Kontrolle der Zellgeometrie durch Laser Assisted Micropatterning

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die automatisierte Herstellung von Mikromustern, die die Zellform standardisieren, um Zytoskelettstrukturen in Säugetierzellen zu untersuchen. Diese benutzerfreundliche Technik kann mit handelsüblichen Bildgebungssystemen eingerichtet werden und erfordert keine spezielle Ausrüstung, die für Standard-Zellbiologielabore unzugänglich ist.

Zusammenfassung

Mikrostrukturierung ist eine etablierte Technik in der zellbiologischen Gemeinschaft, die verwendet wird, um Verbindungen zwischen der Morphologie und Funktion von Zellkompartimenten zu untersuchen und gleichzeitig Komplikationen zu umgehen, die sich aus natürlichen Zell-zu-Zell-Variationen ergeben. Um die Zellform zu standardisieren, werden die Zellen entweder in 3D-Formen eingeschlossen oder durch Klebeinseln auf Klebegeometrie kontrolliert. Traditionelle Mikrostrukturierungstechniken, die auf Photolithographie und tiefem UV-Ätzen basieren, hängen jedoch stark von Reinräumen oder Spezialgeräten ab. Hier stellen wir eine von Doyle et al. modifizierte Infrarot-Laser-Assisted Micropatterning-Technik (Microphotopatterning) vor, die bequem mit handelsüblichen Bildgebungssystemen aufgebaut werden kann. In diesem Protokoll verwenden wir ein Nikon A1R MP+ Bildgebungssystem, um Mikromuster mit Mikrometer-Präzision durch einen Infrarotlaser (IR) zu erzeugen, der voreingestellte Bereiche auf polyvinylalkoholbeschichteten Decklippen absträcht. Wir verwenden ein benutzerdefiniertes Skript, um eine automatisierte Musterherstellung mit hoher Effizienz und Genauigkeit in Systemen zu ermöglichen, die nicht mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet sind. Wir zeigen, dass dieses IR-lasergestützte Mikromusterungsprotokoll (Mikrophotomusterung) zu definierten Mustern führt, an die sich Zellen ausschließlich anheften und die gewünschte Form annehmen. Darüber hinaus können Daten aus einer großen Anzahl von Zellen aufgrund der Standardisierung der Zellform gemittelt werden. Muster, die mit diesem Protokoll generiert werden, können in Kombination mit hochauflösender Bildgebung und quantitativer Analyse für Bildschirme mit relativ hohem Durchsatz verwendet werden, um molekulare Akteure zu identifizieren, die die Verbindung zwischen Form und Funktion vermitteln.

Einleitung

Die Zellform ist eine Schlüsseldeterminante grundlegender biologischer Prozesse wie Gewebemorphogenese¹, Zellmigration², Zellproliferation³und Genexpression⁴. Veränderungen in der Zellform werden durch ein kompliziertes Gleichgewicht zwischen dynamischen Umlagerungen des Zytoskeletts, das die Plasmamembran deformt, und extrinsischen Faktoren wie externen Kräften, die auf die Zelle ausgeübt werden, und der Geometrie von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsionen^{angetrieben 5}. Migrierende mesenchymale Zellen polymerisieren beispielsweise ein dichtes Aktinnetzwerk an der Vorderkante, das die Plasmamembran nach vorne schiebt und eine breite Lamellipodie⁶erzeugt, während die Actomyosinkontraktilität die schmale Hinterkante der Zelle zurückzieht, um die Zelle von ihrer aktuellen Position^7,8zu lösen . Störende Signalereignisse, die zu solchen spezialisierten Zytoskelettstrukturen führen, stören die Form und Polarität und verlangsamen die Zellmigration⁹. Darüber hinaus erfordert die Epithelblattbiegung während der Gastrulation eine Aktomyosin-basierte apikale Verengung, die dazu führt, dass Zellen und ihre Nachbarn keilförmig werden¹⁰. Obwohl diese Studien die Bedeutung der Zellform hervorheben, hat die inhärente Heterogenität der Zellform die Bemühungen um die Identifizierung von Mechanismen, die die Morphologie mit der Funktion verbinden, belastet.

Zu diesem Zweck wurden in den letzten drei Jahrzehnten zahlreiche Ansätze zur Manipulation der Zellform entwickelt. Diese Ansätze erreichen ihr Ziel, indem sie entweder die Zelle mit einer dreidimensionalen Form einschränken oder die zelluläre Adhäsionsgeometrie durch gemusterte Ablagerung von extrazellulären Matrixproteinen (ECM) auf einer Antifouling-Oberfläche steuern, eine Technik, die als Mikrostrukturierung bezeichnet wird¹¹. Hier werden wir eine Reihe von Techniken überprüfen, die im Laufe der Jahre an Popularität gewonnen haben.

Ursprünglich als Ansatz für mikroelektronische Anwendungen entwickelt, ist der auf Soft-Lithographie basierende Mikrokontaktdruck eindeutig zu einem Kult-Favoriten geworden¹². Ein Master-Wafer wird zunächst hergestellt, indem Bereiche eines mit Fotolack beschichteten Siliziumsubstrats selektiv der Photoirstrahlung ausgesetzt werden, wobei eine gemusterte Oberfläche zurückbleibt¹³. Ein Elastomer, wie PDMS, wird dann auf den Master-Wafer gegossen, um einen weichen "Stempel" zu erzeugen, der ECM-Proteine auf ein gewünschtes Substrat^{überträgt 11,14}. Einmal hergestellt, kann ein Master-Wafer verwendet werden, um viele PDMS-Stempel zu gießen, die zu hochreproduzierbaren Mikromustern^{führen 12}. Die Muster können jedoch aufgrund des langwierigen Photolithographieprozesses nicht ohne weiteres angepasst werden. Dieser Prozess erfordert auch hochspezialisierte Geräte und Reinräume, die in Biologieabteilungen normalerweise nicht verfügbar sind.

In jüngerer Zeit wurde berichtet, dass der Direktdruck mit tiefem UV die Einschränkungen herkömmlicher lithographiebasierter Ansätze umgeht. Tiefes UV-Licht wird durch eine Photomaske zu ausgewählten Bereichen eines Glasdecklippesgeleitet, der mit Poly-L-Lysin-gepfropftem Polyethylenglykol beschichtet ist. Chemische Gruppen, die tiefem UV ausgesetzt sind, werden ohne die Verwendung von lichtempfindlichen Linkern photokonvertiert, um die Bindung von ECM-Proteinen zu ermöglichen¹⁵. Das Fehlen lichtempfindlicher Linker ermöglicht es gemusterten Abdeckrlips, bei Raumtemperatur über sieben Monate stabil zu bleiben¹⁵. Diese Methode vermeidet die Verwendung von Reinräumen und Fotolithographiegeräten und erfordert weniger spezialisierte Schulungen. Die Anforderung an Fotomasken stellt jedoch immer noch eine erhebliche Hürde für Experimente dar, die leicht verfügbare Musteränderungen erfordern.

Neben Methoden, die die Zellgeometrie durch kontrollierte Ablagerung von ECM-Proteinen auf einer 2D-Oberfläche manipulieren, versuchen andere, die Zellform zu kontrollieren, indem zellen in 3D-Mikrostrukturen eingeengen werden. Viele Studien haben den oben beschriebenen Soft-Lithography-basierten Ansatz angepasst, um 3D- statt 2D-PDMS-Kammern zu erzeugen, um formabhängige biologische Prozesse in Embryonen, Bakterien, Hefen und Pflanzen zu untersuchen^16,17,18,19. Die Zwei-Photonen-Polymerisation (2PP) hat auch die Führung als Mikrofabrikationstechnik übernommen, die komplexe 3D-Hydrogelgerüste mit Nanometerauflösung²⁰herstellen kann. 2PP beruht auf den Prinzipien der Zwei-Photonen-Adsorption, bei der zwei in Femtosekundenpulsen abgegebene Photonen gleichzeitig von einem Molekül - in diesem Fall Photoinitiator - absorbiert werden, das eine lokale Polymerisation von Photopolymeren ermöglicht²¹. Diese Technik wurde stark eingesetzt, um 3D-Gerüste zu drucken, die die nativen ECM-Strukturen des menschlichen Gewebes nachahmen und nachweislich geringe photochemische Schäden an Zellen induzieren²².

Das Debüt der Mikrophotostrukturierung vor 10 Jahren gab Forschern die Möglichkeit, Mikromuster herzustellen und dabei unzugängliche und spezialisierte Geräte zu vermeiden. Die Mikrophotostrukturierung erzeugt Muster auf der Mikrometerskala, indem selektive Bereiche von Polyvinylalkohol (PVA), die auf aktivierten Glasoberflächen mit einem Infrarotlaser^{beschichtet sind, thermisch entfernt werden 23,24}. ECM-Proteine, die nur die darunter liegende Glasoberfläche und nicht PVA anbringen, dienen dann als biochemische Hinweise, um eine kontrollierte Ausbreitungsdynamik und Zellform zu ermöglichen. Diese Methode bietet auch eine überlegene Flexibilität, da Muster leicht in Echtzeit geändert werden können. Hier bieten wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der Mikrophotostrukturierung unter Verwendung eines kommerziellen Multiphotonen-Bildgebungssystems. Das beschriebene Protokoll ist für die schnelle und automatisierte Herstellung großer Muster konzipiert. Wir haben gezeigt, dass diese Muster die Zellform effizient steuern, indem sie die Geometrie von Zell-ECM-Adhäsionen einschränken. Schließlich zeigen wir, dass die beschriebene Mustertechnik die Organisation und Dynamik des Aktin-Zytoskeletts moduliert.

Protokoll

1. Coverslip-Vorverarbeitung

1. Bereiten Sie blitzsaubere Abdecklippen vor, wie in Waterman-Storer, 1998²⁵beschrieben.
2. 1% ige (3-Aminopropyl)trimethoxysilan (APTMS) Lösung vorbereiten und die Coverlips in der Lösung für 10 min unter sanftem Rühren inkubieren. Stellen Sie sicher, dass sich die Deckenrlips in der Lösung frei bewegen.
3. Deckenlippen zweimal mit dH₂O für je 5 min waschen.
4. Bereiten Sie 0,5% ige Glutaraldehyd (GA) -Lösung vor und inkubieren Sie die Coverlips in der Lösung für 30 min auf einem Shaker. Verwenden Sie für 25 Abdeckschichten 50 ml Glutaraldehydlösung. Stellen Sie sicher, dass sich die Deckenrlips in der Lösung frei bewegen.
5. Abdecklappen dreimal mit dH₂O für je 10 min waschen.
6. Drehen Sie trockene Abdecklippen für 30 s mit einem speziell angefertigten Abdeckspinn. Eine detaillierte Beschreibung des Coverslip Spinners wurde²⁶ veröffentlicht und ist online verfügbar (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). Aktivierte Abdecklippen können bis zu einem Monat bei +4 °C in einer Box mit Trennwänden gelagert werden, so dass sie voneinander abheben.

2. PVA-Beschichtung

1. Mischen Sie PVA (98% hydrolysierteS PVA, MW 98000) mit dH₂O, um eine 5,6% ige Lösung herzustellen.
2. Die Mischung in einem 90 °C Wasserbad löslich machen und sofort heiß durch einen 0,2 μm Filter in einer Biosicherheitswerkbank filtrieren. Filtern Sie die Stammlösung erneut, wenn sie ausfällt. PVA-Lösung kann bei Raumtemperatur für 3 Monate gelagert werden.
3. Fügen Sie in einem 15-ml-Rohr ein Teil HCl zu acht Teilen PVA hinzu. Kehren Sie die Röhre vorsichtig ein paar Mal um, um sie zu mischen.
4. Gießen Sie 2 ml der Mischlösung in eine 35 mm Petrischale und tauchen Sie einen sauberen, vorverarbeiteten Abdeckr in die Flüssigkeit, wobei Darauf geachtet wird, dass die Abdecklippen nicht am Boden haften. Bei Raumtemperatur für 5 min auf einem Shaker inkubieren.
5. Entfernen Sie vorsichtig die Abdeckungsrutsche von der Lösung. Verwenden Sie den Coverslip Spinner, um den Mantel für 40 s zu spinnen. In der Zwischenzeit die Pinzette reinigen. Den Abdeckdeckel in eine Box überführen und über Nacht bei +4 °C trocknen. PVA-beschichtete Deckrippel können bis zu zwei Wochen bei +4 °C gelagert werden.

3. Konfigurieren des Multiphotonenmikroskops

HINWEIS: Das beschriebene Protokoll ist so abgestimmt, dass zellklebende Mikromuster der gewünschten Form und Größe auf aufrechten oder invertierten Multiphotonen-Bildgebungssystemen erstellt werden, insbesondere solchen, die nicht mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet sind. So wird für jedes Sichtfeld (FOV) die Musterungsschrift einen kleinen Bereich ablatiert, um einen Treuhändermarker auf dem Deckdeckel zu erstellen, verwendet einen Software-Autofokus, um das Mikroskop auf die Deckrutschoberfläche zu fokussieren, und das gewünschte Muster ablatiert. Wenn Sie dieses Skript in einer Schleife für benachbarte FOVs ausführen, wird eine große Anzahl von Mikromustern (5 x 5 mm oder größer) erstellt, die die Zellform einschränken und die Aktivität intrazellulärer biologischer Prozesse modulieren. Das beschriebene Protokoll wurde für das Nikon A1R MP+ Bildgebungssystem entwickelt, das von der NIS-Elements Software gesteuert wird. Wird für die Musterung ein Imaging-System eines anderen Herstellers verwendet, sollten die optischen Konfigurationen und das Patterning-Skript gemäß den Anweisungen des Herstellers angepasst werden.

1. Schalten Sie die Mikroskopsoftware ein. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" auf dem Mikroskop montiert ist.
   HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll ist für ein 25x/1.1 NA Wasserimmersionsobjektiv optimiert, aber auch andere Objektive können für die Musterung verwendet werden. Leser sollten sich bewusst sein, dass das Pattern mit einem Hochvergrößerungsziel(z. B.40x und 60x) länger dauert, da es die Anzahl der in jedem Sichtfeld abgetragenen Muster signifikant verringert. Objektive mit geringer Vergrößerung können für die Musterung verwendet werden, solange sie eine gleichmäßige Ausleuchtung über das Sichtfeld und eine Laserleistung bieten, die ausreicht, um die PVA-Schicht abzutragen.
2. Stellen Sie im GUI-Fenster A1plus MP die Laserlinie auf 750 nm ein.
3. Einrichten der optischen Konfiguration "Image"
   HINWEIS: NIS-Elements stellt Benutzern mehrere Tools (grafische Oberfläche, einen Erfassungs-Workflow-Builder JOBS, optische Konfigurationen und Makros) zur Verfügung, um die Mikroskophardware zu steuern. In diesem Protokoll wird der größte Teil der Hardwaresteuerung durch verschiedene optische Konfigurationen sowie ND-Erfassungs- und ND-Stimulationsmodule erreicht.
   1. Klicken Sie auf der Registerkarte Kalibrierung auf Neue optische Konfiguration. Nennen Sie die optische Konfiguration "Image". Dies ist die optische Basiskonfiguration, die die Abbildung des Abdecks durch Reflexion ermöglicht. Belassen Sie alle anderen Optionen als Standard und wählen Sie das entsprechende Ziel aus.
   2. Klicken Sie im A1plus MP GUI-Fenster auf die Schaltfläche Einstellungen, um die Hardwareeinstellungen unter dieser optischen Konfiguration zu konfigurieren. Stellen Sie den Stimulationslaser auf IR stim,platzieren Sie den Beam Splitter (BS 20/80) im Lichtweg, stellen Sie die Scanner Unit auf Galvano und wählen Sie den passenden entzündeten Detektor aus.
   3. Wählen Sie im A1plus Compact GUI-Fenster eine Scangröße und Verweildauer aus, die ausreicht, um kleine Merkmale auf dem Coverlip (1,1 ms bzw. 1024 Pixel auf unserem System) zu erfassen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Normal, damit keine Zeilenmittelung oder Linienintegration durchgeführt wird. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen IR-Laser verwenden aktiviert ist. Richten Sie der Einfachheit halber unidirektionales Scannen ein.
      HINWEIS: Wenn die Scangeschwindigkeit von Bedeutung ist, kann bidirektionales Scannen verwendet werden.
   4. Passen Sie im selben Fenster die Laserleistung und die Detektorempfindlichkeit an, um ein helles, aber nicht gesättigtes Bild der Deckdeckeloberfläche zu erhalten. Die Einstellung der Laserleistung auf 3 - 5% der maximalen Leistung und Detektorempfindlichkeit ("HV" Slider) auf 15 V ist ein guter Ausgangspunkt.
   5. Legen Sie im Fenster A1plus Scanbereich zoom auf 1 fest, um das gesamte Sichtfeld zu erfassen.
   6. Speichern Sie die optische Konfiguration.
4. Einrichten der optischen Konfiguration "Print_Fudiciary_Marker"
   1. Duplizieren Sie die optische Konfiguration "Image" und benennen Sie sie in "Print_Fudiciary_Marker" um.
   2. Wählen Sie im A1plus Compact GUI-Fenster die kleinste Scangröße und Verweildauer (64 Pixel bzw. 80,2 ms auf unserem System).
   3. Da in diesem Schritt keine Bildgebung erforderlich ist, stellen Sie die Detektorempfindlichkeit auf 0 ein und erhöhen Sie die Laserleistung auf 30%. Eine höhere Laserleistung entfernt thermisch die PVA-Schicht auf dem Deckslip in den gewünschten Bereichen.
   4. Stellen Sie im Fenster A1plus Scan Area den Zoom auf Maximum (15,87 für unser System) und platzieren Sie den Scanbereich in der Mitte des FOV.
   5. Richten Sie im Fenster ND-Erfassung ein Z-Stack-Experiment ein. Stellen Sie die Bewegung in der Z-Position auf Relativ ein und wählen Sie das entsprechende Z-Gerät aus. Stellen Sie die Schrittgröße auf 2 μm und die Stapeltiefe auf 10 μm oben und unten ein, um Unebenheiten im Mikroskopstand oder der PVA-Oberfläche zwischen benachbarten FOVs zu berücksichtigen.
5. Einrichten der optischen Konfiguration "Autofokus"
   1. Duplizieren Sie die optische Konfiguration "Image" und benennen Sie sie in "Autofokus" um.
   2. Verringern Sie im Fenster A1plus-Scanbereich den Zoomfaktor, sodass das Sichtfeld etwas größer ist als die Treuhandmarkierung. Dies stellt sicher, dass andere kleine Funktionen auf dem Coverlip den Autofokus nicht stören.
   3. Wählen Sie im Menü "Geräte" die Option "Autofokus einrichten". Stellen Sie die Scandicke im Z-Stack-Experiment auf die des Z-Stacks ein (siehe Schritt 3.5.5). Das Mikroskop durchtreift diesen Bereich und findet mit dem Treuhandmarker die beste Fokusebene. Lassen Sie die Schrittgröße als Standard.
6. Einrichten der optischen Konfiguration "Load_ROI"
   1. Duplizieren Sie die optische Konfiguration "Image" und benennen Sie sie in "Load_ROI" um.
   2. Legen Sie im Fenster A1plus Compact GUI die Scangröße fest, die mit der der ROI-Maske identisch ist. Diese optische Konfiguration wird verwendet, um ein Bild aufzunehmen, auf das die ROI-Maske geladen wird. Wir haben 2048 Pixel verwendet, um eine optimale Balance zwischen Auflösung und Geschwindigkeit zu erreichen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass dieses aufgenommene Bild in der Größe mit der ROI-Maske identisch ist.
7. Einrichten der optischen Konfiguration "Micropattern"
   1. Duplizieren Sie die optische Konfiguration "Print_Fiduciary_Marker" und benennen Sie sie in "Micropattern" um.
   2. Legen Sie den Zoomfaktor auf eins fest.
   3. Erhöhen Sie im A1plus MP GUI-Fenster die Stimulationslaserleistung, um PVA abtrahieren, und wählen Sie eine geeignete Scangeschwindigkeit (40% bzw. 32 s / Frame in unseren Experimenten).
   4. Richten Sie im Fenster ND-Stimulation ein ND-Stimulationsexperiment ein. Fügen Sie dem Zeitplan einige Phasen hinzu und legen Sie jede als Stimulation fest. Stellen Sie sicher, dass der Stimulationsbereich und die Dauer korrekt sind.
      HINWEIS: Die Anzahl der Phasen kann entsprechend der Dicke und Glätte der PVA-Schicht sowie der in dieser optischen Konfiguration verwendeten Laserleistung eingestellt werden.
   5. Aktivieren Sie im selben Fenster vor jeder Phase die Funktion StgMoveMainZ(-1.000,1). Dies berücksichtigt wiederum abweichungen in Z-Richtung.
      HINWEIS: Der Abstand und die Richtung, in der sich das Objektiv bewegt, können entsprechend der Dicke und Glätte der PVA-Schicht eingestellt werden.
8. Einrichten der optischen Konfiguration "Label_Surface"
   1. Duplizieren Sie die optische Konfiguration "Print_Fudiciary_Marker" und benennen Sie sie in "Label_Surface" um.
   2. Erhöhen Sie im A1plus Compact GUI-Fenster die Laserleistung erheblich und stellen Sie Zoom auf eins. Die hohe Laserleistung, die hier verwendet wird, beschädigt den Glasdeckel physisch und erzeugt ein mit bloßem Auge sichtbares Etikett. Dies hilft, die Muster in weiteren Experimenten zu lokalisieren.

