השתלת חלון גולגולת להדמיה חוזרת ונשנית In Vivo בעכברים ערים

Summary

מוצג כאן פרוטוקול להשתלת חלון גולגולתי כרוני להדמיה אורכית של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים ראש.

Abstract

כדי להבין באופן מלא את הפיזיולוגיה התאית של נוירונים וגליה בבעלי חיים מתנהגים, יש צורך לדמיין את המורפולוגיה שלהם ולתעד את פעילותם in vivo בעכברים מתנהגים. מאמר זה מתאר שיטה להשתלת חלון גולגולת כרוני כדי לאפשר הדמיה אורכית של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים ראש. בשילוב עם אסטרטגיות גנטיות וזריקות ויראליות, ניתן לסמן תאים ואזורי עניין ספציפיים עם סמנים מבניים או פיזיולוגיים. פרוטוקול זה מדגים כיצד לשלב זריקות נגיפיות כדי לתייג נוירונים בקרבת אסטרוציטים המבטאים GCaMP6 בקליפת המוח להדמיה סימולטנית של שני התאים דרך חלון גולגולת. הדמיה מרובת-פוטון של אותם תאים יכולה להתבצע במשך ימים, שבועות או חודשים בבעלי חיים ערים ומתנהגים. גישה זו מספקת לחוקרים שיטה לצפייה בדינמיקה התאית בזמן אמת וניתן ליישם אותה כדי לענות על מספר שאלות במדעי המוח.

Introduction

היכולת לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מרובת-פוטונים in vivo בקליפת המוח של עכברים היא בעלת חשיבות עליונה לחקר האיתות והמבנה התאי 1,2,3,4,5,6,7,8,9, פתולוגיה של מחלות ^10,11 והתפתחות תאית^12,13 . עם השתלת חלונות גולגולתיים כרוניים, הדמיה אורכית אפשרית, המאפשרת הדמיה חוזרת ונשנית של אזורים בקליפת המוח במשך ימים, שבועות או חודשים^13,14 בבעלי חיים. מיקרוסקופיית מולטיפוטונים אידיאלית להדמיה חוזרת ונשנית של in vivo בגלל בדיקת עומק משופרת ופוטו-דאמג' מופחת הקשור ללייזר האינפרא אדום שבו נעשה שימוש. זה מאפשר מחקר של דינמיקה מולקולרית ותאית של תאים ספציפיים באזורים שונים בקליפת המוח.

מיקרוסקופיית מולטיפוטונים שימשה להדמיית in vivo של תאי עצב וגלייה בעכברים 15,16,17,18,19,20. ניתן ליישם אסטרטגיות שונות כדי לתייג סוגי תאים ותחומי עניין מסוימים. גישה נפוצה אחת היא להניע את הביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים המקודדים גנטית באופן ספציפי לתא באמצעות מערכת הרקומבינציה Cre-Lox. זה יכול להתבצע עם עכברים מהונדסים גנטית, למשל, חציית עכבר tdTomato "floxed" (Ai14) עם עכבר המבטא Cre-recombinase תחת מקדם של עניין²¹. לחלופין, ניתן להשיג תיוג ספציפי לתא ולאתר באמצעות זריקות ויראליות. כאן, וירוס המקודד Cre רקומבינאז תחת מקדם ספציפי לתא ונגיף המקודד גן מעניין של floxed מוזרקים לאזור מוגדר. סוגי תאים מתאימים המקבלים את שני הווקטורים הנגיפיים יבטאו את הגנים הרצויים. גנים אלה יכולים להיות סמנים מבניים, כגון tdTomato, כדי לראות שינויים במורפולוגיה התאית²² או באינדיקטורים לסידן המקודדים גנטית (GECIs), כגון GCaMP ו/או RCaMP, כדי לבחון את הדינמיקה של סידן²³. שיטות של רקומבינציה גנטית ניתן ליישם בנפרד או בשילוב כדי לתייג סוג אחד או יותר של תאים. גישה שלישית, שאינה דורשת עכברים מהונדסים או מבנים נגיפיים (שיש להם קיבולת אריזה מוגבלת), היא אלקטרופורציה של רחם של מבני דנ"א²⁴. בהתאם לתזמון האלקטרופורציה, ניתן לכוון לסוגי תאים שונים 25,26,27.

בעת ביצוע הדמיית מולטיפוטונים, ניתן לצלם עכברים כשהם ערים או מרדימים. הדמיה של עכברים ערים יכולה להתבצע על ידי אבטחת העכבר באמצעות לוחית ראש מחוברת²⁸. גישה זו הופכת לפחות מלחיצה בכך שהיא מאפשרת תנועה חופשית יחסית של החיה באמצעות שיטות, כגון כדורי קלקר²⁹ צפים חופשיים ונתמכים באוויר, הליכונים צפים חופשיים¹, או מערכת כלובים ביתית מורמת אוויר שבה העכברים מהודקים על ידי לוחית ראש מחוברת ומותר להם לנוע בתא פתוח³⁰. עבור כל אחד מתנאי ההדמיה הללו, יהיה צורך תחילה להרגיל את העכברים למערך ההדמיה. מאמר זה מתאר את הליך ההרגלה וההדמיה באמצעות מערכת כלוב ביתית מורמת אוויר.

פרוטוקול זה מתאר השתלה של חלון גולגולתי כרוני להדמיית in vivo אורכית בקליפת המוח. כאן, נשתמש בעכברים המבטאים באופן מותנה GCaMP6f באסטרוציטים כדי לנטר את הדינמיקה של איתות סידן. יתר על כן, מאמר זה מתאר את ההליך עבור זריקות ויראליות באמצעות tdTomato כתווית עבור נוירונים. זה מאפשר לקבוע את השינויים במבנה הסינפטי העצבי ו /או את הזמינות כסמן מבני המאפשר הדמיה חוזרת ונשנית של אותו אסטרוציט. לאורך הפרוטוקול, יודגשו צעדים חיוניים כדי להבטיח את האיכות הטובה ביותר האפשרית של תמונות המתקבלות ממיקרוסקופיית מולטי-פוטון.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי IACUC במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.

1. לפני הניתוח

1. הכינו פיפטות לזריקות ויראליות. משכו נימי זכוכית בורוסיליקט באמצעות מושך פיפטה ושפשפו את הפיפטה בזווית של 20 מעלות. לעקר את הפיפטות למשך הלילה.
2. מכינים חתיכות טריות של קצף ג'ל סטרילי על ידי חיתוך אותם לריבועים קטנים. הטביעו את קצף הג'ל בצינור מיקרופוג' סטרילי המכיל 0.5 מ"ל של מי מלח. משרים את קצף הג'ל במי מלח לפחות 30 דקות לפני השימוש.
3. מכינים חתיכות טריות של רצועות ספוג על ידי חיתוך אותן לרצועות דקות.
4. עשרים דקות לפני הניתוח, הזריקו עכברי GLAST-CreER/GCaMP6f בני 4-6 שבועות באופן תוך-צפקי עם 0.2 מ"ג/ק"ג דקסמתזון למניעת נפיחות במוח ו-5 מ"ג/ק"ג קרפרופן להפחתת דלקת.
   הערה: כדי לגרום לרקומבינציה ולביטוי של GCaMP6f בכ-40% מהאסטרוציטים, עכברי GLAST-CreER/GCaMP6f הוזרקו להם 100 מ"ג/ק"ג טמוקסיפן במשך 3 שבועות במשך 5 ימים רצופים.

2. תחילת הניתוח

1. לאחר 20 דקות, מרדימים את העכברים עם 3% איזופלורן עם חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר לדקה למשך כ-1.5 דקות.
2. לאחר ההרדמה, הניחו את העכבר על מסגרת סטריאוטקסית שיושבת על שמיכת מים המסתובבת מחדש כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37 מעלות צלזיוס לאורך כל הניתוח. הצמידו את העכבר למסגרת באמצעות מהדק החוטם ומוטות האוזניים. ודא כי מהדק החוטם ופסי האוזניים יציבים מספיק כדי שהראש לא יזוז במהלך ההליך, אך לא כל כך הדוק שהגולגולת פגומה.
3. יש לשמור על הרדמה עם 1-1.5% איזופלורן עם חמצן בקצב זרימה של 1-2 ליטר לדקה. שים לב שבעלי חיים מסוימים עשויים להזדקק לאיזופלורן פחות או יותר כדי לשמור על הרגעה. עקוב אחר נשימת החיה כמו גם הרפלקסים שלה לצביטות הבוהן והזנב, והתאים את האיזופלורן כראוי.
4. יש למרוח משחה לעיניים על כל עין באמצעות אפליקטור קצה כותנה כדי למנוע מהעיניים להתייבש במהלך ההליך.
5. באמצעות גוזמי מכרסמים, לגלח את השיער מהצוואר ועד ממש מעבר לעיניים. יש לנקוט משנה זהירות כדי להבטיח שהשפמים של החיה לא ייגזמו בטעות.
6. נקו את האזור המגולח עם כרית הכנה אחת ליוד, ואחריה כרית הכנה אחת לאלכוהול.
7. באמצעות מלקחיים של רקמה סטרילית ומספריים כירורגיים, חותכים ומסירים את העור מהתפרים הקדמיים לברגמא כל הדרך האחורית למבדה.
8. לאחר הסרת העור, יש להוסיף כ-0.1 מ"ל של 1% קסילוקיין (לידוקאין עם אפינפרין 1:200,000) לגולגולת כדי למזער את הדימום של הגולגולת.
9. באמצעות להב כירורגי סטרילי פלדת פחמן בגודל 11 המחובר לידית, מגרדים בעדינות את רקמת החיבור מהגולגולת. יש לנקוט משנה זהירות בעת הסרת רקמת החיבור בסמוך לקצה הגולגולת, שכן כל רקמה שנותרה יכולה למנוע הידבקות חזקה של לוחית הזכוכית או הראש בהמשך.
10. השתמש בכוחי רקמה סטרילית כדי להסיר רקמת חיבור רופפת מהגולגולת.
11. באמצעות אפליקטורים בעלי קצה כותנה סטרילי, נקו את כל הקסילוקאין שנותר מהגולגולת.
12. לאחר השלמתו, יש לנטרל ביסודיות את הגולגולת באמצעות אפליקטור קצה כותנה סטרילי הטבול באצטון. השתמש באוויר דחוס כדי לייבש מיד את הגולגולת.

3. קרניוטומיה

1. באמצעות סמן נקודה עדינה וסרגל, מדוד את הגודל המתאים לפתח במיקום הרצוי. אשר את גודל הפתח על ידי השוואתו לגודל זכוכית הכיסוי (קוטר 3 או 5 מ"מ); ודא שהפתח מעט קטן יותר מגודל זכוכית הכיסוי.
2. באמצעות מקדחה דנטלית, בהדרגה לעקוב אחר קווי המתאר של הפתח, דילול העצם. קודחים לאט כדי למנוע קידוחים דרך העצם, ומקדחים במעגלים קונצנטריים כדי להקל על דילול אפילו של העצם.
3. לאחר כל מעבר קונצנטרי, הוסיפו טיפה או שתיים של מלח סטרילי לאזור שנקדח. אפשרו למלח לשבת לפחות 10 שניות כדי למנוע מהעצם להתחמם יתר על המידה ולפגוע בדורה הבסיסית.
4. השתמשו באפליקטור קצה כותנה סטרילי כדי לספוג את כל המלחים שנותרו. פוצצו אוויר דחוס מעל האזור כדי להבטיח שכל המלחים שנותרו התאדו לפני חידוש הקידוחים. עשו זאת כדי לפוצץ את פסולת העצמות שנותרה.
5. יש לחזור על שלבים 3.2-3.4 עד שהעצם מדוללת כראוי להסרה.
6. יש לוודא כי העצם מדוללת כראוי להסרה על ידי דחיפה עדינה על האזור המרכזי של העצם עם מלקחיים עדינים כדי לבדוק כי הגולגולת הדלילה נעה. כלי הדם הבסיסיים צריכים להיות גלויים למקום שבו התרחש הקידוח. שימו לב שהעצם עשויה להיראות כאילו היא תיסדק במקום שבו חל דילול.
   הערה: אימון בשלב זה הוא חיוני כדי לזהות מתי העצם דוללה כראוי.
7. לפני שתנסה להסיר את העצם, בדוק את העכבר כדי לוודא שהוא מסומם לחלוטין. אם לא, להגדיל בהדרגה את תחזוקת האיזופלורן כדי למנוע נפיחות במוח בעת הסרת העצם.
8. מוסיפים חתיכה קטנה של קצף ג'ל רוויה במי מלח לגולגולת הדלילה. מוסיפים עוד טיפה אחת או שתיים של מלח לגולגולת הדלילה.
   הערה: הרבה מלח על הגולגולת הדלילה עוזר להפחית את הדימום ולהגן על הדורה בעת הסרת דש העצם.
9. באמצעות להב מחודד מיניאטורי של 15°, החדירו בזהירות את הלהב לעצם הדלילה וחתכו לאורך העצם הדלילה. שמור על קצף הג'ל ספוג במי מלח, מוכן לעצור כל דימום שעלול להתרחש.
10. באמצעות מלקחיים, בזהירות להרים ולהסיר את העצם. היו עדינים ככל האפשר כדי למנוע פגיעה ברקמה הבסיסית ובמערכת כלי הדם. היזהרו מאוד שלא לפגוע בדורה מאטר.
11. לאחר הסרת דש העצם, הוסיפו קליפת המוח חתיכה טרייה של קצף ג'ל רוויה במי מלח. הוסיפו כמה טיפות של מלח כדי למנוע מקצף הג'ל להתייבש, שכן הדבר יגרום נזק לרקמה שמתחת.

4. זריקות ויראליות

1. בצע זריקות ויראליות באמצעות מנגנון סטריאוטקסי.
   1. הכן את AAV1. CaMKII.0.4.Cre (טיטר של 3 × 10¹³ עותקי גנום (GC)/mL) בשעה 1:5,000 על ידי דילולים סדרתיים במי מלח.
   2. הכן את התערובת של AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5,000) ו-AAV1. קג. FLEX.tdTomato (טיטר של 5 × 10¹² GC/mL) על חתיכת פרפילם קטנה.
   3. ממלאים פיפטת זכוכית משופעת סטרילית בגודל קצה של 20 מיקרומטר עם תערובת הנגיף על ידי הנחת הפיפטה בעדינות על התמיסה.
   4. הורידו את הפיפטה כך שהיא פשוט תיגע במשטח המוח ותמשיכו להוריד למשך 200-300 מיקרומטר נוספים עבור זריקות L2/3. באמצעות מערכת מיקרו-איניג'קציה תוך-תאית (ראו טבלת החומרים), הזרקת לחץ 12-15 פעמים במשך 2 דקות (20 psi, משך דופק של 9 אלפיות השנייה). שימו לב למניסקוס בטיפת הפיפטה עם כל זריקה כדי להבטיח שהפיפטה לא תיחסם.
   5. לאחר הזרקתם, השאירו את הפיפטה במוח למשך 4-5 דקות כדי למנוע זרימה חוזרת. לאט לאט נסוגו מהפיפטה.
   6. חזרו על ההזרקות ב-2-3 אתרים (במרחק של כ-500 מיקרומטר זה מזה).
   7. השליכו את פיפטות הזכוכית המשומשות, הפרפילם, קצות הפיפטה וצינורות המיקרופוג' המשמשים לדילול סדרתי של נגיף ה-Cre ל-10% אקונומיקה.

5. השתלת חלון הגולגולת

1. מוציאים כל קצף ג'ל, ומשתמשים ברצועה קטנה של רצועות ספוג כדי לספוג את כל המלחים שנותרו.
2. הוסיפו כמה טיפות של האנטיביוטיקה אנרופלוקסצין (22.7 מיקרוגרם/מ"ל) לפתח ואפשרו לו להישאר שם במשך דקה אחת. לאחר דקה אחת, השתמשו בחתיכה טרייה של רצועת ספוג כדי לספוג כל אנרופלוקסצין שנותר. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות.
3. לאחר הכביסה השלישית, מוסיפים כמה טיפות של מלח לפתח ומאפשרים לו להישאר שם במשך דקה אחת. לאחר דקה אחת, השתמשו בחתיכה טרייה של רצועת ספוג כדי לספוג את כל המלח שנותרו. חזרו על תהליך ההדחה הזה פעמיים נוספות ולאחר הכביסה השלישית, הוסיפו טיפה קטנה של מלח לפתח.
4. מניחים את זכוכית הכיסוי מעל הפתח. השתמש במלקחיים כדי להבטיח שהזכוכית תשטוף מעל הפתח כדי לקבל תמונות באיכות טובה.
5. תוך כדי החזקה עדינה של הזכוכית במקומה, יש למרוח ג'ל דבק ציאנואקרילט (טבלת חומרים) סביב היקף הזכוכית כדי לאטום את שולי החלון אל הגולגולת. הקפידו לא לתת לדבק לחלחל מתחת לזכוכית הכיסוי, והרחיקו כמה שיותר דבק מפני השטח של זכוכית הכיסוי.
6. יש למרוח שכבה של דבק-על על ג'ל ההדבקה. הוסיפו שכבה של נוזל צמנט דנטלי מעל הדבק כדי לאפשר לו להתקשות.
7. קחו לוחית ראש בגודל מתאים מסוג מסוק והניחו שכבה דקה של דבק סביב הפתח המרכזי. מניחים את צלחת הראש מעל זכוכית הכיסוי, ומאפשרים לדבק להתייבש לזמן קצר.
8. בצינור מיקרופוג' של 1.5 מ"ל, הוסיפו אבקת צמנט דנטלית לסימן 0.1 מ"ל על הצינור. הוסיפו 7-8 טיפות של ריפוי מהיר, דבק מיידי וערבבו. ציירו למזרק של 1 מ"ל עם מחט של 19 גרם שנחתכה כדי ליצור פתח גדול יותר.
9. הזריקו את התערובת דרך החורים הצדדיים של מוט המסוק עד שהיא מחלחלת משני הצדדים. יש למרוח את תערובת המלט/דבק הדנטלי על שאר הגולגולת החשופה כדי להדק את לוחית הראש לגולגולת, מה שיפחית את תוצרי התנועה במהלך ההדמיה.
10. תנו לתערובת להתייבש באוויר למשך 15 דקות לפחות.
11. הזריקו לעכבר 0.5 מ"ל של מלח תת עורי כדי לסייע בהתאוששות.

6. לאחר הפעולה

1. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והחזיר אותו לכלוב שלו.
2. מניחים חלק מהכלוב על שמיכה המסתובבת מחדש במים, רפידות חימום ג'ל חלל או רפידות איזותרמיות כדי לסייע בהתאוששות.
3. לספק לבעל החיים עזרה קטנה של כדורי מזון ומזון רטוב, בנוסף לתזונה הרגילה שלהם, כדי לסייע עוד יותר בהתאוששות. הוסיפו כדורית מזון חדשה ומזון רטוב בכל יום לאחר הניתוח למשך ההחלמה.
4. יום לאחר הניתוח, הזריקו לעכברים פעם אחת 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן ו-5 מ"ג/ק"ג אנרופלוקסצין.
5. בימים 2-6, הזריקו לעכברים פעם אחת קרפרופן במינון 5 מ"ג/ק"ג ופעמיים עם 5 מ"ג/ק"ג אנרופלקסצין, בהמתנה לאישור ה-IACUC המקומי. הפרד את זריקות האנרופלוקסצין ב-8 שעות לפחות.
6. בימים 7-20, להזריק לעכברים מדי יום 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן.

7. הרגלת בעלי חיים להדמיה

1. ביום ה-14 לאחר הניתוח, בדקו את חלון הגולגולת לבהירות אופטית. אין להשתמש בעכברים עם חלונות לא ברורים או פגומים בדרך אחרת (כלומר, אנגיוגנזה מוגזמת).
2. בדוק אם יש ביטוי tdTomato תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אם ניתן לזהות תאים מסומנים, המשך בהרגלת בעלי חיים.
3. היום הראשון להרגלה (טיפול)
   1. החזיקו את העכבר לכמה דקות והחזירו אותו לכלוב שלו לאחר הטיפול. חזור על הטיפול שלוש פעמים עם מרווח של 15 דקות בין ההפעלות.
   2. לאחר הניסוי השלישי, הרגילו את העכבר על ידי עטיפת החיה בפיסת בד קטנה.
   3. החזק את העכבר עטוף בבד למשך כדקה אחת.
   4. לאחר המשפט, החזירו את העכבר לכלוב שלו. חזור על תהליך זה פעמיים נוספות, מה שמאפשר מרווח של 15 דקות בין כל ניסוי.
4. היום השני של ההרגלה
   1. שקלו ותעדו את משקל העכבר.
   2. עטפו את העכבר בבד, והצמידו אותו דרך צלחת הראש שלו לזרוע קיבוע הראש של הכלוב הביתי שהתרומם באוויר.
   3. השאירו את הכלוב הביתי חשוף לאור.
   4. אפשרו לעכבר להישאר מאובטח בכלוב הבית הנייד למשך 15 דקות.
   5. לאחר ההרגלה, מוציאים את העכבר מהכלוב הביתי וכובים את זרימת האוויר.
   6. שקלו את העכבר והחזירו אותו לכלוב שלו. הקפידו לכלול רק עכברים שאינם מאבדים יותר מ-10% ממשקל גופם. אל תכלול עכברים שמאבדים יותר מ-10% ממשקלם במהלך כל יום של התרגלות מניסויי הדמיה.
5. היום השלישי להרגלה ומעבר לכך
   1. שקלו ותעדו את משקל העכבר לפני שאתם מאבטחים אותו לכלוב הביתי שהתרומם באוויר.
   2. הצמידו את העכבר לכלוב הביתי שהתרומם באוויר.
   3. כסו את הכלוב הביתי במשהו שיספק פנים כהה, כגון קופסה, ויאפשרו לעכבר להישאר מאובטח במשך 30 דקות.
   4. לאחר 30 דקות, חשפו את הכלוב הביתי, הסירו את העכבר וכבו את זרימת האוויר.
   5. שקלו ותעדו את משקל העכבר לאחר ההרגלה.
   6. חזור על תהליך זה מדי יום, והגדיל את משך הזמן שהעכבר מאובטח לכלוב הביתי ב -15 דקות. המשך בתהליך זה עד שניתן יהיה לאבטח את העכבר לכלוב הביתי למשך 1.5 שעות מכיוון שזהו משך הזמן המשוער של סשן הדמיה של שני פוטונים.
   7. כדי להרגיל את העכבר לרעש, בצע כמה הפעלות הרגלה במיקרוסקופ כדי לאקלם את העכבר לקולות מראות סריקת הלייזר. לא לכלול עכברים שאינם מצליחים להתרגל מספיק (כלומר, קולות ועשיית צרכים הנגרמת על ידי לחץ).

8. הדמיית מולטיפוטונים

1. התחילו את ההדמיה 3 שבועות לאחר הניתוח כדי לאפשר לחלון להתבהר.
2. בצע הדמיה במיקרוסקופ מולטי-פוטון מותאם אישית או זמין מסחרית המצויד בלייזר Ti:Sapphire. השג תמונות באמצעות מטרת טבילת מים עם מפתח צמצם מספרי גבוה (NA).
   הערה: הדמיה דו-ערוצית מושגת באמצעות מראה דיכרונית של 565 ננומטר ושני צינורות פוטומולטיפליירים חיצוניים. מסנן פס פס 535/50 משמש לזיהוי פליטת GCaMP6f, ומסנן פס פס 610/75 משמש לזיהוי tdTomato. מטרת טבילת מים פי 25 (1.05 NA) וסורקי תהודה שימשו כדי להשיג תמונות המוצגות באיור 1 ובאיור 2. כל אזור עניין כלל ערימה של תמונות המופרדות באופן אקסיאלי ב-1 מיקרומטר. כל מקטע אופטי נאסף ברזולוציה של 512 x 512 פיקסלים, 0.18 מיקרומטר/פיקסל. התמונות נרכשו מהאזור הקדמי של קליפת המוח המוטורית הראשונית כפי שנקבע על ידי קואורדינטות סטריאוטקסיות.
3. הגדר את אורך הגל של הלייזר ל- 920 ננומטר (990 ננומטר אם נעשה שימוש ב- GECI בעל תזוזה אדומה).
4. הניחו את העכבר על כלוב הבית הנייד, והידקו את לוחית הראש לזרוע קיבוע הראש.
5. הוסיפו כמה טיפות מים למרכז החלון.
6. באמצעות מצב השדה הרחב של המיקרוסקופ, בחר 2-3 מיקומים של כלי דם הניתנים לזיהוי בקלות. שמור את התמונות של כלי דם אלה ותעד את הקואורדינטות X ו- Y המופיעות בבקר המנוע כדי להעביר את הדנדריטים המסומנים ב- tdTomato למפגשי הדמיה מאוחרים יותר. התאם את הקואורדינטות X ו- Y בכל פעם כדי להתאים מחדש עם התמונות השמורות של כלי הדם.
7. לאחר שצולם כלי הדם ותועדו מיקומים, אתרו את האזורים באמצעות תאי עצב המבטאים tdTomato (איור 1). דמיינו את המבנים הסינפטיים (דנדריטים ואקסונים) של נוירונים ואת פעילות GCaMP6f באסטרוציטים.
   הערה: הדנדריטים ישמשו כציוני דרך כדי לחזור באופן אמין לאותם אזורים ולדמות את אותם דנדריטים ואסטרוציטים במשך ימים חוזרים ונשנים. לא נצפתה תזוזה ניתנת לזיהוי במישור ההדמיה עם קיבוע ראש יציב ולאחר התרגלות לקיבוע הראש. תזוזה המתרחשת בכיווני X ו- Y מתוקנת בתנועה.
8. לאחר ההדמיה, החזירו את העכבר לכלוב שלו.
   הערה: עכברים נשמרים בדרך כלל בטווח של 2 שעות לכל היותר. כאשר ההדמיה נמשכת זמן רב, המים שמתחת למטרה עלולים להתייבש. יש להוסיף מים במהלך הניסויים. לחלופין, ניתן להשתמש בג'ל קולי במקום במים.

תוצאות

ניתן להעריך את איכות חלון הגולגולת על ידי עד כמה חדים המבנים העצביים. בחלון טוב, קוצים דנדריטיים נראים בבירור (איור 1). עם הנתונים המבניים והמיקום המאוחסנים, ניתן לצלם את אותה חיה שוב ושוב במשך ימים, שבועות או חודשים כדי לבחון את אותם תאים (איור 1). התמונות

Discussion

כאן, הצגנו פרוטוקול להשתלה של חלונות גולגולתיים כרוניים להדמיית in vivo של אסטרוציטים בקליפת המוח ותאי עצב בעכברים ערים ומרוסנים על הראש על כלוב ביתי מורם באוויר. דוגמאות ספציפיות סופקו ליישום חלון הגולגולת להדמיית אסטרוציטים המבטאים GECIs ומבנים סינפטיים עצביים. עם השימוש במיקרוסקופיי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15o Pointed Blade	Surgistar	6500	Surgery Tools
19 G Needles	BD	305186	Surgery Supply
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato	Addgene	28306-AAV1	Viral Vector
AAV1-CaMKII-0-4-Cre	Addgene	105558-AAV1	Viral Vector
Acteone	Fisher Scientific	A16P4	Reagent
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	Covidien 5750	Surgery Supply
Beveler	Narishige		Equipment
Borosilicate Glass	World Precision Instruments	TW100F-4	Surgery Supply
Carbide Burs	SS White Dental	14717	Surgery Tools
Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL	Zoetis Mylan Institutional, LLC.		Drug
Compressed Air	Fisher Scientific	23-022-523	Surgery Supply
Cotton Tip Applicators	Puritan	836-WC NO BINDER	Surgery Supply
Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm	Warner Instruments	64-0720, 64-0700	Surgery Supply
Dental Drill	Aseptico		Equipment
Dexamethasone, 4 mg/mL	Mylan Institutional, LLC.		Drug
Dissecting Microscope	Nikon		Equipment
Duralay Liquid  (dental cement liquid)	Patterson Dental	602-8518	Reagent
Duralay Powder  (dental cement powder)	Patterson Dental	602-7932	Reagent
Enrofloxacin, 2.27%	Bayer		Drug
Eye Ointment	Dechra	17033-211-38	Surgery Supply
Fiber Lite High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner Industries		Equipment
Forceps (Large)	World Precision Instruments	14099	Surgery Tools
Forceps (Small)	World Precision Instruments	501764	Surgery Tools
GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J	The Jackson Laboratory	Stock No: 024105	Mouse line
Germinator	Fisher Scientific		Equipment
GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J	The Jackson Laboratory	Stock No: 012586	Mouse Line
Headplate	Neurotar	Model 1, Model 3	Surgery Supply
Hemostatic forceps	World Precision Instruments	501705	Surgery Tools
Holder for 15o Pointed Blade	World Precision Instruments	501247	Surgery Tools
Holder for Scalpel Blades	World Precision Instruments	500236	Surgery Tools
Iodine Prep Pads	Avantor	15648-926	Surgery Supply
Isoflurane	Piramal		Surgery Supply
Isoflurane table top system with Induction Box	Harvard Apparatus		Equipment
Isoflurane Vaporizer	SurgiVet		Equipment
Krazy Glue	Office Depot	KG517	Reagent
Loctite 401	Henkel	40140	fast-curing instant adhesive
Loctite 454	Fisher Scientific	NC9194415	cyanoacrylate adhesive gel
Micropipette Puller	Sutter Instruments		Equipment
Multiphoton Microscope			Equipment
Nitrogen	Matheson	NI M200	Gas
Oxygen	Matheson	OX M250	Gas
Picospritzer	Parker		intracellular microinjection dispense system
Pipette Tips	Rainin	17014340	Surgery Supply
Rodent Hair Trimmer	Wahl		Equipment
Saline (0.9% Sodium Chloride)	Med Vet International	RX0.9NACL-30BAC	Surgery Supply
Scalpel Blades, Size 11	Integra	4-111	Surgery Tools
Scissors	World Precision Instruments	503667	Surgery Tools
Stereotaxic Instrument	Stoelting		Equipment
Sugi Sponge Strips (sponge strips)	Kettenbach Dental	31002	Surgery Supply
SURGIFOAM (gel foam)	Ethicon	1972	Surgery Supply
Syringe with 26 G Needle	BD	309625	Surgery Supply
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648-1G	Reagent
Ti:Sapphire Laser	Coherent		Equipment
Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM	Surgery Supply
Water Blanket	Fisher Scientific		Equipment
Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL	Fresenius Kabi USA		Drug