הערכת ספי החישה בכלבים באמצעות בדיקה חושית כמותית מכאנית ותרמית חמה

Summary

עבודה זו מתארת פרוטוקול סטנדרטי לבדיקות חושיות כמותיות מכניות ותרמיות חמות להערכת המערכת הסומטוסנסורית אצל כלבים. ספי החישה נמדדים באמצעות מד הרדמה אלקטרוני של פון פריי, אלגומטר לחץ ותרמוד מגע חם.

Abstract

בדיקות חושיות כמותיות (QST) משמשות להערכת תפקוד המערכת הסומטוסנסורית אצל כלבים על ידי הערכת התגובה לגירויים מכניים ותרמיים מיושמים. QST משמש לקביעת ספי החישה הנורמליים של כלבים ולהערכת שינויים במסלולי החישה ההיקפיים והמרכזיים הנגרמים על ידי מצבי מחלה שונים, כולל דלקת מפרקים ניוונית, פגיעה בעמוד השדרה וקרע ברצועה הצולבת הגולגולתית. ספי החישה המכניים נמדדים על ידי מדי הרדמה אלקטרוניים של פון פריי ומדי לחץ. הם נקבעים ככוח שבו הכלב מפגין תגובה המעידה על תפיסת גירוי מודע. ספי חישה תרמיים חמים הם זמן ההשהיה להגיב לגירוי טמפרטורה קבוע או מוגבר המופעל על ידי תרמוד מגע.

הקפדה על פרוטוקול עקבי לביצוע QST ותשומת לב לפרטים של סביבת הבדיקה, הנוהל ונושאי המחקר הבודדים הם קריטיים להשגת תוצאות QST מדויקות עבור כלבים. פרוטוקולים לאיסוף סטנדרטי של נתוני QST בכלבים לא תוארו בפירוט. QST צריך להתבצע בסביבה שקטה, ללא הסחות דעת ונוחה לכלב, למפעיל QST ולמטפל. הקפדה על כך שהכלב רגוע, רגוע וממוקם כראוי עבור כל מדידה מסייעת לייצר תגובות אמינות ועקביות לגירויים והופכת את תהליך הבדיקה לקל יותר לניהול. מפעיל ה- QST והמטפל צריכים להכיר ולהרגיש בנוח עם טיפול בכלבים ופירוש תגובות התנהגותיות של כלבים לגירויים שעלולים להיות כואבים כדי לקבוע את נקודת הסיום של הבדיקה, להפחית מתח ולשמור על בטיחות במהלך תהליך הבדיקה.

Introduction

בדיקה חושית כמותית (QST) מעריכה את התגובות המתעוררות על ידי גירויים חיצוניים; הוא משמש להערכת תפקוד המערכת הסומטוסנסורית בבני אדם ובבעלי חיים¹. גירויים מכניים בצורה של לחץ ניקוב או לחץ עמוק מוחלים כגירוי רמור. הסף החושי נקבע ככוח המעורר תגובה פסיכופיזית¹. גירויים תרמיים חמים או קרים יכולים לשמש כגירוי רמוס או כגירוי בעוצמה קבועה. הסף החושי נקבע כטמפרטורה שבה יש תגובה או השהיה להגיב לגירוי. ספי החישה של לחץ מנוקב נמדדים באמצעות מדי הרדמה אלקטרוניים של פון פריי או חוטי שיער של פון פריי, לחץ עמוק נמדד באמצעות אלגומדי לחץ ידניים, וספי החישה התרמית נקבעים באמצעות מגוון מערכות תרמוד מגע.

QST מספק מידע על תפקודם של מסלולים חושיים היקפיים ומרכזיים וניתן להשתמש בו כדי להעריך שינויים במסלולים חושיים אלה (אלגופלסטיות) בתהליכי מחלה שונים, במיוחד אלה הגורמים לכאב כרוני¹. כדוריות הדם של מייסנר מזהות לחץ ניקוב, והתחושה מועברת על ידי סיבי Aβ afferent ברמות לא מזיקות וסיבי Aδ afferent כאשר הגירוי הוא בעוצמה מזיקה ^1,2. לחץ עמוק מזוהה על ידי כדוריות Pacinian ומועבר על ידי סיבי C afferent, חום מזיק מזוהה על ידי כדוריות Ruffini ומועבר על ידי Aδ ו- C afferent סיבים, וקור מזיק מזוהה על ידי כדוריות קראוזה ומועבר על ידי C afferent סיבים ^1,2. QST יכול לשמש כדי לזהות הן עיכוב (ירידה ברגישות, hypoesthesia) והקלה (רגישות מוגברת, hyperesthesia) של קולטנים אלה ומסלולים. בכלבים, QST שימש להערכת שינויים בספים התחושתיים משניים לפגיעה חריפה בחוט השדרה 3,4,5, מום דמוי כיארי וסירינגומיאליה⁶, קרע ברצועה הצולבת הגולגולתית^5,7 ודלקת מפרקים ניוונית (OA) ^8,9,10. בנוסף, מחקרים מסוימים השתמשו ב- QST כדי להעריך הקלה בכאב המסופקת על ידי משככי כאבים מסוימים 6,11,12,13 והליכים כירורגיים ¹⁴. מחקרים אלה סיפקו תובנות חשובות לגבי מנגנוני תחושת הכאב אצל כלבים, כגון ראיות לרגישות היקפית ומרכזית לאחר ניתוח ומחלות הגורמות למצבי כאב כרוניים כגון קרע ברצועה הצולבת הגולגולתית ו- OA. מידע זה יכול לסייע בשיפור הזיהוי והטיפול בכאב אצל כלבים.

מחקרי תיקוף של QST תרמי מכני וחם בכלבים הראו היתכנות טובה, חזרתיות ואמינות של תוצאות QST לאורך זמן בכלבים רגילים ובכלבים עם כאב כרוני מ- OA 8,9,15,16. עם זאת, מספר מחקרים מצאו יכולת חזרה ירודה ואמינות של תרמי קר ולעיתים פון פריי QST 1,15,17. מחקרים אלה השתמשו בציוד ובמתודולוגיה שונים, אך סיפקו ראיות לכך ש-QST תרמי מכני וחם היא שיטה מדויקת, כמותית למחצה, למדידת ספי חישה אצל כלבים. עם זאת, תשומת לב לפרטים מדויקים, כולל הגדרת המדידות, היא קריטית לאופטימיזציה של QST בכלבים, מה שמחייב פרוטוקול סטנדרטי עבור QST. Sanchis-Mora et al. פירטו פרוטוקול בדיקת סף חושי (STEP) עבור QST תרמי מכני וחם וקר, אך נתקלו בקושי עם כלבים שלא הגיבו ל- QST תרמי קר או לחוט הלהט בעל כוח הגרם הגבוה ביותר פון פריי ששימש במחקר¹⁷. הפרוטוקול הבא מספק שיטה סטנדרטית עבור QST תרמי מכני וחם בכלבים; פרוטוקול זה יכול להעריך ספי חישה אצל כלבים רגילים או כלבים עם תהליכי מחלה שונים המשפיעים על המערכת הסומטוסנסורית. פיתוח פרוטוקולים סטנדרטיים עשוי לאפשר השוואת תוצאות בין מחקרים ומטא-אנליזות של נתונים כדי לשפר את התועלת של QST ברפואה וטרינרית.

Protocol

כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת צפון קרוליינה.

1. סידור חדרים והתאקלמות נושא הלימוד

1. בצע QST בחלל ייעודי שבו יש מספיק מקום למפעיל QST, מטפל וכלב בכל גודל לנוע בנוחות. צמצם הסחות דעת שמיעתיות וחזותיות פוטנציאליות והשתמש במכונת רעש לבן כדי לחסום את צלילי הסביבה.
2. הניחו מזרן יוגה גדול או ריפוד דומה על הרצפה כדי להבטיח שהכלבים ירגישו בנוח בשכיבה הצידית במהלך הבדיקה.
3. אפשרו לכלב לפחות 10 דקות לחקור בחופשיות ולהתאקלם בחדר ולהרגיש בנוח עם מפעיל ומטפל QST. הציעו מים מתוקים בחדר, ותנו מדי פעם תגמולי מזון.
4. חולק באופן אקראי את אתר הבדיקה (צד שמאל או ימין) על ידי הטלת מטבע. חותכים קטע פרווה בגודל של כ-2X4 ס"מ שמרכזו סביב החלל שבין המשטח הגבי של המטטרסל השלישי והרביעי באמצע הדרך בין המפרק הטרסומטטרסלי למפרק המטטרסופלנגאלי. יש להצמיד קטע פרווה בגודל של כ-1X2 ס"מ על האנטברכיום הצידי רק פרוקסימלי למפרק האנטברכיוקרפלי מעל האולנה.

2. מד הרדמה אלקטרוני של פון פריי

1. הגדרת כלי נגינה
   1. יש למרוח בעדינות קצה פון פריי קשיח בקוטר 0.9 מ"מ על תא המטען ולוודא שתא המטען מוברג היטב לתוך הידית. חברו את הכבל מהידית למכשיר ההקלטה דרך ערוץ M0 (איור 1A,B).
   2. הפעילו את מכשיר ההקלטה ולחצו על כפתור MAX כדי שהמכשיר יתעד ויציג את הכוח המרבי שהושג כאשר הכלב מגיב לגירוי שהופעל (איור 1C).
   3. אפס את המכשיר על ידי לחיצה על לחצן CLR .
2. איסוף נתונים
   1. הניחו את הכלב בשכיבה רוחבית למדידת ספים.
      הערה: כלבים ממוקמים בשכיבה צידית ימנית למדידת ספי הגפיים השמאליות או ממוקמים בשכיבה צידית שמאלית למדידת ספים בגפיים הימניות. אם הכלב לא ישכב מרצונו בשכיבה צידית כאשר יינתנו לו רמזים מילוליים, מפעיל ה- QST והמטפל יכולים להניח את הכלב באופן ידני בשכיבה רוחבית.
   2. יש למרוח ריסון מינימלי עד בינוני לפי הצורך כדי לשמור על הכלב בשכיבה צידית ושקטה יחסית.
      הערה: המטפל מבצע שלב זה.
   3. יש להפעיל את הגירוי ברגע שהכלב רגוע ונינוח והאיבר הנבדק נמצא בהארכה של 70% לפחות. ספק תמיכה ידנית עדינה לגפה הנבדקת כדי להרחיק את הגפה מהרצפה ולספק גב יציב להפעלת כוח נגד מבלי למנוע מהכלב למשוך את הגפה.
      הערה: אופרטור QST מבצע שלב זה.
   4. יש למרוח את קצה פון פריי בניצב לעור האזור הנבדק. אם הכלב מפגין תנועות רפלקס (למשל, עוויתות של הכפפה או נסיגה של הגפה לפני הפעלת כוח) מהתחושה של קצה פון פריי על העור, אפשרו לכלב להרפות את האיבר שוב לפני שתניחו מחדש את קצה פון פריי. בצע מדידה כאשר העור אינו גורם לתנועות רפלקס על ידי מריחת קצה פון פריי.
   5. הפעילו כוח הולך וגובר עם קצה פון פריי (~20 גרם לשנייה) עד שהכלב מושך את האיבר, משמיע קול, מסתובב להסתכל על הגירוי, או מפגין תנועות או תגובות התנהגותיות אחרות המצביעות על תפיסה מודעת של הגירוי. הסר את הגירוי כאשר הכלב מושך את האיבר, או הכוח המרבי הוא הגיע.
      הערה: אין לחרוג מ-1,000 גרם של כוח.
   6. רשום את הכוח המרבי המופעל המוצג במכשיר ההקלטה.
      הערה: אם מגיעים לסף הבטיחות של 1,000 גרם כוח, 1,000 גרם נרשמים כסף החושי, ומצוין שלא הייתה תגובה לפני ניתוק הבטיחות.
   7. חזור על המדידות בסך הכל חמישה ניסיונות, ואפשר דקה אחת בין כל מדידה (מרווח בין משפטים). אפס את המכשיר בין כל שלב על ידי לחיצה על לחצן CLR .
      1. אפשרו לכלב להישאר בשכיבה צידית במהלך המרווחים שבין הניסויים אם הוא נשאר רגוע ונינוח יחסית ללא איפוק או מינימלי. אחרת, אפשרו לכלב לשבת, לעמוד או לנוע בחדר QST כדי לשמור על נוחותו. החזירו את הכלב לשכיבה רוחבית לפני המדידה הבאה.
   8. רשום ציון היתכנות של 0-5 כדי לציין את הקלות שבה נאספו הנתונים.
      הערה: ציוני ההיתכנות הם כדלקמן: 0 = אין בעיה, 1 = קושי קל, 2 = קושי בינוני, 3 = קושי משמעותי, 4 = קשה מאוד, 5 = בלתי אפשרי. הכותרת המשמשת להקצאת ציוני היתכנות מופיעה בטבלה 1.
   9. תן לכלב הפסקה של 5 דקות לפני תחילת המדידות עם אלגומטר הלחץ הקהה.

3. אלגומטר לחץ קהה

1. הגדרת כלי נגינה
   1. ודאו שהגשושית הקטנה והקהה מוברגת היטב לתוך המכשיר (איור 2A).
   2. הפעל את מכשיר ההקלטה ולחץ על MAX כפתור כדי להמשיך כאשר תתבקש לעשות זאת על המסך. לחצו על כפתור UNIT עד שהיחידה תוצג כגרמים (g) בחלק העליון של המסך (איור 2B).
   3. אפס את המכשיר על ידי לחיצה על כפתור ZERO .
2. איסוף נתונים
   1. הניחו את הכלב בשכיבה רוחבית למדידת ספים.
      הערה: כלבים ממוקמים בשכיבה צידית ימנית למדידת ספי הגפיים השמאליות או ממוקמים בשכיבה צידית שמאלית למדידת ספים בגפיים הימניות. אם הכלב לא ישכב מרצונו בשכיבה צידית כאשר יינתנו לו רמזים מילוליים, מפעיל ה- QST והמטפל יכולים להניח את הכלב באופן ידני בשכיבה רוחבית.
   2. יש למרוח ריסון מינימלי עד בינוני לפי הצורך כדי לשמור על הכלב בשכיבה צידית ושקטה יחסית.
      הערה: המטפל מבצע שלב זה.
   3. יש להפעיל את הגירוי ברגע שהכלב רגוע ונינוח והאיבר הנבדק נמצא בהארכה של כ-70%. ספקו תמיכה ידנית עדינה לגפה הנבדקת כדי להרחיק את הגפה מהרצפה ולספק גב יציב להפעלת כוח נגדה, מבלי למנוע מהכלב למשוך את האיבר.
      הערה: אופרטור QST מבצע שלב זה.
   4. מרחו את הגשושית הקהה בניצב לעור האזור הנבדק (איור 2C). אם הכלב מפגין תנועות רפלקס (למשל, עוויתות של הכף או נסיגה של הגפה לפני הפעלת כוח) מהתחושה של הבדיקה הקהה על העור, אפשרו לכלב להרפות את האיבר שוב לפני שתפעילו מחדש את הבדיקה הקהה. בצע מדידה כאשר היישום של הבדיקה הקהה על העור אינו גורם לתנועות רפלקס.
   5. הפעילו כוח הולך וגובר עם הגשושית (~20 גרם לשנייה) עד שהכלב מושך את האיבר, משמיע קול, מסתובב להסתכל על הגירוי, או מפגין תנועות או תגובות התנהגותיות אחרות המצביעות על תפיסה מודעת של הגירוי. הסר את הגירוי כאשר הכלב מושך את האיבר או את הכוח המרבי הוא הגיע.
      הערה: אין לחרוג מ-2,500 גרם של כוח.
   6. רשום את הכוח המרבי המופעל המוצג במכשיר ההקלטה.
      הערה: אם מגיעים לחתך הבטיחות של 2,500 גרם כוח, 2,500 גרם נרשמים כסף החושי, ומצוין שלא הייתה תגובה לפני ניתוק הבטיחות.
   7. חזור על המדידות במשך חמישה ניסויים בסך הכל, ואפשר דקה אחת בין כל מדידה (מרווח בין משפטים). אפס את המכשיר בין כל צעד על ידי לחיצה על כפתור ZERO .
      1. אפשרו לכלב להישאר בשכיבה צידית במהלך המרווח שבין הניסויים, אם הוא נשאר רגוע ונינוח יחסית, ללא ריסון או מינימום. אחרת, אפשרו לכלב לשבת, לעמוד או לנוע בחדר QST כדי לשמור על נוחותו. החזירו את הכלב לשכיבה רוחבית לפני המדידה הבאה.
   8. רשום ציון היתכנות של 0-5 כדי לציין את הקלות שבה נאספו הנתונים.
      הערה: ציוני ההיתכנות הם כדלקמן: 0 = אין בעיה, 1 = קושי קל, 2 = קושי בינוני, 3 = קושי משמעותי, 4 = קשה מאוד, 5 = בלתי אפשרי.
   9. תן לכלב הפסקה של 5 דקות לפני תחילת המדידות עם הבדיקה התרמית החמה.

4. בדיקה תרמית חמה

1. הגדרת כלי נגינה
   1. חבר את המנתח התרמו-סנסורי למחשב באמצעות כבל USB וודא שהתרמוד בגודל 16 x 16 מ"מ מחובר למנתח. הפעל את המנתח.
   2. פתח את תוכנת המנתח התרמו-סנסורי במחשב ובחר את מנתח TSA II מתפריט ההפעלה. לחץ על אישור על האזהרה המוקפצת לבדיקה העצמית של המנתח. ודא כי התרמוד אינו מחובר לנבדק המחקר במהלך הבדיקה העצמית.
   3. בכרטיסיה TEST (בפינה השמאלית העליונה), תחת ההנחיה Select Patient (בצד שמאל של המסך), בחר את המטופל המתאים על-ידי לחיצה כפולה על השם ברשימה.
      1. כדי ליצור מטופל חדש, לחץ על הכרטיסייה חולים מימין לכרטיסייה בדיקה . לחץ על סמל המטופל החדש בפינה השמאלית התחתונה ומלא את פרטי המטופל (מחלקה, שם פרטי ושם משפחה של המטופל , תעודת זהות, מין ותאריך לידה).
   4. תחת הפקודה בחר תוכנית בכרטיסיה בדיקה, בחר את התוכנית המתאימה על-ידי לחיצה כפולה על התוכנית ברשימה.
      1. כדי ליצור תוכנית חדשה, לחץ פעם אחת על הכרטיסייה תוכניות משמאל לכרטיסייה מטופלים . לחץ על סמל תוכנית חדשה בפינה השמאלית התחתונה ומלא את פרטי התוכנית.
         הערה: עבור פרוטוקול זה, פרטי התוכנית מפורטים בטבלה 2. אין צורך לבחור אתר גוף תחת ההנחיה בחר אתר גוף בכרטיסיה בדיקה .
   5. לאחר בחירת המטופל והתוכנית המתאימים, לחץ על ההנחיה עבור לבדיקה תחת הכרטיסייה בדיקה . לחץ לחיצה בודדת על כפתור Pre-Test בפינה השמאלית התחתונה כדי לכייל את המנתח לתוכנית שצוינה.
   6. לאחר השלמת הבדיקה המקדימה, לחצן קדם-בדיקה מוחלף בלחצן התחל, וחלון הבדיקה מוצג: לחץ על לחצן התחל כדי להתחיל את הבדיקה (איור 3A).
   7. שחררו את כבל התרמוד וודאו שהתרמוד נגיש בקלות.
2. איסוף נתונים
   1. הניחו את הכלב בשכיבה צידית למדידת השהיה תרמית.
      הערה: כלבים ממוקמים בשכיבה צידית ימנית למדידת ספי הגפיים השמאליות או ממוקמים בשכיבה צידית שמאלית למדידת ספים בגפיים הימניות. אם הכלב לא ישכב מרצונו בשכיבה צידית כאשר יינתנו לו רמזים מילוליים, מפעיל ה- QST והמטפל יכולים להניח את הכלב באופן ידני בשכיבה רוחבית.
   2. יש למרוח ריסון מינימלי עד בינוני לפי הצורך כדי לשמור על הכלב בשכיבה צידית ושקטה יחסית.
      הערה: המטפל מבצע שלב זה.
   3. יש להפעיל את הגירוי ברגע שהכלב רגוע ונינוח והאיבר הנבדק נמצא בהארכה של כ-70%. ספקו תמיכה ידנית עדינה לגפה הנבדקת כדי להרחיק את האיבר מהרצפה מבלי למנוע מהכלב למשוך את האיבר. כמו כן, החזיקו והפעילו סטופר כשהיד תומכת באיבר.
      הערה: אופרטור QST מבצע שלב זה.
   4. מרחו את התרמוד על העור של האזור הנבדק (איור 3B). אם הכלב מפגין תנועות רפלקס (למשל, עוויתות של הכף או נסיגה של הגפה לפני הפעלת החום) מתחושת התרמוד על העור, אפשרו לכלב להרפות שוב את האיבר לפני שתפעילו מחדש את התרמוד. בצע מדידה כאשר מריחת התרמוד על העור אינה גורמת לתנועות רפלקס.
   5. לחץ על התחל כפתור בפינה השמאלית התחתונה של הכרטיסייה TEST כדי להתחיל את הבדיקה.
      הערה: מפעיל ה- QST מאותת למטפל להתחיל את הבדיקה (לדוגמה, על ידי הנהון ראש), ומפעיל ה- QST מפעיל את שעון העצר בו-זמנית.
   6. הסר את התרמוד כאשר הכלב מושך את האיבר, משמיע קול, מסתובב להסתכל על הגירוי, או מפגין תנועות או תגובות התנהגותיות אחרות המעידות על תפיסה מודעת של הגירוי או מתי מגיעים לחביון המרבי תוך עצירת הסטופר בו זמנית.
      הערה: אופרטור QST מבצע שלב זה. אין לחרוג מ-20 שניות של יישום תרמוד או מטמפרטורת תרמוד מרבית של 49°C.
   7. רשום את ההשהיה לנסיגה. אם מגיעים לחיתוך הבטיחות של 20 שניות של יישום תרמודה, רשום 20 שניות כהשהיה חושית, ושים לב שלא הייתה תגובה לפני ניתוק הבטיחות.
   8. חזור על המדידות במשך חמישה ניסויים בסך הכל, ואפשר דקה אחת בין כל מדידה (מרווח בין משפטים). לחצו על כפתור End Test ולאחר מכן על כפתור Pre-Test בין כל מדידה כדי להפסיק לחמם את התרמוד ולכייל מחדש את התרמוד כדי להתכונן ליישום הבא.
      הערה: המטפל מבצע שלב זה.
      1. אפשרו לכלב להישאר בשכיבה צידית במהלך המרווח שבין הניסויים, אם הוא נשאר רגוע ונינוח יחסית, ללא ריסון או מינימום. אחרת, אפשרו לכלב לשבת, לעמוד או לנוע בחדר QST כדי לשמור על נוחותו. החזירו את הכלב לשכיבה רוחבית לפני המדידה הבאה.
   9. רשום ציון היתכנות של 0-5 כדי לציין את הקלות שבה נאספו הנתונים.
      הערה: ציוני ההיתכנות הם כדלקמן: 0 = אין בעיה, 1 = קושי קל, 2 = קושי בינוני, 3 = קושי משמעותי, 4 = קשה מאוד, 5 = בלתי אפשרי.

תוצאות

QST מכני ותרמי בוצע כדי לזהות ספי חישה הן בכלבים מחקריים והן בכלבים בבעלות הלקוח בתנאים קליניים שונים, כולל כלבים רגילים ובריאים, כלבים עם מצבים כואבים כרוניים כגון OA, כלבים עם פגיעה חריפה בעמוד השדרה, ולהעריך כאב לאחר הניתוח ויעילות משככי כאבים. למרות שיש גוף הולך וגדל של עבודה על QST בכלבים, ...

Discussion

חשוב מאוד להשיג נתונים מדויקים - המשקפים את סף החושים של הכלב - שהכלב יהיה רגוע, רגוע וממוקם כראוי לכל מדידה. מחקר קודם ציין כי תסיסה מאיפוק או הסחת דעת מגורמים בתוך או מחוץ לסביבת הבדיקה השפיעה על תגובות הכלבים לגירויי QST¹⁶. אם הכלב נעשה נסער משכיבה או איפוק או מוסח, יש לתת לכלב ז?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Electronic von Frey anesthesiometer	IITC Life Science Inc.	Item # 23931	Custom made with a 1000g max force load cell
Medoc Main Station software	Medoc	(supplied with TSA-II)
SMALGO: SMall Animal ALGOmeter	Bioseb	Model VETALGO
TSA-II NeuroSensory Analyzer	Medoc	DC 00072 TSA-II	No longer manufactured - new model is TSA-2 with same probes and same function