראש (שולחן החומרים),וסגור בחוזקה את הצינור.
   2. הפוך את הצינור והנח אותו עם המכסה למטה(איור 2B).
   3. הפעל את תוכנית ניתוק הלב הילודים(שולחן החומרים).
   4. נתק את הצינור מהדיסוציאטור לאחר השלמת התוכנית.
   5. הוסף 7.5 מ"ל של DMEM 1x עם 10% FBS לצינור.
   6. סנן והעבר את המתלה לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל(איור 2C). צנטריפוגה השעיית התא ב 300 x g במשך 5 דקות.
   7. resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של תמיסת תאי דם ודגרה במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
   8. הוסף 5-10 מ"ל של חוצץ PBS להשעיה וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
   9. resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של DMEM עם 10% FBS.
3. בידוד מקרופאג' לב יילודים
   1. מיין מקרופאגים לב ילודים⁺ יילודים על ידי FACS. קבל את המקרופאגים ממוינים בצינור סטרילי המכיל 500 μL של DMEM עם 10% FBS.
   2. ספרו את ה- GFP⁺ המקרופאגים (איור 2D). resuspend המקרופאג ב- DMEM עם 10% FBS בריכוז של 1 x 10⁶ מקרופאגים לכל 200 μL של DMEM להזרקה מאוחרת יותר.
      הערה: מספר GFP⁺ מקרופאגים קטן בניאון אחד (כ- 1 x 10⁵); לכן, לפחות 10 יילודים יש להשתמש כדי להשיג מספיק מקרופאגים עבור כל הזרקת עכבר מבוגר.

3. השתלת מקרופאג' לב יילודים

1. בצע פעולת אוטם שריר הלב על מבוגר (6-8 שבועות) זכר C57BL /6 עכבר על ידי קשירה של העורק הכלילי השמאלי⁸.
2. שים את העכבר המופעל על שמיכה מחוממת 37 °C עד שהוא מתאושש.
3. תוך ורידי להזריק 200 μL של DMEM עם 1 x 10⁶ GFP⁺ מקרופאגים לב יילוד לתוך העכבר הבוגר אוטם לאחר הניתוח (כ 6 שעות מאוחר יותר) דרך וריד הזנב.
4. שלח את העכבר בחזרה לכלוב נקי.

4. הערכת תוצאות

1. אימות יעילות הזרקה
   1. להרדים את העכבר המופעל לקצור את הלב 7 ימים לאחר פעולת אוטם שריר הלב.
   2. טבול את הלב במאגר PBS מקורר מראש.
   3. תקן את רקמת הלב עם 4% פוליפורמלדהיד במשך 72 שעות בטמפרטורת החדר עם רועד.
   4. ייבש את רקמת הלב בדימתיל-בנזנה ואתנול.
   5. להטמיע את רקמת הלב בפרפין ולחתוך אותו לחלקים עם עובי של 5 מיקרומטר.
   6. בצע את פרוטוקול הכתמת האימונופלואורסצנטיות הסטנדרטי¹. השתמש α-אקטיבינין כדי לסמן קרדיומיוציטים.
   7. לזהות את GFP⁺ מקרופאגים בלב מקבל השתלה.
   8. בצע את פרוטוקול הכתמת האימונופלואורסצנטיות הסטנדרטי¹. השתמש α-אקטיבינין ו- pH3 כדי לסמן קרדיומיוציטים והתפשטות תאים, בהתאמה (איור 3A).
2. הערכת תיקון לב לאחר ההשתלה
   1. השתמש אקוקרדיוגרפיה על העכבר המופעל חודש לאחר הפעולה¹.
   2. נתח את תפקוד הלב על-ידי השוואת שבר הפליטה בחדר השמאלי וקיצור חלקי בקבוצות שונות (איור 3B).
   3. להרום את העכבר המופעל ולקצר את הלב.
   4. חזור על שלבים 4.1.2-4.1.5.
   5. בצע פרוטוקול הכתמת של מאסון.
   6. נתח את האזור האוטם לאחר הזרקת מקרופאג'(איור 3C).

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מסוכם בתרשים זרימה (איור 1). ביצענו פעולת כריתה אפית בעכבר Cx3cr1^GFP/+ בן יום אחד. כפי שניתן לראות באיור 2A, עכבר ה-Cx3cr1^GFP/+ של הילודים עגן על משטח ההפעלה מתחת לסטריאוסקופ לאחר ההרדמה. הפעלנו לחץ לסירוגין על חזה העכבר והבטן בעזרת שני מלקחיים, אשר ניתן להגדיר כמערכת להנחות את הלב קופץ מתוך החזה. יש להימנע מכל נזק מכני נוסף ללב שעלול להשפיע על התחדשות הלב. הלב היה משותק על ידי רקמות החזה שמסביב, אשר הקל על הניתוח על שריר הלב. מצאנו כי חיתוך פחות מ 1 מ"מ קוטר של רקמת שיא נחתוך על ידי מספריים iridectomy היה מתאים כאשר חדר הלב השמאלי החל לטפטף. אינדוקציה מוצלחת של מודל כריתה apical יש צורך השתלת מקרופאג^'8,9.

מיינו את ה- GFP⁺ מקרופאגים אך ורק בעקבות פרוטוקול דיסוציאציה לב יילודים¹ (איור 2).

מקרופאגים לב ילודים הוזרקו לתוך לב העכבר הבוגר אוטם שריר הלב זמן קצר לאחר הבידוד. על מנת לאשר את היעילות של השתלת המקרופאג ', ביצענו כתמי אימונופלואורסצנטיות ב -7 ימים לאחר ההזרקה. התוצאות הראו כי GFP⁺ מקרופאגים ניתן למצוא בלב העכבר אוטם שריר הלב למבוגרים, המציין השתלה מוצלחת של מקרופאג 'לב יילודים. השתמשנו בחיסון משותף של pH3 עם α-אקטיבינין. לוקליזציה משותפת נחשבה להתפשטות קרדיומיוצייט. התוצאות המחישו כי מספר הקרדיומיוציטים המתפשטים עלה על קבוצת המקרופאגים שהוזרקה, מה שמצביע על כך שיכולת ההתפשטות של קרדיומיוציטים למבוגרים שופרה לאחר ההשתלה (איור 3).

התחדשות לב עכבר מבוגר הוערך חודש לאחר ההשתלה. ביצענו אקוקרדיוגרמה על העכבר הבוגר ומצאנו כי הזרקת מקרופאג 'יכול לשפר את תפקוד הלב לאחר אוטם שריר הלב. הכתמים של מאסון בוצעו, והתוצאות המחישו כי האזור המאוטם צומצם להפליא לאחר השתלת המקרופאג' לב הילודים(איור 3). כל התוצאות הללו הראו כי השתלת מקרופאג' לב יילודים מקדמת התחדשות לב עכבר בוגר והתפשטות קרדיומיוצייט.

איור 1: ייצוג סכמטי של השתלת מקרופאג' לב יילודים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונות של בידוד מקרופאג'. א)הלבבות נחתכים לחתיכות קטנות. ב) לבבות העכבר מנותקים. ג) המתלה מסונן ומועבר לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. ד) מחושב מספר המקרופאגים לבביים יילודים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: השתלת מקרופאג' לב יילודים מקדמת התחדשות לב בוגרת. A) (משמאל) תמונות אימונופלואורסצנטיות מראות את הקרדיומיוציטים השכיחים (חץ, pH3 ירוק, אדום α-אקטינין). (מימין) ניתוח סטטיסטי מראה כי התפשטות קרדיומיוצייט עולה לאחר השתלת מקרופאג '. B) (משמאל) תמונות אקוקרדיוגרמה להראות את תפקוד הלב בעכבר מבוגר 1 חודש לאחר אוטם שריר הלב. (מימין) ניתוח סטטיסטי מראה כי תפקוד הלב משופר לאחר השתלת מקרופאג '. ג)הכתמים של מאסון מראים את האזור האוטם בעכבר מבוגר חודש לאחר אוטם שריר הלב. (מימין) ניתוח סטטיסטי מראה כי שטח אוטם מצטמצם לאחר Mφ, השתלת מקרופאג '. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

כאן, אנו מספקים גישה יעילה כדי להכין, לרכוש, ולהשתיל מקרופאגים לב יילודים כדי לקדם התחדשות לב עכבר מבוגר.

כריתה אפית היא פעולה פשוטה ויעילה להמרצת התחדשות הלב. מיטבנו את הפרטים של כריתה אפית כדי להבטיח את שיעור ההישרדות המרבי של בעלי החיים המעורבים במבצע¹⁰. זמן ההרדמה לא צריך להיות יותר מ 3 דקות, אשר להוביל למוות המושרה היפותרמיה, או קצר מ 2 דקות, אשר יגרום דימום מוגזם במהלך הניתוח. כריתת האפסית הסטנדרטית הייתה אמורה לקטוע קוטר של כ-1.5 מ"מ של רקמת השיא. עם זאת, מטרת המבצע כאן הייתה לעורר חדירת מקרופאגים בשפע במהלך תהליך התחדשות הלב. כריתה בקוטר של פחות מ-1.5 מ"מ הייתה מקובלת שכן היא יכולה להבטיח שיעור הישרדות מרבי וגיוס מקרופאג' יעיל בו זמנית. רק המיומנות של המפעיל השפיעה על שיעור ההישרדות, והעכברים המופעלים לא יכלו לשרוד את משך הניתוח הממושך. המפעיל צריך להשלים את כל ההליך בתוך 5 דקות.

במחקר הקודם שלנו, מצאנו כי דלקת חריפה קידם התחדשות לב יילודים. מיקרו-ריאה תוך-מיוקרדית של זימוסן אימונוגני חלקיקי A ללב עכבר יילודים יכולים לקדם התפשטות קרדיומיוצייט⁶. לאחרונה, מולקנטין ואח ' טען כי חדירת מקרופאגים כי הוא מגורה על ידי הזרקה תוך לבבית של זימוסן A, פסולת תאים, תאים נהרגים להקפיא / להפשיר יכול לקדם תיקון לב, המאשר כי דלקת חריפה מקרופאגים חיוניים בתיקון הלב ולא תאי גזע להבדיל קרדיומיוציטים¹¹. סאדק ואח' 5 דיווחו שמקרופות יכולות לקדם^{התחדשות} לב יילודים באמצעות אנגיוגנזה. המחקר האחרון שלנו גילה כי הזרקת מקרופאג ' לב יילודים יכול לקדם התחדשות לב למבוגרים ולהגדיל את היכולת של התפשטות קרדיומיוצייט למבוגרים^1,7. השתלת מקרופאג' לב יילודים עשויה להיות אסטרטגיה מבטיחה לקידום התחדשות לב עכבר בוגר. כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לעזור לחוקרים נוספים על פיתוח יישום התחדשות ולחקור מנגנוני התחדשות הלב.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse alpha actinin	Abcam	Ab9465
Anti-phospho-Histone H3	Millipore	06-570
Anti-rabbit Aurora B	Abcam	Ab239837
Anti-rabbit Ki67	Abcam	Ab15580
gentleMACS Octo Dissociator	Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany	N/A
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21137
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Neonatal Heart Dissociation Kit	Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany	130-098-373