הדמיה וכימות של דנדריטים עצביים שלמים באמצעות ניקוי רקמות CLARITY

Summary

מורפולוגיה דנדריטית עצבית לעתים קרובות עומדת בבסיס התפקוד. ואכן, תהליכי מחלה רבים המשפיעים על התפתחות הנוירונים באים לידי ביטוי עם פנוטיפ מורפולוגי. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ורבת עוצמה לניתוח ארבורים דנדריטיים שלמים ואת קוציהם הקשורים.

Abstract

פעילות המוח, האותות האלקטרוכימיים המועברים בין נוירונים, נקבעת על ידי דפוסי הקישוריות של רשתות עצביות, ומהמורפולוגיה של תהליכים ותת-מבנים בתוך נוירונים אלה. ככזה, הרבה ממה שידוע על תפקוד המוח התעורר לצד התפתחויות בטכנולוגיות הדמיה המאפשרות תובנה נוספת על האופן שבו נוירונים מאורגנים ומחוברים במוח. שיפורים בניקוי רקמות אפשרו הדמיה ברזולוציה גבוהה של פרוסות מוח עבות, להקל על שחזור מורפולוגי ניתוחים של מבנים עצביים, כגון ארבורים דנדריטים וקוצים. במקביל, ההתקדמות בתוכנת עיבוד תמונה מספקת שיטות לניתוח מהיר של ערכות נתונים גדולות להדמיה. עבודה זו מציגה שיטה מהירה יחסית של עיבוד, הדמיה וניתוח פרוסות עבות של רקמה עצבית מסומנת ברזולוציה גבוהה באמצעות ניקוי רקמות CLARITY, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה. פרוטוקול זה יאפשר את המאמצים להבנת דפוסי הקישוריות והמורפולוגיות העצביות המאפיינות מוחות בריאים, ואת השינויים במאפיינים אלה המתעוררים במצבי מוח חולים.

Introduction

הבנת הארגון המרחבי, דפוסי הקישוריות והמורפולוגיה של מבנים ביולוגיים תלת-ממדיים מורכבים חיונית לתיווג הפונקציות של תאים ורקמות ספציפיים. זה נכון במיוחד במדעי המוח, שבהם הוקדש מאמץ עצום לבניית מפות נוירואנטומיות ברזולוציה גבוהה של מערכת העצבים המרכזית^1,2. בחינה מדוקדקת של הנוירונים המרכיבים מפות אלה מניבה מורפורוגיות מגוונות, עם קשרים ומיקומים המשקפים את הפונקציה של קבוצות שונות אלה של נוירונים^3,4. יתר על כן, חקירה של מבנים תת-תאיים, במיוחד קוצים דנדריטיים, יכולה ליידע את בגרות הסינפסות, ובכך לשקף תהליכים התפתחותיים ומדינות מחלה נוירולוגיות^5,6,7. לכן, גישות המשפרות את רזולוציית ההדמיה ואת התפוקה חיוניות להבנה טובה יותר של תפקוד המוח בכל קנה מידה.

