שליטה בגיאומטריית התא באמצעות מיקרופטרנינג בסיוע לייזר אינפרא אדום

Summary

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר ייצור אוטומטי של מיקרופטרנים המתקננים את צורת התא כדי לחקור מבנים ציטוסקלטליים בתוך תאי יונקים. טכניקה ידידותית למשתמש זו ניתנת להגדרה עם מערכות הדמיה זמינות מסחרית ואינה דורשת ציוד מיוחד שאינו נגיש למעבדות סטנדרטיות לביולוגיה של התא.

Abstract

Micropatterning היא טכניקה מבוססת בקהילת הביולוגיה של התא המשמשת לחקר קשרים בין המורפולוגיה והתפקוד של תאים תאיים תוך עקיפת סיבוכים הנובעים מווריאציות טבעיות של תא לתא. כדי לתקנן את צורת התא, התאים מוגבלים בתבניות תלת-ממדיות או נשלטים עבור גיאומטריה דביקה דרך איים דביקים. עם זאת, טכניקות micropatterning מסורתיות המבוססות על פוטוליטוגרפיה ותחיריט UV עמוק תלויות במידה רבה בחדרים נקיים או בציוד מיוחד. כאן אנו מציגים טכניקת מיקרופטרנינג בסיוע לייזר אינפרא אדום (microphotopatterning) שונה דויל ואח '. שניתן להגדיר בנוחות עם מערכות הדמיה זמין מסחרית. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במערכת הדמיה ניקון A1R MP+ כדי ליצור micropatterns עם דיוק מיקרון באמצעות לייזר אינפרא אדום (IR) כי ablates אזורים קבועים מראש על כיסויים מצופים אלכוהול פולי ויניל. אנו משתמשים בסקריפט מותאם אישית כדי לאפשר ייצור דפוסים אוטומטי ביעילות ובדיוק גבוהים במערכות שאינן מצוידות בפוקוס אוטומטי של חומרה. אנו מראים כי זה לייזר IR סייע micropatterning (microphotopatterning) הפרוטוקול תוצאות דפוסים מוגדרים אשר תאים לצרף באופן בלעדי ולקחת על הצורה הרצויה. יתר על כן, נתונים ממספר גדול של תאים ניתן ממוצע עקב סטנדרטיזציה של צורת התא. דפוסים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה, בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח כמותי, יכולים לשמש למסכי תפוקה גבוהים יחסית לזיהוי שחקנים מולקולריים המתווכים את הקשר בין צורה לתפקוד.

Introduction

צורת התא היא דטרמיננטה מרכזית של תהליכים ביולוגיים בסיסיים כגון מורפוגנזה^{של רקמות 1}, נדידת תאים², התפשטות תאים³, וביטוי^{גנים 4}. שינויים בצורת התא מונעים על ידי איזון מורכב בין סידורים מחדש דינמיים של הציטוסקלטון המעוותים את קרום הפלזמה וגורמים חיצוניים כגון כוחות חיצוניים המופעלים על התא לבין הגיאומטריה של הידבקויות תאים ומטריצת תאים⁵. תאים mesenchymal נודדים, למשל, polymerize רשת actin צפוף בקצה המוביל שדוחף את קרום הפלזמה קדימה ויוצר lamellipodia רחב⁶, בעוד התכווצות actomyosin נסוגה הקצה הנגרר הצר של התא כדי לנתק את התא ממיקו....

Protocol

1. כיסויים לעיבוד מקדים

1. הכינו כיסויים נקיים וחורקים כמתואר בווטרמן-סטוריר, 1998²⁵.
2. הכן 1% (3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTMS) פתרון דגירה את ה-coverslips בתמיסה במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה. ודא כי coverslips לנוע בחופשיות בפתרון.
3. לשטוף מכסה פעמיים עם dH₂O במשך 5 דקות כל אחד.
4. הכינו 0.5% פתרון גלוטרלדהיד (GA) ודגרו את הכיסויים בתמיסה למשך 30 דקות על שייקר. עבור 25 כיסויים, יש להשתמש ב-50 מ"ל של תמיסת גלוטרלדהיד. ודא כי coverslips לנוע בחופשיות בפתרון.
5. לשטוף מכסה שלוש פעמים עם dH₂O במשך 10 דקות כל אחד.
6. סובבו כיסויים יבשים במשך 30 שניות באמצעות ספינר כיסויים שנבנ....

תוצאות

איכות הנתונים הניסיוניים המתקבלים באמצעות מיקרופטרנינג תלויה במידה רבה באיכות הדפוסים. כדי לקבוע את איכות הדפוסים שנוצרו בשיטה לעיל, השתמשנו לראשונה במיקרוסקופיית רפלקטיביות כדי להעריך את הצורה והגודל של האזורים המנוצלים של התמונה של ה- coverslip. גילינו שכל תבנית בודדת נראתה דומה מאוד למסכ.......

Discussion

התוצאות לעיל מראות כי פרוטוקול micropatterning בסיוע לייזר IR המתואר (microphotopatterning) מספק דפוסים חסידים לשחזור של צורות שונות המאפשר מניפולציה של צורת התא וארכיטקטורה cytoskeletal. למרות ששיטות micropatterning רבות פותחו הן לפני ואחרי הופעת הבכורה של microphotopatterning, שיטה זו בעלת מספר יתרונות. ראשית, היא אינה דורשת צי.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA