ייצור, תחזוקה ואפיון של אורגנואידים במעי ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Summary

כאן מתוארות שיטות מפורטות לייצור, תחזוקה ואפיון של אורגנואידים במעי הדק ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. שיטות אלו נועדו לשפר את יכולת השחזור, להרחיב את המדרגיות ולהפחית את זמן העבודה הנדרש לציפוי ומעבר של אורגנואידים.

Abstract

מפרט אזורי של המעי מתאר תהליך שבאמצעותו מורפולוגיה ותפקוד ייחודיים מוענקים לאזורים מוגדרים במערכת העיכול המתפתחת. אפיון אזורי במעי מונע על ידי מסלולי התפתחות מרובים, כולל מסלול החלבון המורפוגנטי של העצם (BMP). בהתבסס על מפרט אזורי רגיל, פותחה שיטה ליצירת אורגנואידים של המעי הגס האנושי (HCOs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs), הכוללים תאי גזע עובריים אנושיים (hES) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). אינדוקציה של שלושה ימים של איתות BMP מעצבת מספיק תרביות צינור אמצעי/אחורי ל-HCOs מיוחדים עשירים ב-AT המבטאים רצף 2 (SATB2) המכילים את כל סוגי תאי האפיתל העיקריים הקיימים במעי הגס האנושי כמו גם תאים מזנכימליים המתפתחים במשותף. השמטת BMP (או תוספת של מעכב BMP NOGGIN) במהלך תקופת דפוס קריטית זו הביאה להיווצרות אורגנואידים במעי אנושי (HIOs). HIO ו-HCOs דומים מבחינה מורפולוגית ומולקולרית למעי הדק ולמעי הגס המתפתחים על ידי בני אדם, בהתאמה. למרות התועלת של HIO ו-HCOs לחקר התפתחות המעיים האנושיים, יצירת HIO ו-HCOs היא מאתגרת. מאמר זה מציג שיטות ליצירה, תחזוקה ואפיון של HIO ו-HCO. בנוסף, ניתנים השלבים הקריטיים בפרוטוקול והמלצות לפתרון בעיות.

Introduction

חקר התפתחות המעי הגס האנושי קשה בגלל מגבלות על השימוש ברקמת עובר אנושית. מודלים של בעלי חיים היו יקרי ערך ושימשו היסטורית לגישות גנטיות בעכברים לחקר התפתחות המעיים. עם זאת, הבדלים בין התפתחות מעיים של עכברים לבני אדם מגבילים את הישימות של עכברים כמערכת מודל. לדוגמה, למרות שהיווצרות קריפטה במעי הדק ובמעי הגס של עכברים מתרחשת לאחר הלידה, בני אדם נולדים עם קריפטות שנוצרו במלואן¹. יתר על כן, המעי הדק והמעי הגס האנושיים מכילים סוגי תאים שאינם נמצאים בעכברים, כולל תאים אנטרואנדוקריניים המבטאים מוטילין (MLN) במעי^{הדק 2} ותאי גביע המבטאים מוצין 5B (MUC5B) במעי הגס ^3,4. מסיבה זו, חשוב שתהיה מערכת תרבית תאים המדמה במדויק את האירועים המולקולריים הדינמיים המגדירים את השלבים המוקדמים של התפתחות המעי הגס. לכן, הכוונת hPSCs ליצירת תאים עם מאפיינים של המעי הגס מספקת מודל רב עוצמה לחקר התפתחות המעי הגס האנושי.

פותחו פרוטוקולים כדי להקל על היווצרות⁵, סינכרונית ויעילה של אורגנואידים דמויי מעי⁶ דמויי מעי^ו-7 דמויי מעי מ-hPSCs. הפרוטוקולים האלה משתמשים בהליך התמיינות מדורג שמחקה את התפתחות המעי והמעי הגס של העובר (איור 1). ראשית, אנדודרם סופי נוצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי טיפול ב-Activin A, חיקוי צמתים. חשיפה של האנדודרם הסופי לרמות גבוהות של WNT וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF) גורמת למורפוגנזה לספרואידים של צינור אמצעי/אחורי CDX2⁺ . ספרואידים של המעי האמצעי/המעי האחורי מוטמעים לאחר מכן במטריצה חוץ-תאית (ECM) ומעוצבים ל-HIO או ל-HCOs באמצעות מניפולציה חולפת של איתות BMP. עיכוב איתות BMP באמצעות NOGGIN או הוספת מצע גידול בלבד מביא להיווצרות HIOs, הדומים למעי הדק הפרוקסימלי האנושי.

על ידי הפעלת איתות BMP באמצעות BMP2, ספרואידים במעי האמצעי/אחורי מעוצבים ל-HCOs, השומרים על דפוס באפיתל ובמזנכימה⁷. HCOs מכילים תאי גביע מועשרים במעי הגס המבטאים MUC5B והם מסוגלים לייצר תאים אנטרואנדוקריניים דמויי אינסולין 5 (INSL5) המבטאים אינסולין ספציפי למעי הגס. מזנכימה מבודדת מ-HCOs מבטאת הומאובוקס A13 (HOXA13) ו-HOXD13, המתבטאים גם במזנכימה ראשונית של המעי הגס^{האנושי 8}. חשוב לזכור ששלב הדפוס מתרחש במהלך הימים 7-10 של פרוטוקול ההתמיינות. תקופה זו של שלושה ימים מספיקה כדי לגרום לדפוס המעי הגס שנשמר לאחר תרבית מבחנה ממושכת.

הפרוטוקולים המתוארים להלן מיועדים לחוקרים שמכירים תרבית hPSC ללא מזין. לחוקרים שאינם מכירים סוג זה של תרבית hPSC, מומלץ קורס הכשרה על hPSCs כמו אלה המוצעים על ידי Stem Cell Technologies או מתקן תאי הגזע הפלוריפוטנטיים (PSCF) בבית החולים לילדים בסינסינטי. איכות ה-hPSCs ההתחלתיים היא קריטית ויכולה להשפיע על כל השלבים במורד הזרם. הפרוטוקול הבא יתחיל עם hPSCs שגודלו במשך 4 ימים ומוכנים לפיצול.

Protocol

1. יצירת אורגנואידים במעי האנושי ובמעי הגס

1. הכנת צלחות מצופות ECM
   1. הוסף 50 מ"ל של מדיום DMEM קר לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
   2. הסר כמות של 4x ECM מוסמך hESC (ראה טבלת החומרים) מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס והפשיר על קרח.
      הערה: עיין בתעודת הניתוח של המוצר כדי לקבוע את נפח ה-ECM המוסמך ESC הנדרש להכנת מלאי פי 4.
   3. אם ECM מוסמך hESC אינו מופשר במלואו, קח 750 מיקרוליטר של DMEM מהצינור החרוטי של 50 מ"ל וערבב אותו עם ה-ECM.
   4. העבירו את תערובת ה-ECM המוסמכת DMEM/hESC לצינור החרוטי של 50 מ"ל עם DMEM וערבבו היטב. הוסף 0.5 מ"ל לבאר לכל אחת מ -4 צלחות תרבית תאים של 24 בארות.
   5. נענע את הצלחות כדי לפזר את ה-ECM באופן שווה בכל הבאר כדי להבטיח שכל המשטח מכוסה. בעזרת פרפילם, אטמו את הלוחות המצופים ב-ECM והשאירו אותם בטמפרטורת החדר בארון בטיחות ביולוגית למשך שעה אחת לפחות. אחסן צלחות מצופות ECM בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים או עד הצורך.
2. ציפוי hPSCs תא יחיד
   1. הנח צלחת מצופה ECM עם 24 בארות בתוך ארון בטיחות ביולוגית למשך 30 דקות כדי לאפשר לה להגיע לטמפרטורת החדר.
   2. הנח מדיום שלם mTeSR1, פתרון ניתוק תאים ו-DMEM מתקדם בתוך אמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ואפשר להם להתחמם למשך 30 דקות.
   3. ודא ש-hPSCs הם לפחות 85% מתכנסים עם התמיינות מינימלית. הסר את כל התאים המובחנים במידת הצורך.
   4. הכן את מדיום הציפוי בצינור חרוטי של 50 מ"ל באופן הבא: 13 מ"ל של mTeSR1 ו-13 מיקרוליטר של 10 מ"מ Y-27632 מעכב חלבון קינאז הקשור ל-Rho (ROCK).
      הערה: Y-27632 מעכב אנויקיס ומגביר את ההישרדות של תאים בודדים.
   5. כדי לאסוף תאים מצלחת של 6 בארות, שאפו את המדיום מ-3 עד 4 בארות ושטפו פעם אחת עם 2 מ"ל של DMEM מתקדם לכל באר.
   6. שאפו את ה-DMEM המתקדם והוציאו 1 מ"ל מתמיסת הדיסוציאציה של התאים לכל באר. דגרו את הצלחת למשך 5-7 דקות בתוך חממה של 5% CO₂, 37 מעלות צלזיוס. בדוק תחת המיקרוסקופ שהתאים נמצאים בתרחיף.
   7. נתק את כל גושי התאים שנותרו על ידי פיפטה למעלה ולמטה 4-5 פעמים באמצעות פיפטה של 5 מ"ל.
   8. הוסף 2 מ"ל של DMEM מתקדם לכל באר, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה 4-5 פעמים והעביר לצינור חרוטי של 15 מ"ל. סובב את התאים בחום של 300 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
   9. שאפו את המדיום מהצינור מבלי לשאוב את גלולת התא והוסיפו 6 מ"ל מהמדיום המוכן של mTeSR1 בתוספת מעכב ROCK. השעו בעדינות את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 3-4 פעמים ולאחר מכן העבירו את התרחיף לשאר מדיום מעכב mTeSR1/ROCK בתוך צינור ה-50 מ"ל. השעו במרץ 4-5 פעמים וספרו את התאים באמצעות המציטומטר.
   10. שאפו את ה-ECM מלוח 24 הבארות ממש לפני ציפוי התאים. השעו את התאים שוב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 2-3 פעמים והוציאו 0.5 מ"ל מתרחיף התאים בכל באר.
       הערה: צפיפות הציפוי האופטימלית צריכה להיקבע על ידי הנסיין. כאן, מספר התאים האופטימלי הוא 80,000-200,000 תאים לבאר.
   11. נדנד בעדינות את הצלחת 3 פעמים בכיוון השעון, 3 פעמים נגד כיוון השעון, 3 פעמים קדימה ואחורה, ו -3 פעמים מצד לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה.
   12. מעבירים את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ודוגרים למשך 24 שעות.
       הערה: אל תפריע לצלחת בשעות הראשונות כדי להבטיח פיזור תקין של תאים בתוך הבארות.
   13. אחרי 24 שעות (איור 2A), שאפו את המדיום המשומש, הוסיפו 0.5 מ"ל לבאר של mTeSR1, דגרו שוב ב-37 מעלות צלזיוס, 5%_CO2 למשך 24 שעות (איור 2B), ואז המשיכו לשלב הבא.
3. התמיינות של אנדודרם סופי (DE) מ-hPSCs
   1. בצינור חרוטי של 15 מ"ל, הוסף 13 מ"ל של מדיום Activin Day 1 (ראה טבלת החומרים), 13 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל Activin A, ו-1.95 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל BMP4. מחממים את המדיום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
   2. שאפו את מדיום mTeSR1 מצלחת 24 הבארות והוסיפו 0.5 מ"ל של מדיום Activin Day 1 לכל באר. מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ודוגרים למשך 24 שעות. בדוק את התאים לאחר 24 שעות.
      הערה: מוות תאים נרחב אמור להיות ניכר, כפי שמתואר באיור 2C. למרות שהחד-שכבתי תיראה דלילה, מושבות התאים יתרחבו.
   3. הכן את המדיום השלם של Activin Day 2 על ידי הוספת 12.5 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל Activin A ל-12.5 מ"ל של מדיום Activin Day 2 בצינור חרוטי של 15 מ"ל. הנח את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
   4. הוצא את צלחת הבידול של 24 בארות מאינקובטור CO₂ והסר את המדיום המושקע. יש להוציא 0.5 מ"ל של מדיום Activin Day 2 שחומם מראש לכל באר ולהחזיר את הצלחת לתוך חממת CO₂ למשך 24 שעות.
      הערה: יש לנקוט בזהירות בעת חלוקת המדיום. אין להוציא מדיום ישירות במרכז הבאר, מכיוון שהדבר ינתק תאים בשכבה החד-שכבתית. מחלקים בזהירות מדיום בצד הבאר. למחרת נוצרת שכבה אחת של תאים עם מוות תאים זניח. התאים אמורים להיות כעת ~90 עד 95% מתכנסים (איור 2D).
   5. הכן את המדיום השלם של Activin Day 3 על ידי הוספת 12.5 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל Activin A ל-12.5 מ"ל של מדיום Activin Day 3 בצינור חרוטי של 15 מ"ל. הנח את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
   6. הסר את המדיום המושקע והוציא 0.5 מ"ל של מדיום Activin Day 3 לבאר.
      הערה: יש לנקוט בזהירות בעת חלוקת המדיום. אין להוציא מדיום ישירות במרכז הבאר מכיוון שהדבר ינתק תאים בשכבה החד-שכבתית. מחלקים בזהירות מדיום בצד הבאר. למחרת, החד-שכבתי אמורה להגיע למפגש מלא עם מעט או ללא מוות תאים בשלב זה. אל תנסה ליצור ספרואידים באמצע המעי האחורי אם השכבה החד-שכבתית אינה מתכנסת 24 שעות לאחר הוספת מדיום Activin Day 3. עיין באיור 2E למורפולוגיה האידיאלית של שכבת ה-DE החד-שכבתית לפני שתמשיך ליצירת הספרואידים באמצע המעי האחורי.
   7. בצע צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) של החד-שכבתי לביטוי חלבון A2 של קופסת המזלג (FOXA2) וגורם שעתוק תיבה 17 (SOX17) של אזור קביעת המין Y (SRY) בעת אופטימיזציה של התמיינות DE.
4. התמיינות של DE לספרואידים באמצע המעי האחורי
   1. בצינור חרוטי של 50 מ"ל, הוסף 25 מ"ל של מדיום אינדוקציה באמצע המעי האחורי עם FGF4 (ללא CHIR99021) והנח אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   2. כדי להכין את מדיום האינדוקציה השלם באמצע המעי האחורי, הוסף 7.5 מיקרוליטר CHIR99021 לאחר שהמדיום חם.
   3. הסר את המדיום המושקע, חלק 0.5 מ"ל של מדיום אינדוקציה באמצע המעי האחורי לבאר ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 24 שעות.
   4. לאחר שהתרחש עיבוי של תאים בתוך החד-שכבתי למחרת (איור 3A), החלף את המדיום המושקע במדיום אינדוקציה טרי באמצע המעי האחורי והנח את הצלחת בחזרה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 24 שעות.
      הערה: מבנים צינוריים יורגשו לאחר 48 שעות של אינדוקציה באמצע המעי האחורי, כפי שמוצג באיור 3B. ספרואידים באמצע המעי האחורי יתחילו לנבוט מהחד-שכבתי ביום השלישי, כפי שמתואר באיור 3C.
   5. כדי להימנע מהשלכת הספרואידים הצפים בזמן החלפת המדיום, העבירו את המדיום הישן לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 × גרם למשך דקה. השעו מחדש את הספרואידים ב-12.5 מ"ל של מדיום אינדוקציה טרי באמצע המעי האחורי, הוסיפו 0.5 מ"ל לבאר לאותה צלחת של 24 בארות, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 24 שעות.
   6. ביום הרביעי של אינדוקציה במעי האחורי (איור 3D), קצרו ספרואידים צפים מבארות הצלחת על ידי איסוף המדיום לתוך צינור של 15 מ"ל ואחריו צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך דקה אחת. המשך לשלב הבא להטמעת ספרואידים באמצע המעי האחורי ב-ECM.
5. ציפוי ודפוס של ספרואידים אמצעיים/אחוריים ב-ECM
   1. הפשירו את מטריצת קרום הבסיס ECM ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני ההטמעה.
      הערה: ECM זה שונה מה-ECM המוסמך hESC. יש לשים את ה-ECM על קרח, וניתן להכניס את הנפח המתאים של ECM לצינורות מיקרו-צנטריפוגה מקוררים מראש של 1.5 מ"ל על קרח. טבלה 1 מכילה מידע על נפח ECM. ודא שנפח ה-ECM הוא לפחות 75% בטיפה שבה יוטבעו הספרואידים.
   2. מחממים צלחת של 24 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
   3. אוספים את הספרואידים הצפים מכל 24 הבארות באמצעות פיפט של 1000 מיקרוליטר ומעבירים אותם לצינור חרוטי של 15 מ"ל. סובב את הספרואידים בחום של 300 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. שאפו את רוב המדיום אך השאירו את הנפח הנדרש לציפוי (טבלה 1).
   4. הכן קצות פיפטה של 1000 מיקרוליטר ו-200 מיקרוליטר על ידי חיתוך קצותיהם. הוצא את הצלחת המחוממת מראש של 24 בארות.
   5. מערבבים את הספרואידים הצפים, מעבירים את הנפח המתאים לצינור ה-ECM המונח על קרח, ולאחר מכן משהים מחדש את הספרואידים וה-ECM על ידי פיפטינג כדי לערבב אותם היטב.
   6. קח 65 מיקרוליטר מתערובת הספרואידים וה- ECM עם קצות הפיפטה החתוכים של 200 מיקרוליטר והעמיס למרכז כל באר בצלחת 24 הבארות. כדי לוודא שנוצרת טיפת ECM טובה, הרם את הפיפט בעדינות ובאטיות בזמן חלוקת התערובת.
      הערה: צלחת 30-100 ספרואידים לבאר.
   7. מעבירים בעדינות את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ ומדגרים למשך 5 דקות.
   8. הפוך את הצלחת ודגירה למשך 15-25 דקות, מה שיעזור לטיפות ה-ECM לשמור על מבנה דמוי כיפה.
   9. במהלך הדגירה הכינו את המדיום הנדרש וחממו אותו. לאחר שה-ECM מתמצק, הוסף 0.5 מ"ל של מדיום דפוס HIO או HCO בכל באר ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂. ראו איור 3E לתמונה של ספרואידים ב-ECM.
   10. תרבית את הספרואידים במדיום הדפוס למשך 3 ימים.
   11. לאחר 3 ימים, שנה את מדיום הגידול הרגיל או HCO למדיום הגידול הרגיל ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
       הערה: האורגנואידים בנקודת זמן זו (יום 10) הם אורגנואידים בשלב מוקדם. בהתבסס על מטרת הפרויקט, ניתן להשתמש בכמה אורגנואידים בשלב מוקדם לניתוח דפוסים מוקדמים, כמפורט בסעיף 2.
6. צמיחה ומעבר של אורגנואידים במעי האנושי ובמעי הגס
   1. לאחר יום 10, שנה את אמצעי הגידול כל 3 ימים.
      הערה: בהתאם לצפיפות הציפוי ולצמיחת האורגנואידים, ייתכן שיידרשו שינויים תכופים יותר במדיה. יש לבצע שינויים בינוניים לפני שהפנול האדום (מחוון pH) במדיום הופך לצהוב.
   2. דגרו על האורגנואידים עד היום ה-21 (איור 3F).
      הערה: טיפול BMP2 יביא להפחתת מספר האורגנואידים (~פי 3 פחות מ-HIOs) הגדלים מספרואידים. לכן, יש לצפות מספר גדול יותר של ספרואידים ליצירת HCOs.
7. פיצול אורגנואידים ביום ה-21
   1. בדוק את האורגנואידים.
      הערה: יש לפצל את האורגנואידים ביום ה-21 מכיוון שה-ECM כמעט מתפרק ביום ה-21 עקב צמיחה והתרחבות של אורגנואידים.
   2. הכן את קצות הפיפטה של 1000 מיקרוליטר ו-200 מיקרוליטר על ידי חיתוך קצותיהם.
   3. מחממים צלחת Nunc עם 24 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
   4. ציטט את הנפח המתאים של ECM לצינורות 1.5 מ"ל מקוררים מראש (טבלה 1).
   5. מגרדים בעדינות את טיפת ה-ECM עם האורגנואידים עם קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר ופיפטה את התערובת למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפרק את ה-ECM.
   6. מעבירים את התערובת לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ ובודקים את האורגנואידים במיקרוסקופ. במידת הצורך, הפרד את האורגנואידים זה מזה באמצעות מלקחיים סטריליים. ודא שההפרדה אינה פוגעת באפיתל האורגנואידים.
   7. העבירו את האורגנואידים לצינור חרוטי של 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 30 שניות. שאפו את הסופרנטנט והשאירו ~1 מ"ל של מדיום בצינור.
      הערה: ניתן לשנות את עוצמת הקול של המדיום בהתאם למטרת הניסוי. אם נדרשים יותר אורגנואידים לכל טיפת ECM, ניתן להקטין את הנפח הבינוני. עם זאת, אם נדרשים פחות אורגנואידים, ניתן להגדיל את הנפח הבינוני.
   8. ערבבו היטב את האורגנואידים, העבירו את הנפח המתאים לצינור ה-ECM המונח על קרח, ולאחר מכן השעו מחדש את האורגנואידים וה-ECM על ידי פיפטינג כדי לערבב אותם היטב.
   9. הוסף 65 מיקרוליטר מתערובת הספרואידים וה-ECM למרכז כל באר של צלחת 24 הבארות באמצעות קצות הפיפטה החתוכים של 200 מיקרוליטר.
      הערה: זה קריטי לקחת תחילה את האורגנואידים ולאחר מכן את ה-ECM במהלך הפיפטינג. לפיכך, בזמן חלוקת התערובת, האורגנואידים נמצאים בחלק העליון של טיפת ה-ECM.
   10. הכניסו את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 5 דקות.
   11. הפוך את הצלחת למשך 15-25 דקות נוספות כדי לעזור לטיפות ה-ECM לשמור על מבנה דמוי כיפה.
   12. הוסף 0.5 מ"ל של מצע צמיחה HIO/HCO בכל באר ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
       הערה: מדיום הצמיחה זהה הן עבור HIO והן עבור HCOs לאחר דפוס.
   13. החלף את המדיום כל 2-3 ימים עד היום ה-35 (איור 3G).

2. אימות דפוס האורגנואידים על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית שעתוק הפוך (RT-qPCR)

1. לפני איסוף RNA, הכינו מאגר ליזה RNA 1x בהתאם להוראות היצרן.
2. השלך את המדיום המושקע והוסף 350 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכל באר של צלחת 24 הבארות. ליזה את האורגנואידים על ידי פיפטה למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. לקבלת ליזה טובה יותר, מערבולת לזמן קצר במהירות מרבית למשך 5 שניות.
3. שמור את כל הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות למיצוי RNA. לאחר שהן מוכנות, הוציאו את דגימות ה-RNA מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס והפשירו אותן על קרח למשך 10 דקות. מערבל את הצינורות במרץ בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות כדי להבטיח ליזה מלאה של הדגימות.
4. הניחו את הדגימות שוב על קרח והמשיכו למיצוי RNA לפי הוראות היצרן. העבירו את דגימות ה-RNA למקפיא של -80 מעלות צלזיוס אם לא מוכנים להמשיך לשלב הבא.
5. בצע מיצוי RNA, טיפול ב-DNASE, סינתזת cDNA ו-RT-qPCR במתודולוגיה סטנדרטית. עיין בטבלה 2 לרשימה של שמות ורצפים של פריימרים.

3. אימות דפוס האורגנואידים על ידי אימונופלואורסצנציה

1. איסוף וקיבוע של אורגנואידים
   1. שאפו מדיום HIO או HCO מהבארות המתאימות והוסיפו 1 מ"ל של מלח פוספט קר כקרח (PBS) לכל באר. נתק את האורגנואידים מה-ECM באמצעות קצה פיפטה חתוך של 200 מיקרוליטר. פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק נתחים גדולים של ECM מהאורגנואידים.
   2. העבירו את האורגנואידים לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומלאו את שאר הצינור ב-PBS קר כקרח וערבבו בעדינות על ידי היפוך הצינור. אפשר לאורגנואידים להתיישב בכוח הכבידה ולשאוף את ה-PBS.
      הערה: אם האורגנואידים אינם מתיישבים בכוח הכבידה, צנטריפוגה בטמפרטורה של 300 × גרם למשך דקה.
   3. שאפו את ה-PBS והוסיפו 1 מ"ל של תמיסה משפילה-ECM קרה כקרח. שמור את הצינור על קרח למשך 10-15 דקות על פלטפורמה מסתובבת עם ניעור עדין.
      הערה: הטה את הצינור בזווית של 45° כדי לאפשר ערבוב נכון של האורגנואידים ותמיסת התא. לאחר 10-15 דקות, האורגנואידים צריכים להתיישב בתחתית הצינור, מה שמעיד על עיכול מלא של ה- ECM.
   4. הוסף PBS קר בצינור עד 15 מ"ל; מערבבים היטב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. כאשר האורגנואידים מתיישבים בתחתית הצינור, שאפו את ה-PBS והוסיפו 1 מ"ל של פרפורמלדהיד 4% מקורר מראש כדי לתקן את האורגנואידים. דגרו את האורגנואידים עם 4% פרפורמלדהיד על קרח למשך שעה.
   5. מלאו את שאר הצינור ב-PBS קר כקרח והניחו אותו אופקית על משטח נדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, השלך את הפרפורמלדהיד/PBS למיכל הפסולת שצוין ושטוף פעם אחת עם 15 מ"ל PBS קר כקרח, כמתואר בשלב 3.1.2.
   6. שאפו את ה-PBS ומלאו את הצינור ב-30% סוכרוז ב-PBS. הנח את הצינור בצורה אופקית על משטח נדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   7. למחרת, הטמיעו את האורגנואידים בדגם בסיס של 7 מ"מ x 7 מ"מ x 5 מ"מ עם מדיום OCT והקפאת בזק באמצעות אמבט קרח יבש/אתנול.
   8. מייבשים את הבלוקים במגבוני מעבדה, עוטפים אותם במגבת נייר ושומרים במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות למשך הלילה. למחרת, חתכו קטעים של 5 מיקרומטר על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות קריוסטט. אחסן את השקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
2. צביעה אימונופלואורסצנטית של האורגנואידים
   1. עבד את השקופיות מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס ובצע צביעת IF באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.
   2. מרחו כיסויים על השקופיות וייבשו אותם בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור למשך שעתיים לפחות או לילה לפני ההדמיה.
   3. דמיין את השקופיות באמצעות מטרה של פי 25 של מיקרוסקופ קונפוקלי.

תוצאות

היצירה המוצלחת של ספרואידים בשלב האינדוקציה האמצעית/אחורית מעידה על דפוס מוצלח. בצע צביעת IF עבור CDX2 על ספרואידים צפים ועל החד-שכבתי כדי לאשר שהדפוס נכון. למרות שצביעה בשלב האנדודרם הסופי (DE) יכולה להצביע על היעילות של אינדוקציה DE, יצירת ספרואידים אינה אפשרית ללא אינדוקצי...

Discussion

הבידול של hPSCs ל-HIO ו-HCOs הוא תהליך מורכב הדורש בקרות איכות בכל שלב. ה-hPSCs ההתחלתיים צריכים להיות בעלי התמיינות מינימלית לפני שהם מתחילים התמיינות ל-DE. אופטימיזציה של הצפיפות של hPSCs המצופים עבור התמיינות DE היא קריטית להצלחת הפרוטוקול. כדי להבטיח את איכות הבידול של DE, בצע IF עבו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Bovine serum albumin (BSA) solution	N/A	N/A	N/A
15 mL Corning tube	Falcon	21008-918	N/A
30% Sucrose	N/A	N/A	Made in PBS.
5% Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Lab	017-000-121	N/A
50 mL Corning tube	Falcon	21008-951	N/A
Accutase	Thermo Scientific	A1110501	Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
Activin A	Cell guidance Systems	GFH6-100x10	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt).
Activin Day 1 medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Use nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat	Thermo Scientific	A11055	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit	Thermo Scientific	A21206	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A10036	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A31571	1:500 dilution (Secondary antibody)
Base mold	Fisher	22-363-552	N/A
Basic gut medium (advanced DMEM)	Gibco	12491015	When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of  1 M HEPES to get 15 mM HEPES.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	N/A	Other qRT-PCR systems can be used.
Cell Recovery Solution	Corning	354253	ECM-degrading solution
CHIR99021	Reprocell	4000410	Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C.  Store powder at 4 °C, protected from light.
CTRL HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:100 dilution (Secondary antibody)
DE monolayer	N/A	N/A	Monolayer was generated in prior steps (Section 4.4).
Dispase	Gibco	17105041	Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
EGF	Thermo Scientific	236-EG-01M	When preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes.
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear Lid	Fisher	FB0875713A	N/A
Fisherbrand Cell Lifter	Fisher	08-100-240	N/A
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures Attached	Fisher	03-338B	N/A
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipette	Fisher	13-678-2D0	N/A
Fluoromount G Slide Mounting Medium	VWR	100241-874	N/A
Gibco advanced DMEM	Gibco	12-491-023	N/A
Goat anti-E-Cadherin	R&D systems	AF648	1:400 dilution (Primary antibody)
Goat anti-SOX17	R&D systems	AF1924	1:500 dilution (Primary antibody)
HCOs patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC)	Pluripotent Stem Cell Facility	N/A	Cells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906).
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA)	N/A	N/A	N/A
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS)	N/A	N/A	The pH must be 7.4.
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	101098-065	N/A
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)	Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)	N/A	Other hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line.
Leica microtome	N/A	N/A	N/A
LSM 880			confocal microscope
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	N/A
Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes.
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Nonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Mid-hindgut spheroids	N/A	N/A	N/A
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Mouse anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	1:300 dilution (Primary antibody)
Mouse anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	1:500 dilution
mTeSR1 complete growth medium	Stem Cell technologies	85870	Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use.
Murray's Clear solution (Also known as BABB)	Murray's	N/A	1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol.
NOG HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA).
NucleoSpin RNA	Takara	740955.25	Other RNA isolation kits may be used.
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with Matrigel	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with  Matrigel.	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOs	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration)
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Primers	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)	N/A	The primers are listed in Table 2 on the protocol.
Rabbit anti-CDX2	Cell Marque	EPR22764Y	1:100 dilution (Primary antibody)
Rabbit anti-SATB2	Cell Marque	EP281	1:100 dilution (Primary antibody)
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D systems	314-BP-010	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL.
Recombinant Human FGF-4 Protein	R&D systems	235-F4-01M	Reconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C.
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C.
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	11-754-250	N/A
SuperFrost Plus microscope slides
Tissue Tek O.C.T Compound	VWR	25608-930	N/A