JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פלטפורמה מיקרופלואידית פנאומטית שיכולה לשמש לריכוז יעיל של מיקרו-חלקיקים.

Abstract

המאמר הנוכחי מציג שיטה לייצור והפעלה של שסתום פנאומטי לבקרת ריכוז החלקיקים באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית. לפלטפורמה זו יש רשת תלת-ממדית (תלת-ממדית) עם תעלות נוזל מעוגלות ושלושה שסתומים פנאומטיים, היוצרים רשתות, תעלות וחללים באמצעות שכפול דו-ממדי עם פולידימתילסילוקסן (PDMS). המכשיר פועל על סמך התגובה הארעית של קצב זרימת נוזל הנשלט על ידי שסתום פנאומטי בסדר הבא: (1) טעינת דגימה, (2) חסימת דגימה, (3) ריכוז דגימה ו-(4) שחרור דגימה. החלקיקים נחסמים על ידי עיוות שכבת הסרעפת הדקה של צלחת המסננת (Vs) ומצטברים בתעלה המיקרופלואידית המעוקלת. נוזל העבודה משוחרר על ידי הפעלה של שני שסתומי הפעלה/כיבוי. כתוצאה מהפעולה, כל החלקיקים בעלי הגדלות השונות יורטו והתנתקו בהצלחה. כאשר טכנולוגיה זו מיושמת, לחץ ההפעלה, הזמן הנדרש לריכוז וקצב הריכוז עשויים להשתנות בהתאם למידות המכשיר ולהגדלה של גודל החלקיקים.

Introduction

בשל החשיבות של ניתוח ביולוגי, טכנולוגיות מיקרופלואידיות וביו-רפואיות מיקרו-אלקטרומכניות (BioMEMS) 1,2 משמשות לפיתוח וחקר התקנים לטיהור ואיסוף של מיקרו-חומרים 2,3,4. לכידת חלקיקים מסווגת כאקטיבית או פסיבית. מלכודות פעילות שימשו עבור כוחות דיאלקטריים חיצוניים5, מגנטופורטיים6, שמיעתיים7,חזותיים 8 אותרמיים 9 הפועלים על חלקיקים עצמאיים, ומאפשרים שליטה מדויקת על תנועותיהם. עם זאת, נדרשת אינטראקציה בין החלקיק לכוח החיצוני; לפיכך, התפוקה נמוכה. במערכות מיקרופלואידיות, שליטה בקצב הזרימה חשובה מאוד מכיוון שהכוחות החיצוניים מועברים לחלקיקי המטרה.

באופן כללי, למכשירים מיקרופלואידיים פסיביים יש מיקרופילרים במיקרו-ערוצים10,11. חלקיקים מסוננים באמצעות אינטראקציה עם נוזל זורם, והתקנים אלה קלים לתכנון וזולים לייצור. עם זאת, הם גורמים לסתימת חלקיקים במיקרו-עמודים, ולכן פותחו התקנים מורכבים יותר כדי למנוע סתימת חלקיקים12. התקנים מיקרופלואידיים עם מבנים מורכבים מתאימים בדרך כלל לניהול מספר מוגבל של חלקיקים 13,14,15,16,17,18.

מאמר זה מתאר שיטה לייצור והפעלה של פלטפורמה מיקרופלואידית המונעת על ידי פנאומטית עבור ריכוזי חלקיקים גדולים המתגברת על החסרונות18 כאמור לעיל. פלטפורמה זו יכולה לחסום ולרכז חלקיקים על ידי דפורמציה והפעלה של שכבת הסרעפת הדקה של צלחת שסתום המסננת (Vs) המצטברת בתעלות מיקרופלואידיות מעוקלות. חלקיקים מצטברים בתעלות מיקרופלואידיות מעוקלות, והחלקיקים המרוכזים יכולים להיפרד על ידי פריקה של נוזל העבודה באמצעות הפעלה של שני אטמי PDMS על/כיבוי שסתומים18. שיטה זו מאפשרת לעבד מספר מוגבל של חלקיקים או לרכז מספר רב של חלקיקים קטנים. תנאי הפעלה כגון עוצמת קצב הזרימה ולחץ אוויר דחוס יכולים למנוע נזק לא רצוי לתאים ולהגביר את יעילות לכידת התאים.

Protocol

1. תכנון הפלטפורמה המיקרופלואידית לריכוז חלקיקים

  1. תכננו את הפלטפורמה המיקרופלואידית הפנאומטית המורכבת משסתום פנאומטי אחד לזרימת נוזלים ברשת הזרימה התלת-ממדית ושלושה שסתומים פנאומטיים עבור מסננת (Vs), נוזל (Vf) ותפעול שסתום חלקיקים (Vp) (איור 1).
    הערה: לעומת בלוקים מרכזים חלקיקים מהנוזל, ו-Vf ו-Vp מאפשרים לנוזל ולחלקיקים להשתחרר לאחר הריכוז. שלוש יציאות פנאומטיות מספקות אוויר דחוס משכבת האספקה הנוזלית/פנאומטית (הפתוחה בדרך כלל) ומשקע האור של השסתום הפנאומטי להפעלת השסתום. רשת הערוצים המיקרופלואידית מתוכננת עם תוכנית CAD18,19.
  2. תכננו את הערוץ כך שיהיה שכבת אספקה פנאומטית ושכבת רשת ערוץ תלת-ממדית (איור 2).
    הערה: רשת הנוזלים מחוברת לתעלות המעוקלות בחלק הקדמי ולתא המלבני באזור האחורי. Vs לחסום את הכניסה, וחלקיקים מצטברים באזור האיסוף של תעלת הנוזל המעוקלת. נוזלים נטולי חלקיקים (נוזלים נטולי חלקיקים) יוצאים דרך שקע ה-Qf והחלקיקים המרוכזים דרך שקע ה-Qp (איור 3).
  3. על פי התנאים לעיל, להכין ארבעה סוגים של תבניות SU-8.
    הערה: ארבע התבניות כוללות תבנית המאפשרת לשלוט בשסתום באמצעות פנאומטיקה, שתי תבניות היוצרות תעלות נוזל ותבנית נקייה ללא צורה (איור 4 וטבלה 1). ארבעת סוגי התבניות המוזכרות מיוצרים באמצעות תהליכי פוטוליטוגרפיה סטנדרטיים. ייצור תבנית זה מורכב מתבנית SU-8 על פרוסת סיליקון לפי דוחות שפורסמו בעבר18,19. איור 5 מתאר את שבב המכשיר.

2. ייצור הפלטפורמה המיקרופלואידית לריכוז החלקיקים

הערה: איור 6 ממחיש את הייצור של פלטפורמה מיקרופלואידית שמרכזת חלקיקים.

