Визуализация и количественная оценка интактных нейрональных дендритов с помощью очистки тканей CLARITY

Резюме

Дендритная морфология нейронов часто лежит в основе функции. Действительно, многие болезненные процессы, влияющие на развитие нейронов, проявляются с морфологическим фенотипом. Этот протокол описывает простой и мощный метод анализа интактных дендритных беседок и связанных с ними шипов.

Аннотация

Активность мозга, электрохимические сигналы, передаваемые между нейронами, определяется паттернами связности нейронных сетей, а также морфологией процессов и подструктур внутри этих нейронов. Таким образом, многое из того, что известно о функции мозга, возникло наряду с разработками в технологиях визуализации, которые позволяют глубже понять, как нейроны организованы и связаны в мозге. Улучшения в очистке тканей позволили получить визуализацию толстых срезов мозга с высоким разрешением, облегчая морфологическую реконструкцию и анализ нейронных субструктур, таких как дендритные беседки и шипы. В тандеме достижения в области программного обеспечения для обработки изображений предоставляют методы быстрого анализа больших наборов данных изображений. Эта работа представляет собой относительно быстрый метод обработки, визуализации и анализа толстых срезов меченой нервной ткани с высоким разрешением с использованием очистки тканей CLARITY, конфокальной микроскопии и анализа изображений. Этот протокол облегчит усилия по пониманию паттернов связности и морфологии нейронов, которые характеризуют здоровый мозг, и изменений в этих характеристиках, которые возникают в больных состояниях мозга.

Введение

Понимание пространственной организации, паттернов связности и морфологии сложных трехмерных биологических структур имеет важное значение для разграничения функций конкретных клеток и тканей. Это особенно верно в нейробиологии, в которой огромные усилия были посвящены построению нейроанатомических карт центральной нервной системы высокого разрешения^1,2. Тщательное изучение нейронов, составляющих эти карты, дает различные морфологии, со связями и местоположениями, которые отражают функцию этих разнообразных наборов нейронов^3,4. Более того, исследование субклеточных структур, особенно дендритных шипов, может информировать о зрелости синапсов, тем самым отражая процессы развития и неврологические болезненные состояния^5,6,7. Таким образом, подходы, которые улучшают разрешение и пропускную способность изображения, необходимы для лучшего понимания функции мозга во всех масштабах.

Последние достижения расширили молекулярно-генетический инструментарий для маркировки и манипулирования популяциями нейронов. Разработка новых флуоресцентных маркеров в сочетании с новыми методами введения этих маркеров в нейроны позволяет дифференциально маркировать популяции взаимодействующих нейронов в пределах одного и того же образца животного или мозга^8,9,10,11. Поскольку свет рассеивается непрозрачными липидами и, учитывая высокое содержание липидов в мозговой ткани, визуализация нейронных популяций в основном была ограничена тонкими участками или опиралась на передовые методы микроскропии (например, конфокальную, многофотонную и светоливую микроскопию) для изображения глубоких структур. Тем не менее, эти усилия были значительно подкреплены достижениями в методах очистки тканей. Прозрачный липидообменный акриламид-гибридизированный Rigid Imaging/immunostaining/insitu гибридизация-совместимый Tissue-hYdrogel (CLARITY) является одним из таких методов, в котором ткани, представляющие интерес, вводят гидрогелевые мономеры (акриламид и бис-акриламид), а затем промывают моющими средствами^12. Мономеры гидрогеля гибридизируются для создания стабильного 3D-гидрогелевого каркаса, который оптически прозрачен и проницаем для этикеток макромолекул. Нуклеиновые кислоты и белки поддерживаются в гибридизированной матрице, тогда как липиды удаляются моющими средствами(рисунок 1). Это приводит к стабильной ткани, которая достаточно жесткая, чтобы поддерживать первоначальную форму и ориентацию клеток и нелипидных молекул, в то время как оптически достаточно прозрачна, чтобы легко визуать глубокие структуры с высоким разрешением. Это поддержание структуры и ориентации ткани позволяет визуализировать толстые срезы, тем самым сохраняя межклеточные связи и пространственные отношения. Более того, поскольку местоположение и доступность белков и нуклеиновых кислот сохраняется в процессе очистки, очищенные ткани способны удерживать маркеры на основе экспрессии, а также экзогенные метки. Таким образом, CLARITY позиционируется как мощный метод визуализации большого количества глубоких структур мозга и связей между этими структурами с высоким разрешением.