4. Generieren der ROI-Maske und Einrichten des Makros

1. Generieren der ROI-Maske
   1. Verwenden Sie Adobe Photoshop oder eine andere verfügbare Software, um ein 2048 × 2048 RGB-Bild zu generieren. Das Bild entspricht einem Sichtfeld unter dem Mikroskop(d.h. 532,48 × 532,48 μm, 0,26 μm pro Pixel). Das Bild sollte einen schwarzen Hintergrund (0, 0, 0) haben.
      HINWEIS: Eine Reihe von kommerziellen und kostenlosen Bildbearbeitungsfunktionen kann verwendet werden, um ROI-Masken für lasergestütztes Mikromustern zu generieren. Obwohl wir Adobe Photoshop verwenden, um die Masken zu generieren, sind GIMP und ImageJ / Fiji auch als alternative kostenlose Optionen verfügbar.
   2. Zeichnen Sie 8 - 12 weiße (255.255.255) Muster auf den schwarzen Hintergrund. Die Mustergröße variiert je nach Zelltyp (~ 200 Pixel Durchmesser). Lassen Sie einen 500 × 500 leeren Bereich in der Mitte des Bildes für den Autofokus. Lassen Sie ausreichend Platz zwischen benachbarten Mustern (>200 Pixel) und an der Grenze des FOV für eine optimale Ablation und Zellanhaftung. Die in diesem Protokoll dargestellten Muster sind auf Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) verfügbar.
2. Einrichten des Makros
   1. Klicken Sie auf das Menü Makro und wählen Sie Neues Makro.
   2. Importieren Sie den auf Github verfügbaren Code "Pattern_Stimulation" (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) in das Fenster Neues Makro. Speichern Sie diesen Codeteil in einem geeigneten Ordner.
   3. Öffnen Sie ein weiteres Fenster Neues Makro und importieren Sie den auf Github verfügbaren Code "Stage_Movement" (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). Stellen Sie sicher, dass das Arbeitsverzeichnis "Stage_Movement" in diesem Code mit dem in Schritt 4.2.2 identisch ist. Speichern Sie den Code "Stage_Movement" im selben Ordner in Schritt 4.2.2.

5. Generierung von Mikromustern mittels Fotoablation

1. Schalten Sie das Mikroskop und sein Zubehör ein. Stellen Sie sicher, dass sich der IR-Laser zuvor ausreichend erwärmt hat.
2. Übertragen Sie den PVA-beschichteten Deckmantel auf eine Halterung. Stellen Sie bei einem aufrechten Mikroskop sicher, dass die PVA-Oberfläche nach unten abgetragen wird.
3. Fügen Sie Wasser in die Ecken, um den Abdeckrlip zu stabilisieren, und montieren Sie den Halter auf dem Mikroskopstand.
4. Senken Sie das Objektiv und fügen Sie Wasser auf den Abdeckr hinzu.
   HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll ist für ein 25x/1.1 NA Wasserimmersionsobjektiv optimiert. Wenn ein Trocken- oder Öltauchobjektiv verwendet wird, sollte Wasser durch ein geeignetes Tauchmedium ersetzt werden. Wenn ein Wasserimmersionsobjektiv verwendet wird, um ein großes Mikromuster-Array zu erzeugen, kann die Verdunstung zu einem Problem werden. Wenn dies der Fall ist, sollte Wasser durch GenTeal ersetzt werden, ein rezeptfreies Augengleitmittel, das in Apotheken erhältlich ist.
5. Schalten Sie in der Mikroskopsoftware den IR-Laserverschluss im GUI-Fenster A1plus MP ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Automatische Ausrichtung, um den Laser vor der Musterung auszurichten.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Laser-Autoalignment zu Beginn jeder Musterungssitzung durchzuführen, da kleine Abweichungen im Laserpfad die Qualität der Muster erheblich beeinflussen.
6. Wechseln Sie zur optischen Konfiguration "Image". Klicken Sie im Fenster A1plus Compact GUI auf Scannen, um das Sichtfeld zu scannen, während Sie das Objektiv langsam näher an den Coverlip bewegen.
7. Überwachen Sie das Bild sorgfältig. Zunächst erscheint das Bild extrem dunkel. Bewegen Sie das Objektiv näher an den Coverlip, bis die Bildhelligkeit zunimmt. Dies ist die Deckrutschfläche, die dem Objektiv zugewandt ist. Bewegen Sie das Objektiv weiter, bis die Helligkeit abnimmt und wieder zunimmt. Dies ist die PVA-Oberfläche, die gemustert werden soll. Konzentrieren Sie sich auf jede kleine Funktion (Coverlip-Unvollkommenheiten, Staub usw.)auf dieser Oberfläche und setzen Sie Null auf dem Z-Laufwerk. Stellen Sie nach dem Fokussieren immer Null ein.
   HINWEIS: Obwohl beide Oberflächen des Decklacks mit PVA beschichtet sind, werden die optischen Eigenschaften von Glas durch die PVA-Beschichtung nicht wesentlich verändert. Wir haben routinemäßig solche Decklippen mit Trocken-, Wasser- und Ölimmersionsobjektiven abgebildet und nicht gefunden, dass die nicht gemusterte PVA-Oberfläche die Bildgebung stört.
8. Wechseln Sie zur optischen Konfiguration "Label_Surface". Klicken Sie auf Aufnehmen. Kehren Sie zur optischen Konfiguration "Imaging" zurück und scannen Sie. Die Glasoberfläche sollte beschädigt sein und amorph erscheinen. Der beschädigte Bereich ist mit bloßem Auge sichtbar, was auf die Position von Mustern in weiteren Experimenten hinweist.
   HINWEIS: Um die Größe des sichtbaren Etiketts zu erhöhen, wiederholen Sie Schritt 5.8 in mehreren benachbarten FOVs.
9. Überprüfen Sie erneut, ob sich das Objektiv ungefähr in der Mitte des Coverlips befindet. Stellen Sie sicher, dass sich zwischen dem Objektiv und dem Abdeckungsschlupf ausreichend Wasser befindet. Bewegen Sie die Stufe um 1 bis 2 FOVs, um Glaspartikel zu vermeiden, und scannen Sie, um zu bestätigen.
10. Öffnen Sie im Menü Geräte das Makro Stage_Movement. Überprüfen Sie, ob das Pattern_Stimulation Arbeitsverzeichnis korrekt ist. Wenn nicht, wird keine Stimulation stattfinden. Setzen Sie die Variablen "PatternLength" und "PatternHeight" auf die gewünschte Anzahl von FOVs, die gemustert werden. Speichern Sie das Makro, und führen Sie es aus.
11. Wechseln Sie nach Abschluss der Musterung zur optischen Konfiguration "Imaging". Überprüfen Sie erneut, ob der IR-Laserverschluss im A1plus MP GUI-Fenster geöffnet ist.
12. Verschieben Sie die Bühne, um die Muster anzuzeigen. Scannen Sie die Muster, um ihre Qualität zu überprüfen.
13. Übertragen Sie den Coverlip mit mustern nach oben in die Gitterbox.
14. Gemusterte Abdecklippen bis zu einer Woche vor Gebrauch bei +4 °C lagern.

6. Fibronektin-Adsorption

1. Machen Sie frische 1 M NaBH₄ in 1 M NaOH Lösung. Im Verhältnis 1:100 zu pH 8,0 Phosphatpuffer mit 0,2 M Ethanolamin hinzufügen.
2. Übertragen Sie gemusterte Abdecklippen in eine 35 mm Gewebekulturschale. Inkubieren Sie jeden Coverlip mit 1 ml der oben genannten Lösung für 8 min, um die Autofluoreszenz zu löschen, und spülen Sie dann 3 Mal mit PBS ab.
3. Verdünnen Sie Fibronektin (FN) in PBS auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml. Inkubieren Sie den Abdeckklip in FN für 1 h bei +37 °C.
   HINWEIS: Wenn eine erhebliche unspezifische Bindung von ECM-Protein an das Substrat beobachtet wird, kann FN in PBS verdünnt werden, das 0,1% Pluronisches F-127²⁴enthält.
4. Waschen Sie den Abdecklappen 2 mal mit PBS. Wenn nicht sofort verwendet, in PBS bei +4 °C über Nacht lagern.

7. Zellanhang

HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für primäre menschliche Gingivafibroblasten optimiert.

1. Kulturieren Sie eine 10 cm große Schale von Zellen zu 70% Konfluenz.
2. Erwärmen Sie Zellkulturmedien, PBS und 0,05% Trypsin in einem +37 °C Wasserbad.
   HINWEIS: Bei Zellen, die schwach am Substrat haften, kann eine nicht-proteolytische Dissoziation mit Versen (0,48 mM EDTA) oder einem proprietären enzymfreien Puffer die Zellbindung an die Muster erhöhen und sollte in Betracht gezogen werden.
3. Bevor Sie die Zellen säen, verschieben Sie den gemusterten Abdeck aus einer sauberen 35-mm-Gewebekulturschale mit 1 ml warmem PBS.
4. Die Zellkulturmedien aus der 10 cm Gewebekulturschale absaugen und einmal mit PBS waschen.
5. 700 μL 0,05% Trypsin/EDTA in die Schüssel geben und die Zellen in einem +37 °C, 5% CO₂ Inkubator für 1 min inkubieren.
6. In der Zwischenzeit das PBS, das den gemusterten Deckslip bedeckt, absaugen und 1 ml Zellkulturmedien hinzufügen.
7. Vergewissern Sie sich, dass sich die Zellen gelöst haben. Dann resuspendieren Sie die trypsinisierten Zellen mit 10 ml Zellkulturmedien und fügen Sie 1 ml zum gemusterten Coverlip hinzu.
8. Kulturieren Sie Zellen im Inkubator für 2 - 3 h und überprüfen Sie, ob sich eine ausreichende Anzahl von Zellen an den Mustern angebunden hat. Wenn dies der Option ist, wechseln Sie die Medien einmal, um nicht angefügete Zellen zu entfernen. Dies minimiert die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Zellen auf demselben Muster landen.
   HINWEIS: Die Anhängezeit kann je nach Zelltyp variieren.
9. Nach weiteren 3-4 Stunden oder wenn sich eine ausreichende Anzahl von Zellen auf Mustern ausgebreitet hat, sind die Zellen bereit für weitere Experimente. Warten Sie nicht zu lange, um die Zellteilung zu vermeiden.

8. Datenerfassung

1. Fixieren Sie Zellen mit 4% PFA im Zytoskelettpuffer²⁷ für 10 min bei Raumtemperatur.
2. Befolgen Sie die Immunfluoreszenzprotokolle, die für die interessierenden Proteine festgelegt wurden. PVA-beschichtete Deckschichten funktionieren gut mit jedem Immunfluoreszenzprotokoll.
3. Erfassen Sie Bilder von Zellen mit einem geeigneten Mikroskop. Je nach Ziel des Experiments können Sie entweder eine oder mehrere Zellen pro Sichtfeld abbilden.

9. Bildanalyse

HINWEIS: Das folgende Protokoll ermöglicht es Benutzern, das durchschnittliche Fluoreszenzsignal des interessierenden Proteins über eine große Anzahl von Zellen aus Z-Stapeln von Mikroskopbildern zu erhalten.

1. Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder in NIS Elements und schneiden Sie die Bilder zu. Stellen Sie sicher, dass jedes Bild nur eine gut verteilte Zelle enthält. Detaillierte Anweisungen zur Bildverarbeitung finden Sie im folgenden Skript.
2. Installieren Sie Anaconda und starten Sie Spyder über Anaconda Navigator.
   HINWEIS: Die .py Skripts können in jeder Umgebung mit den entsprechenden Paketen ausgeführt werden, die in den Anforderungen.txt angegeben sind. Wir empfehlen Anaconda, da es die meisten der erforderlichen Pakete für die folgenden Codes enthält.
3. Laden Sie das Skript von Github herunter (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) und öffnen Sie es in Spyder ("Pattern_Averaging_3Channels.py" oder "Pattern_Averaging_4Channels.py" für Bilder mit 3 Kanälen bzw. 4 Kanälen).
4. Legen Sie Parameter basierend auf den aufgenommenen Bildern fest. Detaillierte Beschreibungen finden Sie im Skript.
5. Drücken Sie F5, um das Skript auszuführen. Der Fortschritt kann im Konsolenfenster verfolgt werden.
6. Rufen Sie die im selben Ordner gespeicherten Ausgabedateien ab. Die Ausgabebilder sind der Durchschnitt jedes Kanals für alle Samples. Das Excel-Blatt zeigt die mittlere Intensität jedes Kanals innerhalb einer Probenzelle, was eine weitere quantitative Analyse ermöglicht.

Ergebnisse

Die Qualität der experimentellen Daten, die durch Mikrostrukturierung gewonnen werden, hängt weitgehend von der Qualität der Muster ab. Um die Qualität der mit der obigen Methode erzeugten Muster zu bestimmen, haben wir zunächst die Reflexionsmikroskopie verwendet, um die Form und Größe der fotoabgetragenen Bereiche des Coverlips zu beurteilen. Wir fanden heraus, dass jedes einzelne Muster der Ablationsmaske sehr ähnlich sah und klare Grenzflächen und eine Oberfläche aufwies, die das Licht gleichmäßig reflekt...

Diskussion

Die obigen Ergebnisse zeigen, dass das beschriebene IR-lasergestützte Mikromusterungsprotokoll (Mikrophotomusterung) reproduzierbare adhärente Muster verschiedener Formen liefert, die die Manipulation der Zellform und der Zytoskelettarchitektur ermöglichen. Obwohl sowohl vor als auch nach dem Debüt des Mikrophotomusternings zahlreiche Mikrostrukturierungsmethoden entwickelt wurden, besitzt diese Methode mehrere Vorteile. Erstens sind keine speziellen Geräte und Reinräume erforderlich, die normalerweise nur in Den E...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA