Generazione, mantenimento e caratterizzazione di organoidi intestinali e del colon derivati da cellule staminali pluripotenti umane

Riepilogo

Qui vengono descritti metodi dettagliati per la generazione, il mantenimento e la caratterizzazione di organoidi intestinali e del colon derivati da cellule staminali pluripotenti umane. Questi metodi sono progettati per migliorare la riproducibilità, espandere la scalabilità e ridurre il tempo di lavoro necessario per la placcatura e il passaggio degli organoidi.

Abstract

La specificazione regionale intestinale descrive un processo attraverso il quale la morfologia e la funzione uniche vengono impartite ad aree definite del tratto gastrointestinale (GI) in via di sviluppo. La specificazione regionale nell'intestino è guidata da molteplici vie di sviluppo, tra cui la via della proteina morfogenetica ossea (BMP). Sulla base delle normali specifiche regionali, è stato sviluppato un metodo per generare organoidi del colon umano (HCO) da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), che includono cellule staminali embrionali umane (hES) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Un'induzione di tre giorni della segnalazione BMP modella sufficientemente le colture del tubo medio/posteriore in speciali HCO che esprimono la proteina legante la sequenza 2 (SATB2) ricca di AT contenente tutti i principali tipi di cellule epiteliali presenti nel colon umano e cellule mesenchimali in co-sviluppo. L'omissione del BMP (o l'aggiunta dell'inibitore del BMP NOGGIN) durante questo periodo critico di patterning ha portato alla formazione di organoidi intestinali umani (HIO). Gli HIO e gli HCO assomigliano morfologicamente e molecolarmente rispettivamente all'intestino tenue e al colon in via di sviluppo umano. Nonostante l'utilità di HIO e HCO per lo studio dello sviluppo intestinale umano, la generazione di HIO e HCO è impegnativa. Questo articolo presenta metodi per generare, mantenere e caratterizzare HIO e HCO. Inoltre, vengono forniti i passaggi critici del protocollo e i consigli per la risoluzione dei problemi.

Introduzione

Studiare lo sviluppo del colon umano è difficile a causa delle restrizioni sull'uso del tessuto fetale umano. I modelli animali sono stati inestimabili e storicamente utilizzati per approcci genetici nei topi per studiare lo sviluppo intestinale. Tuttavia, le differenze tra lo sviluppo intestinale del topo e quello umano limitano l'applicabilità dei topi come sistema modello. Ad esempio, sebbene la formazione di cripte nell'intestino tenue e nel colon dei topi avvenga dopo la nascita, gli esseri umani nascono con cripte completamente formate¹. Inoltre, l'intestino tenue umano e il colon contengono tipi di cellule che non si trovano nei topi, tra cui le cellule enteroendocrine che esprimono la motilina (MLN) nell'intestino tenue² e le cellule caliciformi che esprimono la mucina 5B (MUC5B) nel colon ^3,4. Per questo motivo, è importante disporre di un sistema di coltura cellulare che modelli accuratamente gli eventi molecolari dinamici che definiscono le prime fasi dello sviluppo del colon. Pertanto, dirigere le hPSC a generare cellule con caratteristiche del colon fornisce un potente modello per lo studio dello sviluppo del colon umano.

Sono stati sviluppati protocolli per facilitare la formazione riproducibile⁵, sincrona ed efficiente di organoidi simili all'intestino⁶ e colon-simili⁷ da hPSC. Questi protocolli utilizzano una procedura di differenziazione graduale che imita lo sviluppo dell'intestino fetale e del colon (Figura 1). In primo luogo, l'endoderma definitivo viene generato da cellule staminali pluripotenti umane mediante trattamento con Activina A, un mimetico nodale. L'esposizione dell'endoderma definitivo ad alti livelli di WNT e fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) induce la morfogenesi in sferoidi del tubo dell'intestino medio/posteriore CDX2⁺ . Gli sferoidi dell'intestino medio/posteriore vengono quindi incorporati nella matrice extracellulare (ECM) e modellati in HIO o HCO attraverso una manipolazione transitoria della segnalazione BMP. L'inibizione della segnalazione BMP utilizzando NOGGIN o l'aggiunta del solo terreno di crescita provoca la formazione di HIO, che assomigliano all'intestino tenue prossimale umano.

Attivando la segnalazione BMP utilizzando BMP2, gli sferoidi dell'intestino medio/posteriore vengono modellati in HCO, che mantengono il patterning nell'epitelio e nel mesenchima⁷. Gli HCO contengono cellule caliciformi arricchite nel colon che esprimono MUC5B e sono competenti per generare cellule enteroendocrine che esprimono insulina 5 (INSL5) specifiche per il colon. Il mesenchima isolato da HCO esprime l'omeobox A13 (HOXA13) e HOXD13, che sono espressi anche nel mesenchima primario del colon^{umano 8}. È importante ricordare che la fase di patterning si verifica durante i giorni 7-10 del protocollo di differenziazione. Questo periodo di tre giorni è sufficiente per indurre il patterning del colon che viene mantenuto dopo una coltura in vitro prolungata.

I protocolli descritti di seguito sono per i ricercatori che hanno familiarità con la coltura hPSC senza alimentatore. Per i ricercatori che non hanno familiarità con questo tipo di coltura di hPSC, è consigliato un corso di formazione sulle hPSC come quelli offerti da Stem Cell Technologies o dal Pluripotent Stem Cell Facility (PSCF) del Cincinnati Children's Hospital. La qualità delle hPSC di avviamento è fondamentale e può influenzare tutte le fasi a valle. Il protocollo che segue inizierebbe con le hPSC che sono state coltivate per 4 giorni e sono pronte per essere divise.

Protocollo

1. Generazione di organoidi intestinali e del colon umani

1. Preparazione di piastre rivestite ECM
   1. Aggiungere 50 mL di terreno DMEM freddo in una provetta conica da 50 mL.
   2. Rimuovere un'aliquota di 4 ECM qualificati hESC (vedere la Tabella dei materiali) dal congelatore a -80 °C e scongelare con ghiaccio.
      NOTA: Fare riferimento al certificato di analisi del prodotto per determinare il volume di ECM qualificato ESC necessario per preparare un stock 4x.
   3. Se l'ECM qualificato hESC non è completamente scongelato, prelevare 750 μL di DMEM dalla provetta conica da 50 mL e mescolarlo con l'ECM.
   4. Trasferire la miscela ECM qualificata DMEM/hESC nella provetta conica da 50 mL con DMEM e mescolare bene. Aggiungere 0,5 mL per pozzetto in ciascuna delle 4 piastre per colture cellulari da 24 pozzetti.
   5. Agitare le piastre per distribuire uniformemente l'ECM in tutto il pozzetto per assicurarsi che l'intera superficie sia coperta. Utilizzando il parafilm, sigillare le piastre rivestite di ECM e lasciarle a temperatura ambiente in una cappa di biosicurezza per almeno 1 ora. Conservare le piastre rivestite ECM a 4 °C per un massimo di 2 settimane o fino al momento del bisogno.
2. placcatura a cella singola hPSCs
   1. Posizionare una piastra a 24 pozzetti rivestita con ECM all'interno di una cappa di biosicurezza per 30 minuti per consentirle di raggiungere la temperatura ambiente.
   2. Posizionare il terreno completo mTeSR1, la soluzione di distacco cellulare e il DMEM avanzato all'interno di un bagno d'acqua a 37 °C e lasciarli riscaldare per 30 minuti.
   3. Verificare che le hPSC siano almeno all'85% confluenti con una differenziazione minima. Se necessario, rimuovere eventuali celle differenziate.
   4. Preparare il terreno di placcatura in una provetta conica da 50 mL come segue: 13 mL di mTeSR1 e 13 μL di 10 mM di inibitore della proteina chinasi associata a Rho (ROCK) Y-27632.
      NOTA: Y-27632 inibisce l'anoikis e aumenta la sopravvivenza delle singole cellule.
   5. Per raccogliere le cellule da una piastra a 6 pozzetti, aspirare il terreno da 3 a 4 pozzetti e lavare una volta con 2 mL di DMEM avanzato per pozzetto.
   6. Aspirare il DMEM avanzato e dosare 1 mL della soluzione di dissociazione cellulare in ciascun pozzetto. Incubare la piastra per 5-7 minuti all'interno di un'incubatrice al 5% di CO₂, 37 °C. Controllare al microscopio che le cellule siano in sospensione.
   7. Dissociare eventuali grumi di cellule rimanenti pipettando su e giù 4-5 volte utilizzando una pipetta da 5 ml.
   8. Aggiungere 2 mL di DMEM avanzato in ciascun pozzetto, pipettare delicatamente su e giù 4-5 volte e trasferire in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare le celle a 300 × g per 3 minuti a temperatura ambiente.
   9. Aspirare il terreno dalla provetta senza aspirare il pellet cellulare e aggiungere 6 mL del terreno preparato di mTeSR1 più l'inibitore ROCK. Risospendere delicatamente le cellule pipettando su e giù 3-4 volte, quindi trasferire la sospensione sul resto del terreno inibitore mTeSR1/ROCK all'interno della provetta da 50 mL. Risospendere energicamente 4-5 volte e contare le cellule utilizzando un ematocitometro.
   10. Aspirare l'ECM dalla piastra a 24 pozzetti appena prima di placcare le cellule. Risospendere nuovamente le cellule pipettando su e giù 2-3 volte ed erogare 0,5 mL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto.
       NOTA: La densità ottimale della placcatura deve essere determinata dallo sperimentatore. In questo caso, il numero ottimale di celle è di 80.000-200.000 cellule per pozzetto.
   11. Far oscillare delicatamente la piastra 3 volte in senso orario, 3 volte in senso antiorario, 3 volte avanti e indietro e 3 volte da un lato all'altro per disperdere uniformemente le cellule.
   12. Trasferire la piastra in un incubatore a 37 °C, CO₂ al 5% e incubare per 24 ore.
       NOTA: Non disturbare la piastra per le prime ore per garantire una corretta dispersione delle cellule all'interno dei pozzetti.
   13. Dopo 24 ore (Figura 2A), aspirare il terreno esaurito, aggiungere 0,5 mL per pozzetto di mTeSR1, incubare nuovamente a 37 °C, 5% di CO₂ per 24 ore (Figura 2B), quindi procedere alla fase successiva.
3. Differenziazione dell'endoderma definitivo (DE) dalle hPSC
   1. In una provetta conica da 15 mL, aggiungere 13 mL di terreno Activin Day 1 (vedere la Tabella dei Materiali), 13 μL di 100 μg/mL di Activina A e 1,95 μL di 100 μg/mL di BMP4. Scaldare il fluido a bagnomaria a 37 °C.
   2. Aspirare il terreno mTeSR1 dalla piastra a 24 pozzetti e aggiungere 0,5 ml di terreno Activin Day 1 per pozzetto. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO₂ e incubare per 24 ore. Controllare le celle dopo 24 ore.
      NOTA: La morte cellulare estesa dovrebbe essere evidente, come illustrato nella Figura 2C. Sebbene il monostrato appaia rado, le colonie di cellule si saranno espanse.
   3. Preparare il terreno completo Activin Day 2 aggiungendo 12,5 μL di 100 μg/mL di Activina A a 12,5 mL di terreno Activin Day 2 in una provetta conica da 15 mL. Immergere il tubo in un bagnomaria a 37 °C.
   4. Estrarre la piastra di differenziazione a 24 pozzetti dall'incubatore di CO₂ e rimuovere il terreno esaurito. Erogare 0,5 mL di terreno preriscaldato Activin Day 2 per pozzetto e riposizionare la piastra all'interno dell'incubatore di CO₂ per 24 ore.
      NOTA: Prestare attenzione durante l'erogazione del fluido. Non erogare il terreno direttamente al centro del pozzetto, poiché ciò staccherebbe le cellule nel monostrato. Erogare con cura il mezzo lungo il lato del pozzetto. Il giorno successivo, si forma un monostrato di cellule con una morte cellulare trascurabile. Le celle dovrebbero ora essere confluenti da ~90 a 95% (Figura 2D).
   5. Preparare il terreno completo Activin Day 3 aggiungendo 12,5 μL di 100 μg/mL di Activina A a 12,5 mL di terreno Activin Day 3 in una provetta conica da 15 mL. Immergere il tubo in un bagnomaria a 37 °C.
   6. Rimuovere il terreno esaurito ed erogare 0,5 ml di terreno Activin Day 3 per pozzetto.
      NOTA: Prestare attenzione durante l'erogazione del fluido. Non erogare il terreno direttamente al centro del pozzetto in quanto ciò staccherà le celle nel monostrato. Erogare con cura il mezzo lungo il lato del pozzetto. Il giorno successivo, il monostrato dovrebbe raggiungere la piena confluenza con poca o nessuna morte cellulare in questa fase. Non tentare di generare sferoidi medio-intestinali se il monostrato non è confluente 24 ore dopo l'aggiunta del terreno Activin Day 3. Fare riferimento alla Figura 2E per la morfologia ideale del monostrato DE prima di procedere alla generazione degli sferoidi medio-intestinali.
   7. Eseguire la colorazione in immunofluorescenza (IF) del monostrato per l'espressione della proteina A2 della forkhead box (FOXA2) e del fattore di trascrizione 17 (SOX17) della regione Y che determina il sesso (SRY) durante l'ottimizzazione della differenziazione DE.
4. Differenziazione di DE in sferoidi medio-posteriori
   1. In una provetta conica da 50 mL, aggiungere 25 mL di terreno di induzione dell'intestino medio con FGF4 (senza CHIR99021) e metterlo in un bagnomaria a 37 °C per 30 minuti.
   2. Per preparare il mezzo di induzione completo dell'intestino medio-posteriore, aggiungere 7,5 μl di CHIR99021 dopo che il terreno è caldo.
   3. Rimuovere il terreno esaurito, erogare 0,5 mL di terreno di induzione medio-posteriore per pozzetto e incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 24 ore.
   4. Dopo che il giorno successivo si è verificata la condensazione delle cellule all'interno del monostrato (Figura 3A), sostituire il terreno esaurito con un terreno di induzione fresco nell'intestino medio e riposizionare la piastra in un incubatore a 37 °C, 5% di CO₂ per 24 ore.
      NOTA: Le strutture tubolari saranno evidenti dopo 48 ore di induzione medio-intestinale, come mostrato nella Figura 3B. Gli sferoidi dell'intestino posteriore medio inizieranno a germogliare dal monostrato il giorno 3, come illustrato nella Figura 3C.
   5. Per evitare di scartare gli sferoidi galleggianti durante il cambio del terreno, trasferire il vecchio terreno in una provetta da 15 ml e centrifugare a 300 × g per 1 minuto. Risospendere gli sferoidi in 12,5 mL di terreno di induzione fresco dell'intestino medio-posteriore, aggiungere 0,5 mL per pozzetto nella stessa piastra a 24 pozzetti e incubare a 37 °C, 5% di CO₂ per 24 ore.
   6. Il 4° giorno di induzione dell'intestino posteriore (Figura 3D), prelevare gli sferoidi galleggianti dai pozzetti della piastra raccogliendo il terreno in una provetta da 15 mL seguita da centrifugazione a 300 × g per 1 minuto. Procedere al passaggio successivo per l'inclusione degli sferoidi dell'intestino medio posteriore nella MEC.
5. Placcatura e patterning di sferoidi medio/posteriori nell'ECM
   1. Scongelare la matrice della membrana basale della ECM a 4 °C durante la notte prima dell'inclusione.
      NOTA: Questo ECM è diverso dall'ECM qualificato hESC. L'ECM deve essere messo in ghiaccio e il volume appropriato di ECM può essere aliquotato in provette da microcentrifuga prerefrigerate da 1,5 ml su ghiaccio. La tabella 1 contiene informazioni sul volume dell'ECM. Assicurarsi che il volume dell'ECM sia almeno del 75% nella gocciolina in cui verranno incorporati gli sferoidi.
   2. Riscaldare una piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 °C.
   3. Raccogliere gli sferoidi galleggianti da tutti i 24 pozzetti utilizzando una pipetta da 1000 μl e trasferirli in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare gli sferoidi a 300 × g per 1 minuto a temperatura ambiente. Aspirare la maggior parte del substrato ma lasciare il volume necessario per la placcatura (Tabella 1).
   4. Preparare i puntali per pipette da 1000 μl e 200 μl tagliandone le estremità. Estrarre la piastra preriscaldata a 24 pozzetti.
   5. Miscelare gli sferoidi galleggianti, trasferire il volume appropriato nella provetta ECM posta sul ghiaccio, quindi risospendere gli sferoidi e l'ECM mediante pipettaggio per mescolarli bene.
   6. Prelevare 65 μl della miscela di sferoidi ed ECM con i puntali per pipette tagliati da 200 μl e caricare al centro di ciascun pozzetto nella piastra a 24 pozzetti. Per assicurarsi che si formi una buona gocciolina ECM, sollevare la pipetta delicatamente e lentamente mentre la miscela viene erogata.
      NOTA: Piastra 30-100 sferoidi per pozzetto.
   7. Trasferire delicatamente la piastra in un incubatore a 37 °C, CO₂ al 5% e incubare per 5 minuti.
   8. Capovolgere la piastra e incubare per 15-25 minuti, il che aiuterà le goccioline ECM a mantenere una struttura a cupola.
   9. Durante l'incubazione, preparare il terreno necessario e riscaldarlo. Una volta solidificata la MEC, aggiungere 0,5 mL di terreno di patterning HIO o HCO in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C, 5% CO₂. Vedere la Figura 3E per un'immagine degli sferoidi nell'ECM.
   10. Coltiva gli sferoidi nel mezzo di modellatura per 3 giorni.
   11. Dopo 3 giorni, cambiare il terreno di coltura HIO o HCO con un terreno di crescita normale e incubare a 37 °C, 5% di CO₂.
       NOTA: Gli organoidi in questo momento (Giorno 10) sono organoidi in fase iniziale. Sulla base dell'obiettivo del progetto, alcuni organoidi in fase iniziale possono essere utilizzati per l'analisi precoce del patterning, come descritto nella sezione 2.
6. Crescita e passaggio di organoidi intestinali e del colon umani
   1. Dopo il giorno 10, cambiare il terreno di coltura ogni 3 giorni.
      NOTA: A seconda della densità di placcatura e della crescita degli organoidi, potrebbe essere necessario un cambio di terreno più frequente. I cambi di terreno devono essere effettuati prima che il rosso fenolo (indicatore di pH) nel terreno diventi giallo.
   2. Incubare gli organoidi fino al giorno 21 (Figura 3F).
      NOTA: Il trattamento con BMP2 si tradurrà in una riduzione del numero di organoidi (~3 volte inferiore rispetto agli HIO) che crescono dagli sferoidi. Pertanto, è necessario placcare un numero maggiore di sferoidi per la generazione di HCO.
7. Scissione degli organoidi il giorno 21
   1. Ispezionare gli organoidi.
      NOTA: Gli organoidi devono essere divisi il giorno 21 poiché l'ECM è quasi degradato entro il giorno 21 a causa della crescita e dell'espansione degli organoidi.
   2. Preparare i puntali delle pipette da 1000 μl e 200 μl tagliandone le estremità.
   3. Riscaldare una piastra Nunc a 24 pozzetti in un incubatore a 37 °C.
   4. Aliquotare il volume appropriato di ECM nelle provette prerefrigerate da 1,5 mL (Tabella 1).
   5. Raschiare delicatamente la gocciolina di ECM con gli organoidi con un puntale per pipetta da 1000 μl e pipettare la miscela su e giù più volte per rompere l'ECM.
   6. Trasferire il composto in una capsula di Petri da 60 mm e controllare gli organoidi al microscopio. Se necessario, separare gli organoidi l'uno dall'altro utilizzando una pinza sterile. Assicurarsi che la separazione non danneggi l'epitelio degli organoidi.
   7. Trasferire gli organoidi in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 30 s. Aspirare il surnatante e lasciare ~1 mL di terreno nella provetta.
      NOTA: Il volume del fluido può essere modificato in base allo scopo dell'esperimento. Se sono necessari più organoidi per gocciolina di ECM, il volume del mezzo può essere ridotto. Tuttavia, se sono necessari meno organoidi, il volume medio può essere aumentato.
   8. Mescolare bene gli organoidi, trasferire il volume appropriato nella provetta ECM posta sul ghiaccio, quindi risospendere gli organoidi e l'ECM mediante pipettaggio per mescolarli bene.
   9. Aggiungere 65 μl della miscela di sferoidi ed ECM al centro di ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti utilizzando i puntali per pipette tagliati da 200 μl.
      NOTA: È fondamentale prelevare prima gli organoidi e poi l'ECM durante il pipettaggio. Pertanto, durante l'erogazione della miscela, gli organoidi si trovano nella parte superiore della gocciolina della ECM.
   10. Mettere la piastra in un'incubatrice a 37 °C, 5% CO₂ per 5 minuti.
   11. Capovolgere la piastra per altri 15-25 minuti per aiutare le goccioline ECM a mantenere una struttura a cupola.
   12. Aggiungere 0,5 mL di terreno di coltura HIO/HCO in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C, 5% CO₂.
       NOTA: Il terreno di crescita è lo stesso sia per gli HIO che per gli HCO dopo la modellazione.
   13. Cambiare il mezzo ogni 2-3 giorni fino al giorno 35 (Figura 3G).

2. Verifica del patterning di organoidi mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR)

1. Prima di raccogliere l'RNA, preparare 1x tampone di lisi dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore.
2. Scartare il terreno esaurito e aggiungere 350 μL di tampone di lisi a ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Lisi gli organoidi pipettandoli su e giù con una pipetta da 1 mL. Per una migliore lisi, agitare brevemente alla massima velocità per 5 s.
3. Conservare tutti i campioni a -80 °C fino al momento dell'estrazione dell'RNA. Una volta pronti, rimuovere i campioni di RNA dal congelatore a -80 °C e scongelarli con ghiaccio per 10 minuti. Agitare energicamente le provette a temperatura ambiente per 10-15 minuti per garantire la completa lisi dei campioni.
4. Posizionare nuovamente i campioni sul ghiaccio e procedere all'estrazione dell'RNA come indicato dal produttore. Trasferire i campioni di RNA in un congelatore a -80 °C se non sono pronti per procedere alla fase successiva.
5. Eseguire l'estrazione dell'RNA, il trattamento con DNAsi, la sintesi del cDNA e la RT-qPCR utilizzando la metodologia standard. Fare riferimento alla Tabella 2 per un elenco dei nomi e delle sequenze dei primer.

3. Verifica del patterning di organoidi mediante immunofluorescenza

1. Raccolta e fissazione di organoidi
   1. Aspirare il terreno HIO o HCO dai pozzetti appropriati e aggiungere 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ghiacciato a ciascun pozzetto. Dissociare gli organoidi dalla MEC utilizzando un puntale per pipetta da 200 μL tagliato. Pipettare su e giù per dissociare grandi pezzi di ECM dagli organoidi.
   2. Trasferire gli organoidi in una provetta conica da 15 ml e riempire il resto della provetta con PBS ghiacciato e mescolare delicatamente capovolgendo la provetta. Lasciare che gli organoidi si depositino per gravità e aspirare il PBS.
      NOTA: Se gli organoidi non si depositano per gravità, centrifugare a 300 × g per 1 min.
   3. Aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di soluzione ghiacciata per la degradazione dell'ECM. Tenere il tubo sul ghiaccio per 10-15 minuti su una piattaforma rotante agitando delicatamente.
      NOTA: Inclinare la provetta di un angolo di 45° per consentire una corretta miscelazione degli organoidi e della soluzione di recupero cellulare. Dopo 10-15 minuti, gli organoidi dovrebbero depositarsi sul fondo della provetta, indicando la completa digestione della MEC.
   4. Aggiungere PBS freddo nella provetta fino a 15 mL; Mescolare bene capovolgendo più volte il tubo. Quando gli organoidi si depositano sul fondo della provetta, aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di paraformaldeide preraffreddata al 4% per fissare gli organoidi. Incubare gli organoidi con paraformaldeide al 4% su ghiaccio per 1 ora.
   5. Riempire il resto del tubo con PBS ghiacciato e posizionarlo orizzontalmente su una piattaforma oscillante a 4 °C per una notte. Il giorno successivo, smaltire la paraformaldeide/PBS nell'apposito contenitore per rifiuti e lavare una volta con 15 mL di PBS ghiacciato, come descritto al punto 3.1.2.
   6. Aspirare il PBS e riempire la provetta con il 30% di saccarosio in PBS. Posizionare il tubo orizzontalmente su una piattaforma oscillante a 4 °C per una notte.
   7. Il giorno successivo, incorporare gli organoidi in un modello base di 7 mm x 7 mm x 5 mm con terreno OCT e congelare rapidamente utilizzando un bagno di ghiaccio secco/etanolo.
   8. Asciugare i blocchi con salviette da laboratorio, avvolgerli in un tovagliolo di carta e conservarli in congelatore a -80 °C per una notte. Il giorno successivo, tagliare sezioni di 5 μm su vetrini da microscopio utilizzando un criostato. Conservare i vetrini a -80 °C.
2. Colorazione in immunofluorescenza degli organoidi
   1. Elaborare i vetrini dal congelatore a -80 °C ed eseguire la colorazione IF utilizzando protocolli standard.
   2. Applicare i vetrini coprioggetti sui vetrini e asciugarli a temperatura ambiente, al riparo dalla luce per almeno 2 ore o durante la notte prima dell'imaging.
   3. Visualizzare i vetrini utilizzando un obiettivo 25x di un microscopio confocale.

Risultati

Il successo della generazione di sferoidi durante la fase di induzione dell'intestino medio/posteriore è indicativo del successo del patterning. Eseguire la colorazione IF per CDX2 su sferoidi flottanti e sul monostrato per confermare che il pattern sia corretto. Sebbene la colorazione allo stadio definitivo dell'endoderma (DE) possa indicare l'efficacia dell'induzione di DE, la generazione di sferoidi non è possibile senza un'efficiente induzione di DE. Per testare l'efficienza dell'i...

Discussione

La differenziazione delle hPSC in HIO e HCO è un processo complesso che richiede controlli di qualità in ogni fase. Le hPSC iniziali devono avere una differenziazione minima prima di iniziare la differenziazione in DE. L'ottimizzazione della densità delle hPSC piastrate per la differenziazione DE è fondamentale per il successo del protocollo. Per garantire la qualità della differenziazione DE, eseguire IF per FOXA2 e SOX17 per determinare l'efficienza della differenziazione DE. La d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% Bovine serum albumin (BSA) solution	N/A	N/A	N/A
15 mL Corning tube	Falcon	21008-918	N/A
30% Sucrose	N/A	N/A	Made in PBS.
5% Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Lab	017-000-121	N/A
50 mL Corning tube	Falcon	21008-951	N/A
Accutase	Thermo Scientific	A1110501	Cell detachment solution; aliquot 5 mL of Accutase into 10 mL tubes totaling 20 tubes and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
Activin A	Cell guidance Systems	GFH6-100x10	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Aliquot 38 µL of Activin A into prechilled microcentrifuge tubes and store at -80 °C (Tubes expire 12 months from date of receipt).
Activin Day 1 medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Use nonessential amino acids (NEAA, Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 1 medium: 500 mL of RPMI 1640 and 500 mL of NEAA. When preparing Activin Day 1 medium, add 13 mL of basic day 1 medium, 13 µl of Activin A (100 µg/mL), and 2 µl of BMP4 (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 2 medium (RPMI 1640, 0.2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 2 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL of NEAA, and 1 mL of 0.2% serum. When preparing Activin Day 2 medium, add 12.5 mL of basic day 2 medium and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Activin Day 3 medium (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)	Hyclone	SH30070.03T	Use nonessential amino acids (Corning 11140050) and store at 4 °C. Basic day 3 medium: 500 mL of RPMI 1640, 500 mL NEAA, and 10 mL of 2% serum. When preparing Activin Day 3 medium, add 12.5 mL of basic day 3 and 12.5 µL of Activin A (100 µg/mL). The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Goat	Thermo Scientific	A11055	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit	Thermo Scientific	A21206	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 546 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A10036	1:500 dilution (Secondary antibody)
Alexa Fluor 647 Donkey anti-Mouse	Thermo Scientific	A31571	1:500 dilution (Secondary antibody)
Base mold	Fisher	22-363-552	N/A
Basic gut medium (advanced DMEM)	Gibco	12491015	When preparing Basic gut medium, add 500 mL of DMEM, 500 mL of N2 (Gibco 17-502-048), 500 mL of B27 (Gibco), 500 mL of L-Glutamine to get 2 mM L-Glutamine (Corning A2916801), 5 mL of 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Gibco 15-140-122), and 7.5 mL of  1 M HEPES to get 15 mM HEPES.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Biorad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	N/A	Other qRT-PCR systems can be used.
Cell Recovery Solution	Corning	354253	ECM-degrading solution
CHIR99021	Reprocell	4000410	Reconstitute by adding 2.15 mL of DMSO at 10 mM. Prepare 50 µL aliquots and store at -20 °C.  Store powder at 4 °C, protected from light.
CTRL HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF.
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	1:100 dilution (Secondary antibody)
DE monolayer	N/A	N/A	Monolayer was generated in prior steps (Section 4.4).
Dispase	Gibco	17105041	Resuspend lyophilized powder in Advanced DMEM (Gibco MT15090CV) to a 1 mg/mL final concentration. Filter the solution for sterilization by vacuuming using a Millipore filter sterilization tube. Make 10 mL aliquots (1 mg/mL) and store at -20 °C for up to 6 months. Place at 4 °C overnight before use.
EGF	Thermo Scientific	236-EG-01M	When preparing 100 ng/mL EGF reconstitute 500 µg/mL in sterile PBS. Next add 2 mL of sterile PBS to 1 mg EGF and make 500 µg/mL EGF solution. Aliquot 100 µL of EGF in 20 tubes.
Fisherbrand 6 cm Petri Dishes with Clear Lid	Fisher	FB0875713A	N/A
Fisherbrand Cell Lifter	Fisher	08-100-240	N/A
Fisherbrand Class B Clear Glass Threaded Vials with Closures Attached	Fisher	03-338B	N/A
Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipette	Fisher	13-678-2D0	N/A
Fluoromount G Slide Mounting Medium	VWR	100241-874	N/A
Gibco advanced DMEM	Gibco	12-491-023	N/A
Goat anti-E-Cadherin	R&D systems	AF648	1:400 dilution (Primary antibody)
Goat anti-SOX17	R&D systems	AF1924	1:500 dilution (Primary antibody)
HCOs patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL BMP2. When preparing BMP2, add 1 mL of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to BMP2 vials (100 µg). Aliquot 25 µL of BMP4 solution in 4 tubes.  The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	N/A
Human Pluripotent Stem Cells (hPSC)	Pluripotent Stem Cell Facility	N/A	Cells seeded in a Matrigel coated 24-well plate (Thermo Scientific 73520-906).
Ice-cold 4% Paraformaldehyde solution (PFA)	N/A	N/A	N/A
Ice-cold Phosphate Buffered Saline (PBS)	N/A	N/A	The pH must be 7.4.
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen	Vector Laboratories	101098-065	N/A
Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)	Pluripotent Stem Cell Facility (Cincinnati Children's Hospital Medical Center)	N/A	Other hESC or iPSC lines can be used, but the protocol needs to be optimized for each cell line.
Leica microtome	N/A	N/A	N/A
LSM 880			confocal microscope
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	N/A
Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Prepare 4 x Matrigel aliquots which corresponds to volumes sufficient to make enough diluted Matrigel for 4 x 6-well dishes.
Mid-hindgut induction medium (RPMI 1640)	Corning	MT10041CV	Nonessential amino acids (Corning 11140050), 2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T), 3 µM CHIR99021 and 500 ng/mL FGF4. The base medium is stable for up to 3 weeks but should be used immediately after addition of growth factors.
Mid-hindgut spheroids	N/A	N/A	N/A
MilliporeSigma Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SCGP00525	N/A
Mouse anti-CDX2	BioGenex	MU392-UC	1:300 dilution (Primary antibody)
Mouse anti-FOXA2	Abnova/Novus	H00003170-M01	1:500 dilution
mTeSR1 complete growth medium	Stem Cell technologies	85870	Add 100-mL of mTeSR supplement (85870) into one 400-mL mTeSR medium (85870) and aliquot into 50-mL tubes while avoiding contamination. Store at 4°C until use.
Murray's Clear solution (Also known as BABB)	Murray's	N/A	1:2 benzyl benzoate and benzyl alcohol.
NOG HIO patterning medium	N/A	N/A	Basic gut medium, 100 ng/mL EGF and 100 ng/mL NOGGIN (Dispense 25 µg of NOGGIN in 250 µl sterile PBS with 0.1% BSA).
NucleoSpin RNA	Takara	740955.25	Other RNA isolation kits may be used.
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 24-wells coated with Matrigel	Thermo Scientific	73521-004	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells (Nunc)	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Nunclon delta surface tissue culture dish 6-wells coated with  Matrigel.	Thermo Scientific	73520-906	N/A
Outgrowth medium for HIOs, CTRL HIOs, and HCOs	N/A	N/A	Basic gut medium and 100 ng/mL EGF (Final concentration)
Phosphate Buffer Saline, 0.5% Triton X (PBS-T)	N/A	N/A	N/A
Primers	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)	N/A	The primers are listed in Table 2 on the protocol.
Rabbit anti-CDX2	Cell Marque	EPR22764Y	1:100 dilution (Primary antibody)
Rabbit anti-SATB2	Cell Marque	EP281	1:100 dilution (Primary antibody)
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D systems	314-BP-010	Reconstitute the lyophilized powder at 100 µg/mL in sterile 4 mM HCl containing 0.1% bovine serum albumin (BSA). Add 4.17 mL HCl solution to 45.83 mL molecular water totaling to 50 mL of 1 M HCl. Then add 200 µL of 1 M HCl to 49.8 mL of molecular grade water totaling to 50 mL of 4 mM HCl. Next add 0.05 g BSA to 50 mL of 4 mM HCl and filter to make sterile. Aliquot sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to 33 microcentrifuge tube totaling and store at -20 °C. Add 100 µl of sterile 4 mM HCl 0.1% BSA to the BMP4 vials (10 µg) to make BMP4 solution at 100 µg/mL.
Recombinant Human FGF-4 Protein	R&D systems	235-F4-01M	Reconstitute at 100 µg/mL in sterile PBS containing 0.1% bovine serum albumin. Add 0.05 g of BSA in 50 mL of PBS to make 0.1% BSA. Filter 0.22 µM BSA to sterilize the BSA. Aliquot 10 mL of 0.1% BSA in 5 tubes. Add 1 mg FGF-4 in 10 mL of sterile 0.1% BSA. Aliquot 250 µL into prechilled 40 microcentrifuge tubes and store at -80 °C.
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	The final concentration is 10 mM (10 mmol/L). Resuspend in DMSO at 10 mM and filter sterilize. Add 3 mL of sterile PBS to each vial. Aliqout 100 µL of ROCK inhibitor in 30 tubes and store at -20 °C.
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	11-754-250	N/A
SuperFrost Plus microscope slides
Tissue Tek O.C.T Compound	VWR	25608-930	N/A