Использование CLARITY значительно улучшает подходы к визуализации нейронных популяций. Этот метод особенно искусен в создании больших объемов данных визуализации. CLARITY хорошо работает с несколькими формами флуоресценции на основе белка. Этот протокол использует лентивирусный подход к разреженной маркировке клеток с помощью EGFP и tdTomato; однако обычно используются трансгенные репортерные аллели, экспрессирующие tdTomato или EGFP для маркировки клеток для реконструкции. Важно выбрать флуорофор, который является как фотостабийным, так и ярким (например, EGFP или tdTomato). Кроме того, использование сильного промотора для экспрессии флуорофора обеспечивает превосходную контрастность и качество изображения. Недостатки этой методики возникают, так как правильный анализ такого большого объема данных может быть как трудоемким, так и трудоемким. Специализированные микроскопы могут помочь повысить пропускную способность и уменьшить рабочую нагрузку. Тем не менее, создание, владение и / или эксплуатация передовых микроскопов часто являются непомерно дорогими для многих лабораторий. Эта работа представляет собой высокопроизводительный, относительно быстрый и простой метод визуализации больших объемов нервной ткани с высоким разрешением с использованием очистки тканей CLARITY от больших участков в сочетании со стандартной конфокальной микроскопией. Этот протокол описывает этот подход посредством следующих этапов: 1) рассечение и подготовка нервной ткани, 2) очистка ткани, 3) монтаж ткани, 4) визуализация подготовленных срезов и 5) обработка полных изображений с использованием программного обеспечения визуализации микроскопии реконструкции и анализа(рисунок 2). Эти усилия приводят к изображениям с высоким разрешением, которые могут быть использованы для анализа популяций нейронов, паттернов нейронных связей, морфологии 3D-дендриты, изобилия и морфологии дендритного позвоночника, а также молекулярных паттернов экспрессии в неповрежденной ткани мозга.

протокол

Следующий протокол следует всем рекомендациям по уходу за животными для Медицинского колледжа Бейлора.

1. Рассечение и подготовка тканей

1. Усыпить мышь при передозировке изофлурана, поместив мышь в закрытый контейнер с полотенцем, пропитанным изофлураном (или другими одобренными IUCAC средствами).
2. Перфьюзировать животное транскардиально, используя иглу 25 г с 10 мл ледяного холодного PBS, а затем 10 мл 4% PFA.
3. Рассектать интересуящеую область (или ткань) мозга.
4. Поместите рассеченную ткань в 4% PFA на ночь при 4 °C. Правильная фиксация является ключевым фактором для этого протокола. Не пропускайте и не сокращайте этот шаг.
5. После фиксации в 4% PFA в течение не менее 12 ч переносят ткань на 4% акриламидную гидрогелевую смесь в течение 24 ч при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При размораживании гидрогеля убедитесь, что он не полимеризовался, это может произойти, если гидрогель станет слишком теплым. Оттаивание на льду для предотвращения преждевременной полимеризации.

2. Очистка тканей

1. Поместите ткани мозга (все еще погруженные в гидрогель) в вакуумный инкубатор на 3 ч при 37 °C с вакуумом -90 кПа. Оставьте верхнюю часть трубки откручиваться, чтобы вакуум сформировался должным образом.
2. Промыть салфетку PBS в течение 10 мин при комнатной температуре (25 °C) с легким встряхиванием.
3. Поместите образец полимеризованной ткани в камеру электрофореза, сохраняя за этим ориентацию ткани в камере.
4. Заполните камеру и резервуар прилагаемым электрофорезным буфером SDS.
5. Запустите образец при 70 В, 1 А и 35 С с постоянным током около 2 ч/мм ткани.
   1. Периодически проверяйте образец; для правильной очистки может потребоваться больше времени в камере. Хорошей отправной точкой для очищения является 1-2 ч на мм мозговой ткани. Всему мозгу мыши требуется 8-10 ч для достаточного очищения. Запомните ориентацию образца перед извлечением его из камеры и обязательно замените его обратно в камеру в той же ориентации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 3А показывает, как будет выглядеть полностью очищенный мозг. Мозг будет выглядеть непрозрачным и неочищенным на этом этапе из-за наличия растворенного SDS, но после извлечения липидов практически не должно быть желтого оттенка.

3. Подготовка и монтаж очищенной ткани

1. После того, как образец закончит очистку и выглядит достаточно прозрачным, вымойте в PBS на ночь при комнатной температуре. Заменяйте PBS свежим PBS как можно чаще. Этот шаг имеет решающее значение для удаления остаточных SDS, которые могут образовывать осадок на последующих этапах.
2. После окончательной стирки в PBS промыть ткань в течение 5 мин в деионизированной воде комнатной температуры три раза. Ткань станет непрозрачной на этом этапе и может расширяться.
3. Инкубируют ткань в растворе, соответствующем рефракционному индексу (см. таблицу 1),в течение не менее 4 ч при комнатной температуре. На рисунке 3В показан кусок очищенной ткани после инкубации в растворе, соответствующем показателю преломления.
4. Во время инкубации ткани в растворе, соответствующем рефракционному индексу, сконструйте подходящую камеру корпуса для получения изображения образца, если это необходимо.
5. Создание камеры визуализации для небольших образцов/срезов тканей
   1. Используя стеклянную горку в качестве основы для монтажа, уложите резиновые или пластиковые распорки и закрепите суперклеем. Если готовые прокладки недоступны, используйте пластиковые кольца, изготовленные из конических поперечных сечений труб.
   2. Убедитесь, что эти части закреплены на стеклянной горке без каких-либо отверстий(рисунок 3C).
   3. Поместите очищенную ткань в монтажную камеру, предварительно заполненную раствором для согласования показателей преломления.
   4. Надежно скрепите ткань, поместив сверху стеклянную крышку и запечатав ее лаком для ногтей.
   5. Изобразите эту ткань, добавив каплю соответствующего показателя преломления монтажного раствора непосредственно поверх стекла.
6. Большая камера визуализации тканей
   1. Постройте эту камеру, если толщина ткани превышает 5 мм (подходит для всего мозга или полушарий).
   2. Используя стеклянную тарелку размером 10 см с высокой стенкой, поместите коническую трубку объемом 50 мл в центр, убедившись, что диаметр конической линзы достаточно велик, чтобы принять ствол используемой объектива.
   3. Внесите 3% агарозы в воду и вылейте ее в пространство между стеклянной посудой и конической трубкой, дайте остыть в течение 1 ч(рисунок 3D). Это сформирует кольцо твердой агарозы(рисунок 3Е).
   4. Надежно приклейте ткань к нижней части камеры с помощью суперклея и заполните камеру раствором для согласования показателей преломления. Нанесите клей, чтобы приклеить ткань на область, которая не будет изображена, чтобы позволить рекультивацию ткани из тарелки без повреждения интересующих областей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот препарат чувствителен ко времени, так как среда с показателем преломления может начать полимеризоваться, если ее не сохранить из воздуха и не хранить при 4°C.

4. Визуализация очищенных образцов тканей

1. Получите изображение с помощью конфокального микроскопа, оснащенного объективом 25x/0.95 NA с рабочим расстоянием 4 мм.
2. Включите все соответствующее оборудование для обработки изображений. Поместите образец на сцену и поместите каплю раствора для согласования показателей преломления на верхнюю часть монтажной камеры.
3. Тщательно подойдите к погружным средам с целью и сформируйте непрерывную колонку медиа.
4. Используя эпифлуоресценцию, найдите подходящее поле визуализации.
5. Начните процедуру получения изображения, проверив соответствующие параметры.
   1. Начните с установки разрешения и настроек скорости сканирования, используя рисунок 4A в качестве руководства. При визуализации с использованием конфокального микроскопа полностью закройте точечное отверстие, чтобы получить наименьшее оптическое сечение и, следовательно, наилучшее z-разрешение.
   2. Постепенно увеличивайте мощность лазера/усиление датчика до тех пор, пока не будет получено подходящее изображение с высоким отношением сигнал/шум.
   3. При использовании стандартной двухцветной визуализации EGFP/tdTomato задайте настройки сбора света, используя рисунок 4B в качестве руководства.
   4. Установите параметры z-стека на основе наблюдаемых начальной и конечной точек ткани. Установите размер шага на основе желаемого z-разрешения, используя рисунок 4C в качестве руководства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меньшие размеры ступеней приведут к большему z-разрешению, но также приведут к большему времени выдержки лазера, что потенциально приведет к отбеливанию образца.
   5. Когда вы удовлетворены настройками получения изображения, получите изображение.
   6. Убедитесь, что изображение имеет высокое отношение сигнал/шум и показывает четкие границы структур(рисунок 4D).

5. Обработка изображений и 3D-количественная оценка с использованием программного обеспечения для микроскопического анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Программные пакеты для анализа микроскопических изображений являются мощными инструментами для трехмерной визуализации и обработки изображений. Многие из этих программ идеально подходят для обработки больших наборов данных, которые генерируются из изображений очищенных образцов тканей. Следующие шаги и связанные с ними рисунки соответствуют рабочему процессу программного обеспечения Imaris.

1. Откройте стек изображений и импортируйте его в выбранное аналитическое программное обеспечение.
2. Просматривайте изображение в трехмерном пространстве и вносите необходимые изменения в таблицы подстановки с помощью регулятора дисплея для лучшей визуализации изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 5А демонстрирует возможную экстремальную глубину изображения, доступную с помощью 2-фотоонной микроскопии в сочетании с очисткой тканей CLARITY. На рисунке 5B показаны различные дендрритные процессы, а также хорошо видимые морфологии позвоночника из z-стека, представленного на рисунке 5A.
3. Чтобы отфильтровать любой последовательный фон, нажмите кнопку «Обработка изображений» и выберите фильтр вычитания фона.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 5C показано изображение с последовательным туманным фоновым сигналом перед обработкой. На рисунке 5D показано изображение после применения фильтра вычитания фона.
4. Наблюдайте за 3D-изображением и знакомься с ним, глядя на него с разных ракурсов и уровней масштабирования.
5. Запустите трассировку дендритов, сначала выбрав инструмент Трассировки нити.
6. Нажмите Редактировать нить вручную, пропустить автоматическое создание.
7. Установите режим автоматического контура и проверьте автоцентр и автоматическую коррекцию диаметра.
8. Shift + щелкните правой кнопкой мыши на теле ячейки, чтобы установить начальную точку.
9. Проследите нейрон по всей длине дендрита; щелкните левой кнопкой мыши на конце дендрита, чтобы установить конечную точку, чтобы программное обеспечение автоматически вычислял путь между начальной и конечной точками.
10. Повторите этот шаг для всех дендритов и полностью проследите клеточную структуру.
11. Визуализируйте прорисованную ячейку и подтвердите ее точность. При необходимости внесите изменения вручную.
12. Выберите вкладку Создание.
13. Выберите параметр Перевычисленный диаметр дендрита.
14. Следуйте указаниям мастера до конца для получения более точного дендрита.
15. Выберите вкладку Рисование.
16. Нажмите на переключатель Spine, чтобы начать рисовать колючки.
17. Установите приблизительный диаметр позвоночника по мере необходимости и используйте инструмент измерения, чтобы получить точное представление о диаметрах позвоночника.
18. Нажмите на центр головки позвоночника, чтобы добавить новый позвоночник.
19. Повторите это для всех шипов на дендрите.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно соблюдать дендрит со всех возможных углов при ручном добавлении шипов.
20. Проверьте только что добавленные шипы на точность и внесите необходимые изменения.
21. Выберите вкладку Создание.
22. Выберите параметр «Перекомпьют диаметр позвоночника», чтобы программное обеспечение можно было определить правильные диаметры головы и шеи, которые имеют решающее значение для последующего анализа данных.
23. Следуйте указаниям мастера создания диаметра позвоночника до конца.
24. Наблюдайте за результатом вычислений и вносите любые ручные корректировки по мере необходимости. На рисунке 5E показан полностью прорисованный нейрон с шипами.
25. Чтобы создать классифицированный список колючки, перейдите на вкладку Сервис.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого необходимо установить расширение MATLAB.
    1. Чтобы установить расширение MATLAB, откройте окно настроек.
    2. Выберите параметр Пользовательские инструменты.
    3. Добавьте соответствующий MCR среды выполнения MATLAB.
26. Нажмите на Классифицировать шипы.
27. Отредактируйте нужные параметры для классификации позвоночника.
28. Нажмите на Классифицировать шипы на расширении MATLAB. На рисунке 5F показан дендрит, наложенный на колючки с цветовой кодировкой.
29. Выберите вкладку Статистика.
30. Настройте нужную статистику для количественной оценки данных, нажав на кнопку Настроить в левом нижнем углу этой вкладки.
31. После выбора метода представления статистики экспортируйте данные с помощью кнопки Экспортировать статистику на вкладке Отображение в файл, расположенной в правом нижнем углу этого окна.
32. График статистики с использованием предпочтительного метода построения графиков.

Результаты

После получения изображения репрезентативную морфологию клеток анализировали с использованием встроенной статистики и скриптов классификации в программном обеспечении для анализа. Собранные данные(рисунок 6А)отражают, что нейрон 2 имеет большую дендритную структуру...

Обсуждение

До появления современных методов очистки тканей изучение морфологии нейронов состояло из трудоемкого сечения, визуализации и реконструкции соседних очень тонких участков. Использование электрофоретического очищения тканей в сочетании с конфокальной визуализацией обеспечивает бес...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube	Thermo Scientific	339650
25 G x 1" Needle	BD	305127
30% Acrylamide (No-Bis)	National Diagnostics	EC-810
50 mL Conical Tube	Thermo Scientific	339653
Electrophoretic Tissue Clearing Solution	Logos	C13001
Histodenz	Sigma	D2158-100G
Hydrogel Solution Kit	Logos	C1310X
Imaris	Oxford Instruments	N/A
Paraformaldehyde 16%	EMS	15710
PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case	fisher	MT21040CV
VA-044	Wako	925-41020
X-CLARITY Polymerization System	Logos	C20001
X-CLARITY Tissue Clearing System II	Logos	C30001