ההתקדמות האחרונה הרחיבה את ערכת הכלים המולקולרית והגנטית לסימון ומניפולציה של אוכלוסיות של נוירונים. הפיתוח של סמנים פלואורסצנטיים חדשים, בשילוב עם שיטות חדשות של החדרת סמנים אלה לתוך נוירונים, מאפשר תיוג דיפרנציאלי של אוכלוסיות של נוירונים אינטראקציה בתוך אותה חיה או דגימת מוח^8,9,10,11. מכיוון שהאור מפוזר על ידי שומנים אטומים, ובהתחשב בתוכן השומנים הגבוה של רקמת המוח, אוכלוסיות עצביות הדמיה הוגבלה בעיקר לחלקים דקים או הסתמכה על טכניקות מיקרו-סקרופיות מתקדמות (למשל, קונפוקלית, מיקרוסקופיה רב-פוטונית וגיליון אור) למבנים עמוקים של תמונה. עם זאת, מאמצים אלה התחזקו מאוד על ידי התקדמות בטכניקות ניקוי רקמות. הדמיה נוקשה/חיסונים היברידיים/חיסונים היברידיים/חיסונים/ בהיברידיהתואמת רקמות (CLARITY) היא טכניקה אחת כזו, שבה רקמות מעניינות מושרות במונומרים הידרוג'ל (אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד) ולאחר מכן נשטפות עם דטרגנטים¹². המונומרים ההידרוג'לים מתכלים ויוצרים פיגום הידרוג'ל תלת-ממדי יציב שקוף אופטית וחדיר לתוויות מקרומולקוליות. חומצות גרעין וחלבונים נשמרים בתוך המטריצה ההיברידית, ואילו השומנים מוסרים על ידי שטיפת חומרי הניקוי(איור 1). התוצאה היא רקמה יציבה כי הוא נוקשה מספיק כדי לשמור על הצורה המקורית ואת הכיוון של תאים ומולקולות שאינן שומנים בדם, בעוד שקוף אופטית מספיק כדי בקלות לדמיין מבנים עמוקים ברזולוציה גבוהה. תחזוקה זו של מבנה הרקמה והכיוון מאפשרת הדמיה של פרוסות עבות, ובכך משמרת חיבורים בין תא לתא ויחסים מרחביים. יתר על כן, מכיוון שהמיקום והזמינות של חלבונים וחומצות גרעין נשמרים במהלך תהליך הסליקה, רקמות מנוקות מסוגלות להחזיק סמנים מבוססי ביטוי, כמו גם תוויות אקסוגניות. לכן, CLARITY משאילה את עצמה כשיטה רבת עוצמה להדמיה כמויות גדולות של מבני מוח עמוקים ואת הקשרים בין מבנים אלה ברזולוציה גבוהה.

השימוש ב- CLARITY משפר מאוד את הגישות לאוכלוסיות נוירונים הדמיה. טכניקה זו מיומנת במיוחד ביצירת כמויות גדולות של נתוני הדמיה. CLARITY עובד היטב עם צורות מרובות של פלואורסצנטיות מבוססת חלבון. פרוטוקול זה משתמש בגישה מבוססת lentiviral כדי לתייג תאים בדלילות עם EGFP ו tdTomato; עם זאת, אללס כתב מהונדס המביע tdTomato או EGFP לסמן תאים לשחזור שימשו באופן שגרתי. חשוב לבחור פלואורופור שהוא גם יציב בתמונה וגם בהיר (למשל, EGFP או tdTomato). בנוסף, שימוש במקדם חזק כדי לבטא את הפלורופור מניב ניגודיות מעולה ואיכות תמונה. החסרונות של טכניקה זו מתעוררים כמו ניתוח נכון של כמות גדולה זו של נתונים יכול להיות גם עבודה- וגם זמן אינטנסיבי. מיקרוסקופים מיוחדים יכולים לעזור לשפר את התפוקה ולהפחית את עומס העבודה. עם זאת, בנייה, בעלות ו/או הפעלת מיקרוסקופים מתקדמים הם לעתים קרובות עלות-אוסרת עבור מעבדות רבות. עבודה זו מציגה תפוקה גבוהה, מהירה יחסית, שיטה פשוטה לדמיין כמויות גדולות של רקמה עצבית ברזולוציה גבוהה באמצעות ניקוי רקמת CLARITY של חלקים גדולים, בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית סטנדרטית. פרוטוקול זה מתאר גישה זו בשלבים הבאים: 1) ניתוח והכנת הרקמה העצבית, 2) ניקוי הרקמה, 3) הרכבת הרקמה, 4) הדמיה של הפרוסות המוכנות, ו -5) עיבוד תמונות פרוסה מלאות באמצעות שחזור וניתוח תוכנת הדמיה מיקרוסקופית(איור 2). מאמצים אלה גורמים לתמונות ברזולוציה גבוהה שניתן להשתמש בהן כדי לנתח אוכלוסיות של נוירונים, דפוסי חיבור עצביים, מורפולוגיה דנדריטית תלת-ממדית, שפע עמוד שדרה דנדריטי ומורפולוגיה, ודפוסי ביטוי מולקולריים בתוך רקמת מוח שלמה.

Protocol

הפרוטוקול הבא עוקב אחר כל הנחיות הטיפול בבעלי חיים עבור מכללת ביילור לרפואה.

1. ניתוח והכנת רקמות

1. המת חסד את העכבר עם מנת יתר של איזופלוראן על ידי הצבת העכבר במיכל סגור עם מגבת ספוגה איזופלוריין (או באמצעים אחרים שאושרו IUCAC).
2. לטבול את החיה באופן transcardially באמצעות מחט 25 G עם 10 מ"ל של PBS קר כקרח, ואחריו 10 מ"ל של 4% PFA.
3. לנתח את אזור המוח (או רקמה) של עניין.
4. מניחים את הרקמה ניתחת לתוך 4% PFA לילה ב 4 °C (50 °F). קיבוע נכון הוא המפתח לפרוטוקול זה. אל תדלג או תקצר שלב זה.
5. לאחר קיבעון ב 4% PFA לפחות 12 שעות, להעביר את הרקמה לתערובת הידרוג'ל אקרילאמיד 4% עבור 24 שעות ב 4 °C (70 °F).
   הערה: בעת הפשרת הידרוג'ל, ודא כי זה לא פולימר, זה יכול לקרות אם הידרוג'ל הופך חם מדי. להפשיר על קרח כדי למנוע פילמור מוקדם.

2. ניקוי רקמות

1. מניחים את רקמת המוח (עדיין שקועה בהידרוג'ל) באינקובטור ואקום למשך 3 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם ואקום של -90 kPa. השאר את החלק העליון של הצינור ללא יצירה כדי לאפשר לוואקום להיווצר כראוי.
2. לשטוף את הרקמה עם PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (25 °C (25 °F) עם רועד עדין.
3. מניחים את דגימת הרקמה הפולימרית בתא האלקטרופורזה, תוך שמירה על כיוון הרקמה בתוך התא.
4. מלאו את התא והמאגר במאגר במאגר ה-SDS האלקטרופורזי שסופק.
5. הפעל את המדגם ב 70 V, 1 A, ו 35 C, עם זרם קבוע עבור כ 2 h / מ"מ של רקמה.
   1. בדוק את המדגם מעת לעת; זה עשוי לדרוש יותר זמן בחדר כדי לנקות כראוי. נקודת התחלה טובה לסליקה היא 1-2 שעות למ"מ של רקמת המוח. מוח עכבר שלם דורש 8-10 שעות עבור ניקוי מספיק. זכור את הכיוון של המדגם לפני הסרתו מהתא והקפידו להחליף אותה בחזרה לתא באותו כיוון.
      הערה: איור 3A מראה כיצד ייראה מוח נקי לחלוטין. המוח ייראה אטום ולא ברור בשלב זה בשל נוכחות של SDS מומס, אבל צריך להיות מעט מאוד גוון בצבע רקמה צהובה לאחר מיצוי שומנים בדם.

3. הכנה והרכבה של הרקמה המנוקה

1. לאחר המדגם סיים ניקוי ונראה ברור מספיק, לשטוף PBS לילה בטמפרטורת החדר. החלף את ה- PBS ב- PBS טרי לעתים קרובות ככל האפשר. שלב זה הוא קריטי להסרת SDS שיורית שיכולים ליצור משקעים בשלבים מאוחרים יותר.
2. לאחר השטיפה הסופית ב- PBS, לשטוף את הרקמה במשך 5 דקות במים deionized בטמפרטורת החדר שלוש פעמים. הרקמה תהפוך אטומה בשלב זה ועשויה להתרחב.
3. לדגור את הרקמה בתמיסת התאמת אינדקס שבירה (ראה טבלה 1) לפחות 4 שעות בטמפרטורת החדר. איור 3B מציג פיסת רקמה מנוקה לאחר הדגירה בתמיסת התאמת אינדקס שבירה.
4. במהלך הדגירה של רקמות פתרון התאמת אינדקס שבירה, לבנות תא דיור מתאים כדי לדמיין את המדגם במידת הצורך.
5. בניית תא הדמיה לדגימות/פרוסות רקמות קטנות
   1. באמצעות מגלשת זכוכית כבסיס להרכבה, הניחו מרווחי גומי או פלסטיק ומאובטחים בדבק-על. אם מרווחים מוכנים מראש אינם זמינים, השתמש בטבעות פלסטיק העשויות מקטעי צינור חרוט.
   2. ודאו לאבטח את החלקים האלה למגלשת הזכוכית ללא חורים(איור 3C).
   3. מניחים את הרקמה המנוקה בתא הרכבה ממולא מראש בתמיסת התאמת אינדקס שבירה.
   4. להרכיב את הרקמה בבטחה על ידי הנחת כיסוי זכוכית על גבי ואיטום אותו עם לק.
   5. תמונה רקמה זו על ידי הוספת טיפה של אינדקס שבירה התאמת פתרון הרכבה ישירות על גבי הזכוכית.
6. תא הדמיית רקמות גדול
   1. בנה את התא הזה אם הרקמה גדולה מ-5 מ"מ (מתאימה למוח שלם או לחצי הכדור).
   2. באמצעות צלחת זכוכית 10 ס"מ עם קיר גבוה, למקם צינור חרוטי 50 מ"ל במרכז, לוודא כי הקוטר של חרוטי גדול מספיק כדי לקבל את הקנה של העדשה האובייקטיבית בשימוש.
   3. הפוך 3% agarose במים ולשפוך אותו בחלל בין צלחת זכוכית צינור חרוטי, לאפשר להתקרר במשך 1 שעות(איור 3D). זה יהווה טבעת של אגרוז מוצק(איור 3E).
   4. לדבוק את הרקמה בבטחה לתחתית התא באמצעות דבק סופר ולמלא את התא עם פתרון התאמת אינדקס שבירה. החל דבק כדי לדבוק את הרקמה על אזור שלא יהיה בתמונה כדי לאפשר טיוב של הרקמה מן המנה מבלי לפגוע באזורי העניין.
      הערה: הכנה זו היא זמן רגיש, כמו מדיה אינדקס שבירה עשוי להתחיל פילמור אלא אם כן נשמר מהאוויר מאוחסן ב 4 °C (50 °F).

4. הדמיה דגימות רקמה מנוקה

1. השג את התמונה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המתאים למטרה 25x/0.95 NA עם מרחק עבודה של 4 מ"מ.
2. הפעל את כל ציוד ההדמיה הרלוונטי. הנח את המדגם על הבמה והנח טיפה של פתרון התאמת אינדקס שבירה על החלק העליון של תא הרכבה.
3. גש בזהירות למדיית הטבילה במטרה וצור טור מדיה רציף.
4. באמצעות אפיפלואורסצנטיות, למצוא שדה הדמיה מתאים.
5. התחל את הליך רכישת התמונה על-ידי בדיקת ההגדרות המתאימות.
   1. התחל בקביעת הגדרות הרזולוציה ומהירות הסריקה באמצעות איור 4A כמדריך. אם הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, סגור באופן מלא את חור הסיכה כדי להשיג את החלק האופטי הקטן ביותר ולכן רזולוציית z הטובה ביותר.
   2. הגדל בהדרגה את עוצמת הלייזר/חיישן עד לקבלת תמונה מתאימה עם יחס אות לרעש גבוה.
   3. אם אתם משתמשים בהדמיה סטנדרטית של EGFP/tdTomato בשני צבעים, קבעו את הגדרות איסוף האור באמצעות איור 4B כמדריך.
   4. הגדר את הפרמטרים z-stack בהתבסס על נקודות ההתחלה והסיום שנצפו של הרקמה. הגדר את גודל השלב בהתבסס על רזולוציית z הרצויה באמצעות איור 4C כמדריך.
      הערה: גדלי שלב קטנים יותר יניבו רזולוציית z גדולה יותר, אך גם יציגו זמן התעכבות לייזר גדול יותר, מה שעלול להוביל להלבנה לדוגמה.
   5. כאשר אתה מרוצה מהגדרות רכישת התמונות, השג את התמונה.
   6. ודאו שלתמונה יש יחס אות לרעש גבוה ומציגים גבולות ברורים של מבנים(איור 4D).

5. עיבוד תמונה וכימות תלת-ממדי באמצעות תוכנת ניתוח מיקרוסקופיה

הערה: חבילות תוכנה לניתוח תמונה מיקרוסקופיות הן כלים רבי עוצמה להדמיה ועיבוד תמונה תלת-ממדית. רבות מתוכניות אלה מתאימות באופן מושלם לטיפול של ערכות נתונים גדולות הנוצרות מדגימות רקמות מנוקות הדמיה. השלבים הבאים והדמויות המשויכות תואמים לזרימת העבודה של התוכנה של Imaris.

1. פתח את מחסנית התמונות וייבוא אותה לתוכנת הניתוח שנבחרה.
2. הצג את התמונה במרחב תלת-ממדי ובצע את השינויים הרצויים בטבלאות בדיקת המידע באמצעות מתאם התצוגה כדי להציג את התמונה בצורה טובה יותר.
   הערה: איור 5A מדגים את עומק ההדמיה הקיצוני האפשרי הנגיש באמצעות מיקרוסקופיה של 2 פוטונים בשילוב עם ניקוי רקמות CLARITY. איור 5B מציג תהליכי דנדריט ברורים, כמו גם מורפולוגיות עמוד שדרה גלויות בבירור מערימת z המוצגת באיור 5A.
3. כדי לסנן רקע עקבי, לחץ על לחצן עיבוד תמונה ובחר את מסנן חיסור הרקע.
   הערה: איור 5C מציג את התמונה עם אות רקע מעורפל עקבי לפני העיבוד. איור 5D מציג את התמונה לאחר החלת מסנן חיסור הרקע.
4. התבונן בתמונה תלת-ממדית והיכר אותה על-ידי התבוננות בה מזוויות מרובות ורמות זום.
5. התחל את המעקב של דנדריט על-ידי בחירה ראשונה בכלי מעקב הסיבים.
6. לחץ על ערוך את הסיב באופן ידני, דלג על יצירה אוטומטית.
7. הגדר את המצב לנתיב אוטומטי ובדוק תיקוני מרכז אוטומטי וקוטר אוטומטי.
8. Shift + לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על גוף התא כדי להגדיר נקודת התחלה.
9. לעקוב אחר הנוירון לאורך כל אורך הדנדריט; לחץ שמאל על סוף dendrite כדי להגדיר את נקודת הסיום כדי לאפשר לתוכנה לחשב באופן אוטומטי את הנתיב בין נקודות ההתחלה והסיום.
10. חזור על שלב זה עבור כל הדנדריטים, ועקוב באופן מלא אחר מבנה התא.
11. דמיין את התא במעקב ואשר את דיוקו. לבצע התאמות ידניות לפי הצורך.
12. בחר בכרטיסיה יצירה.
13. בחרו באפשרות 'קומץ מחדש של קוטר דנדריט'.
14. עקוב אחר האשף כדי להשלים עבור דנדריט במעקב מדויק יותר.
15. בחר בכרטיסיה ציור.
16. לחץ על לחצן האפשרויות עמוד השדרה כדי להתחיל לצייר קוצים.
17. הגדר את קוטר עמוד השדרה המשוער לפי הצורך, והשתמש בכלי המדידה כדי לקבל ייצוג מדויק של קטר עמוד השדרה.
18. לחץ על מרכז ראשי עמוד השדרה כדי להוסיף עמוד שדרה חדש.
19. חזור על זה לכל קוצי השדרה בדנדריט.
    הערה: חשוב להתבונן בדנדריט מכל הזוויות האפשריות בעת הוספת קוצים באופן ידני.
20. בדוק את קוצים החדשים שנוספו לדיוק ובצע שינויים לפי הצורך.
21. בחר בכרטיסיה יצירה.
22. בחר באפשרות קומפר עמוד שדרה כדי לאפשר לתוכנה לקבוע את קטרי הראש והצוואר המתאימים, החיוניים לניתוח נתונים במורד הזרם.
23. בצע את אשף יצירת קוטר עמוד השדרה עד לסיום.
24. שים לב לתוצאה של החישוב ובצע התאמות ידניות לפי הצורך. איור 5E מראה נוירון במעקב מלא עם קוצים.
25. כדי ליצור רשימה מסווגת של קוצים, בחר בכרטיסיה כלים.
    הערה: יש להתקין את הרחבת MATLAB כדי שזה יפעל.
    1. כדי להתקין את הרחבת MATLAB, פתח את חלון ההעדפות.
    2. בחר באפשרות כלים מותאמים אישית.
    3. הוסף את MCR זמן הריצה המתאים של MATLAB.
26. לחץ על לסווג קוצים.
27. ערוך את הפרמטרים הרצויים לסיווג עמוד השדרה.
28. לחץ על לסווג קוצים על הרחבת MATLAB. איור 5F מציג את הדנדריט עם קוצים מסווגים מקודדים בצבע.
29. בחר בכרטיסיה סטטיסטיקה.
30. קבע את תצורת הסטטיסטיקה הרצויה כדי לכמת את הנתונים על-ידי לחיצה על לחצן קביעת תצורה בפינה הימנית התחתונה של כרטיסיה זו.
31. לאחר בחירת שיטת הייצוג של סטטיסטיקה, יצא את הנתונים באמצעות לחצן יצא סטטיסטיקה בכרטיסיה הצג לקובץ הממוקם בפינה השמאלית התחתונה של חלון זה.
32. גרף את הסטטיסטיקה בשיטת גרפים מועדפת.

תוצאות

לאחר רכישת התמונה, מורפולוגיית התא הייצוגי נותחה באמצעות סטטיסטיקה מוטבעת וסיווג סקריפטים בתוך תוכנת הניתוח. הנתונים שנאספו (איור 6A) משקפים שלנויר 2 יש מבנה דנדריטי גדול יותר עם צפיפות גבוהה יותר של קוצים. ככלל, הנתונים מראים כי נוירון 2 יש מבנה דנדריטי מורכב יותר לעומת נוי?...

Discussion

לפני הופעתן של טכניקות עכשוויות לניקוי רקמות, לימוד מורפולוגיה עצבית כלל חתך, הדמיה ושחזור עתירי זמן של חלקים דקים מאוד סמוכים. שימוש בניקוי רקמות אלקטרופורטיות בשילוב עם הדמיה קונפוצלית מספק תצוגה ללא הפרעה של מורפולוגיה עצבית מלאה. מעצים דנדריטיים שלמים, עד לבוטון הסינפטי הקטן ביותר, ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube	Thermo Scientific	339650
25 G x 1" Needle	BD	305127
30% Acrylamide (No-Bis)	National Diagnostics	EC-810
50 mL Conical Tube	Thermo Scientific	339653
Electrophoretic Tissue Clearing Solution	Logos	C13001
Histodenz	Sigma	D2158-100G
Hydrogel Solution Kit	Logos	C1310X
Imaris	Oxford Instruments	N/A
Paraformaldehyde 16%	EMS	15710
PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case	fisher	MT21040CV
VA-044	Wako	925-41020
X-CLARITY Polymerization System	Logos	C20001
X-CLARITY Tissue Clearing System II	Logos	C30001