  1. שכפל את שכבת ה- PDMS באמצעות תבנית SU-8 של תעלת שסתום פנאומטית מוכנה (שלב 1.3) לשליטה פנאומטית בשסתום.
    1. יוצקים 10 מ"ל של PDMS נוזלי ו-1 מ"ל של חומר מרפא (ראו טבלת חומרים) לתבנית תעלת שסתומים פנאומטית מוכנה (שלב 1.3) והפעלת חום ב-90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. לאחר ריפוי מבני PDMS, הפרד את תבנית SU-8 של שלב 2.1.1.
    3. נקב שלוש יציאות פנאומטיות בקוטר 1.5 מ"מ (Vs, Vf ו-Vp) לתעלת השסתומים הפנאומטית המיוצרת בהתאם לשלב 2.1.2 באמצעות נקב של 1.5 מ"מ (ראו טבלת חומרים).
    4. יוצקים 10 מ"ל של PDMS נוזלי ו-1 מ"ל של חומר מרפא לתבנית SU-8 נקייה מוכנה שהוכנה בשלב 1.3 וציפוי ספין ב-1,500 סל"ד למשך 15 שניות באמצעות מעיל ספין (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן הפעלת חום בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    5. לאחר ריפוי מבני PDMS, הפרד את תבנית SU-8 של שלב 2.1.4.
      הערה: שכבת הסרעפת של השסתום שולטת בזרימת הנוזלים בהתאם ללחץ הפנאומטי.
    6. לטפל בפלזמה אטמוספרית (ראה טבלת חומרים) במבני PDMS שהוכנו בשלבים 2.1.3 ו- 2.1.5 במשך 20 שניות.
    7. יישור מבני PDMS שטופלו ישירות בפלזמה משלב 2.1.6 בהתאם למבנה התעלה על ידי בדיקה באמצעות מיקרוסקופ.
    8. קשרו את מבני ה-PDMS המיושרים שהוכנו בשלב 2.1.7 על ידי חימום בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    9. נקב חור בקוטר 1.5 מ"מ בכניסת תעלת הנוזל (Qfp) ובשקעי תעלת הנוזל (Qf ו-Qp) בתוך חלק התעלה הפנאומטי שאליו נקשרת שכבת הסרעפת הדקה, באמצעות ניקוב של 1.5 מ"מ.
  2. שכפל את שני הצדדים של שכבת PDMS באמצעות שתי תבניות SU-8 כדי ליצור תעלה מיקרופלואידית. השתמש בתבנית תעלה מיקרופלואידית מעוקלת ומלבנית בחזית ובתבנית תעלת חיבור מיקרופלואידית מאחור.
    1. יוצקים 10 מ"ל של PDMS נוזלי ו-1 מ"ל של חומר מרפא לתבנית התעלה המיקרופלואידית המעוקלת והמלבנית וציפוי הספין ב-1,200 סל"ד למשך 15 שניות. לאחר מכן צרו תבניות לתא הנוזל המעוקל ולתעלות הנוזלים על ידי הפעלה תרמית בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (איור 6A).
    2. הפרד את שכבת ה-PDMS שעליה נוצרת התעלה המיקרופלואידית, ולאחר מכן צור תבנית המופעלת באמצעות חום המכסה את דופן האוורור האטומה על-ידי היצמדות לוופל הזכוכית על-ידי טיפול בפלזמה אטמוספרית במשך 20 שניות (איור 6B).
    3. מוזגים 3 מ"ל של PDMS נוזלי לתעלת החיבור של תבנית SU-8 (איור 6C).
    4. סדרו את המבנה שיוצר בשלב 2.2.2 עם תבנית תעלת החיבור ב-PDMS נוזלי בתבנית תעלת החיבור המיקרופלואידית, ויבשו את המבנה העל-קרקעי ב-130 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (איור 6D).
      הערה: בעת ריפוי המבנה האחורי, תבנית ה-PDMS שיוצרה בשלב 2.2.2 מנופחת על-ידי הלחץ התרמי של שכבת האוויר, ושכבת ה-PDMS המעוותת מופעלת תרמית (איור 6E)16.
    5. לאחר הריפוי, הסירו את תבנית ה-SU-8 הקדמית משכבת הרשת של התעלה המיקרופלואידית וקילפו בזהירות את תבנית ה-PDMS האחורית (איור 6F).
      הערה: שכבת הרשת הנוזלית התלת-ממדית מאפשרת יצירת תא נוזל מעוקל קדמי ותעלות מיקרופלואידיות.
    6. יוצקים 10 מ"ל של PDMS נוזלי ו-1 מ"ל של חומר ריפוי לתבנית SU-8 נקייה. לאחר מכן הפעלת חום בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    7. לאחר ריפוי מבני PDMS, הפרד את תבנית SU-8.
      הערה: שלב זה יוצר את שכבת האיטום הנוספת.
    8. טפלו בפלזמה האטמוספרית למבני PDMS שהוכנו בשלבים 2.2.3 ו-2.2.7 במשך 20 שניות.
    9. יישור מבני PDMS שטופלו ישירות בפלזמה בהתאם למבנה התעלה על ידי בדיקה עם מיקרוסקופ.
    10. קשרו את מבני ה-PDMS המיושרים על ידי חימום בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. יישרו את מבני ה-PDMS שהוכנו בשלבים 2.1 ו-2.2 בהתאם למבנה התעלה וקשרו אותם על ידי טיפול בפלזמה אטמוספרית במשך 20 שניות.

3. הגדרת המכשיר

הערה: איור 7 מראה ייצור של פלטפורמה מיקרופלואידית המרכזת חלקיקים.

  1. מלאו באופן ידני את התעלה המיקרופלואידית במים נטולי בועות ללא בועות באמצעות מזרק של 10 מ"ל.
  2. כדי לשלוט P_Qfp ובשלושת השסתומים הפנאומטיים (P_Vs, P_Vf P_Vp) השולטים בזרימת המיקרובד, הכנס בקר לחץ מדויק עם ארבעה ערוצי יציאה או יותר (ראו טבלת חומרים) עבור נוזל העבודה (Qfp) לפלטפורמה המיקרופלואידית.
    הערה: ניתן להחליף בקר לחץ מדויק עם ארבעה ערוצי יציאה בבקרי לחץ מדויקים מרובים. בניסוי זה, לחץ הפעולה של P_Qfp היה 10 kPa, P_Vs היה 15 kPa, ו-P_Vf ו-P_Vp היו שניהם 18 kPa (איור 8 וטבלה 2). איור 8 מראה את קצב זרימת הנוזלים העובדים לאורך זמן כאשר החלקיקים מרוכזים על ידי הפלטפורמה המיקרופלואידית עם P_Vs של 15 kPa, וטבלה 2 מציגה את תוצאות ההפעלה בהתאם לשסתומים הפנאומטיים.
  3. הכינו חלקיקי בדיקה של קרבוקסיל פוליסטירן בגדלים שונים במים מזוקקים (ראו טבלת חומרים).
    הערה: גדלי החלקיקים ששימשו בניסוי זה היו 24.9, 8.49 ו-4.16 מיקרומטר; ניתן להשתמש בחלקיקים בגדלים שונים בהתאם ללחץ של P_Vs.
  4. כדי לשלוט בקצב הזרימה של נוזל העבודה, מלאו בקבוק זכוכית חצי מלא במים (נוזל עבודה) וחברו את פקק בקבוק הזכוכית לתעלת היציאה של הבקר ולמיקרו-וואלה.
    הערה: חבר צינור אחד למיקרו-גלגל כדי לקבל אוויר דחוס מהבקר ומהצינור השני כדי להזריק מים.
  5. צפו בפעולת הפלטפורמה באמצעות מיקרוסקופ הפוך עבור כל פעולות הפלטפורמה ומדדו את קצב זרימת הפעולה לאורך זמן ביציאה על ידי מד זרימה נוזלי (ראו טבלת חומרים).

4. הפעלת המכשיר

  1. הזריקו את תערובת החלקיקים/נוזל בלחץ בכניסה (Qfp) עם Vp (איור 9A).
    הערה: זרימת החלקיקים והנוזל הנקי מהשקע דרך הערוצים המחוברים זה לזה נשלטים באמצעות Vp ו- Vf, בהתאמה (טבלה 2).
  2. הפעילו לחץ על Vs ב-15 kPa ו-Vp ב-18 kPa כדי להפעיל את השסתום.
    הערה: בשלב זה, הסרעפת מעוותת, החלקיקים של הנוזל Qfp חסומים במרחב המגע בין תעלת הנוזל המעוקלת לבין קנטילבר הנוזל המעוקל, והנוזל הלא רצוי Qfp משתחרר דרך ה-Qf הפתוח (איור 9B,C).
  3. כאשר החלקיקים מרוכזים, הפעילו לחץ רק על Vf.
    הערה: בשלב זה, כאשר הלחץ מופעל רק על Vf, החלקיקים הסתומים משתחררים דרך Qp (איור 9D).

תוצאות

איור 8 מציג את קצב הזרימה של קצבי הנוזלים עבור פעולת פלטפורמה בת ארבעה שלבים, כפי שצוין בטבלה 2. השלב הראשון הוא מצב הטעינה (מצב). הפלטפורמה סופקה לנוזל כאשר כל השסתומים פתוחים, ונוזל העבודה (Qf) והחלקיקים (Qp) כמעט זהים מכיוון שרשת התעלות המיקרופלואידיות מציגה סימטריה ...

Discussion

פלטפורמה זו מספקת דרך פשוטה לטהר ולרכז חלקיקים בגדלים שונים. חלקיקים נצברים ומשוחררים באמצעות בקרת שסתומים פנאומטיים, ולא נצפתה סתימה מכיוון שאין מבנה פסיבי. באמצעות מכשיר זה מוצג ריכוז החלקיקים בשלושה גדלים. עם זאת, לחץ ההפעלה, הזמן הנדרש לריכוז והקצב עשויים להשתנות בהתאם לממדי המכשיר, ה...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (משרד המדע והתקשוב). (לא. NRF-2021R1A2C1011380).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mm punctureSelf procductionSelf procductionThis puncture was made by requesting a mold maker based on the Miltex® Biopsy Punch with Plunger (15110-15) product.
4 inch Silicon Wafer/SU-8 mold4science29-03573-014 inch (100) Ptype silicon wafer/SU-8 mold
Carboxyl Polystyrene Crosslinked Particle(24.9 μm)SpherotechCPX-200-10Concentrated bead sample1
Flow meterSensirionSLI-1000Flow measurement
High-speed cameraPhotronFASTCAM MiniObservation of concentration
Hot plateAs oneHI-1000heating plate for curing of liquid PDMS
KOVAX-SYRINGE 10 mL/SyringeKoreavaccine22G-10MLFill the microfluidic channel with bubble-free demineralized water.
Laboratory Conona treater/Atmospheric plasmaElectro-TechnicBD-20ACChip bonding/atmospheric plasma
Liquid polydimethylsiloxane, PDMSDow Corning Inc.Sylgard 184Components of chip
MicroscopeOlympusIX-81Observation of concentration
PEEK TubesSAINT-GOBAIN PPL CORP.AAD04103Inject or collect particles
Polystyrene Particle(4.16 μm)SpherotechPP-40-10Concentrated bead sample3
Polystyrene Particle(8.49 μm)SpherotechPP-100-10Concentrated bead sample2
Pressure controller/μfluconAMEDμfluconControl of air pressure
Spin coateriNexusACE-200spread the liquid PDMS on SU-8 mold

References

  1. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7107), 368-373 (2006).
  2. Desitter, I., et al. A new device for rapid isolation by size and characterization of rare circulating tumor cells. Anticancer Research. 31 (2), 427-441 (2011).
  3. Hayes, D. F., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clinical Cancer Research. 12 (14), 4218-4224 (2016).
  4. Choi, S., Park, J. K. Microfluidic system for dielectrophoretic separation based on a trapezoidal electrode array. Lab on a Chip. 5 (10), 1161-1167 (2005).
  5. Jung, Y., et al. Six-stage cascade paramagnetic mode magnetophoretic separation system for human blood samples. Biomedical Microdevices. 12 (4), 637-645 (2010).
  6. Li, P., et al. Acoustic separation of circulating tumor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 4970-4975 (2015).
  7. Lin, Y. H., Lee, G. B. Optically induced flow cytometry for continuous microparticle counting and sorting. Biosensors and Bioelectronics. 24 (4), 572-578 (2008).
  8. Gramotnev, D. K., et al. Thermal tweezers for surface manipulation with nanoscale resolution. Applied Physics Letters. 90 (5), 054108 (2007).
  9. Huang, L. R., et al. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. Science. 304 (5673), 987-990 (2004).
  10. Yin, D., et al. Multi-stage particle separation based on microstructure filtration and dielectrophoresis. Micromachines. 10 (2), 103 (2019).
  11. Yoon, Y., et al. Clogging-free microfluidics for continuous size-based separation of microparticles. Scientific Reports. 6 (1), 1-8 (2016).
  12. Alvankarian, J., Majlis, B. Y. Tunable microfluidic devices for hydrodynamic fractionation of cells and beads: a review. Sensors. 15 (11), 29685-29701 (2015).
  13. Irimia, D., Toner, M. Cell handling using microstructured membranes. Lab on a Chip. 6 (3), 345-352 (2006).
  14. Huang, S. B., et al. A tunable micro filter modulated by pneumatic pressure for cell separation. Sensors and Actuators B: Chemical. 142 (1), 389-399 (2009).
  15. Chang, Y. H., et al. A tunable microfluidic-based filter modulated by pneumatic pressure for separation of blood cells. Microfluidics and Nanofluidics. 12 (1-4), 85-94 (2012).
  16. Oh, C. K., et al. Fabrication of pneumatic valves with spherical dome-shape fluid chambers. Microfluidics and Nanofluidics. 19 (5), 1091-1099 (2015).
  17. Liu, W., et al. Dynamic trapping and high-throughput patterning of cells using pneumatic microstructures in an integrated microfluidic device. Lab on a Chip. 12 (9), 1702-1709 (2012).
  18. Jang, J. H., Jeong, O. C. Fabrication of a pneumatic microparticle concentrator. Micromachines. 11 (1), 40 (2020).
  19. McDonald, J. C., et al. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic device. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
  20. Brivio, M., et al. A MALDI-chip integrated system with a monitoring window. Lab on a Chip. 5 (4), 378-381 (2005).
  21. Jeong, O. C., Konishi, S. The self-generated peristaltic motion of cascaded pneumatic actuators for micro pumps. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (8), 085017 (2008).
  22. Taff, B. M., Voldman, J. A scalable addressable positive dielectrophoretic cell-sorting array. Analytical Chemistry. 77 (24), 7976-7983 (2005).
  23. Pamme, N., et al. On-chip free-flow magnetophoresis: Separation and detection of mixtures of magnetic particles in continuous flow. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 307 (2), 237-244 (2006).
  24. Harris, N. R., et al. Performance of a micro-engineered ultrasonic particle manipulator. Sensors and Actuators B: Chemical. 111, 481-486 (2005).
  25. Yoon, Y., et al. Clogging-free microfluidics for continuous size-based separation of microparticles. Scientific Reports. 6 (1), 1-18 (2016).
  26. Beattie, W., et al. Clog-free cell filtration using resettable cell traps. Lab on a Chip. 14 (15), 2657-2665 (2014).
  27. Cheng, Y., et al. A bubble- and clogging-free microfluidic particle separation platform with multi-filtration. Lab on a Chip. 16 (23), 4517-4526 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved