JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תרגום ריבוזומים מפענח שלושה נוקלאוטידים לכל קודון לפפטידים. תנועתם לאורך mRNA, שנתפסה על ידי פרופיל ריבוזום, מייצרת את העקבות המציגות תקופת שלישייה אופיינית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש RiboCode כדי לפענח תכונה בולטת זו מנתוני פרופיל ריבוזום כדי לזהות מסגרות קריאה פתוחות בתרגום פעיל ברמת התמלול המלא.

Abstract

זיהוי של מסגרות קריאה פתוחות (ORFs), במיוחד אלה קידוד פפטידים קטנים ותרגום פעיל תחת הקשרים פיזיולוגיים ספציפיים, הוא קריטי לביאורים מקיפים של תרגומים תלויי הקשר. פרופיל ריבוזום, טכניקה לזיהוי מיקומים וצפיפות מחייבים של תרגום ריבוזומים ב- RNA, מציע שדרה לגלות במהירות היכן מתרחש תרגום בקנה מידה רחב של הגנום. עם זאת, זה לא משימה טריוויאלית בביואינפורמטיקה לזהות ביעילות ובאופן מקיף את ORFs תרגום עבור פרופיל ריבוזום. מתואר כאן היא חבילה קלה לשימוש, בשם RiboCode, שנועדה לחפש תרגום פעיל ORFs בכל גודל מאותות מעוותים ודו-משמעיים בנתוני פרופיל ריבוזום. אם ניקח את ערכת הנתונים שפורסמה בעבר כדוגמה, מאמר זה מספק הוראות שלב אחר שלב עבור צינור RiboCode כולו, מעיבוד מראש של הנתונים הגולמיים ועד לפרשנות של קבצי תוצאות הפלט הסופיים. יתר על כן, להערכת שיעורי התרגום של ORFs המובאים, הליכים להדמיה וכימות של צפיפות ריבוזום על כל ORF מתוארים גם בפירוט. לסיכום, המאמר הנוכחי הוא הוראה שימושית ומתוזמנת לתחומי המחקר הקשורים לתרגום, ORFs קטנים ופפטידים.

Introduction

לאחרונה, גוף גדל והולך של מחקרים חשף ייצור נרחב של פפטידים שתורגמו מ ORFs של גנים קידוד ואת הגנים ביאורים בעבר כמו noncoding, כגון ארוך noncoding RNAs (lncRNAs)1,2,2,3,4,5,6,7,8. ORFs מתורגמים אלה מוסדרים או מושרים על ידי תאים כדי להגיב לשינויים סביבתיים, מתח, ובידול תאים1,8,9,10,11,12,13. מוצרי התרגום של כמה ORFs הוכחו לשחק תפקידים רגולטוריים חשובים בתהליכים ביולוגיים מגוונים בפיתוח ופיזיולוגיה. לדוגמה, Chng et al.14 גילה הורמון פפטיד בשם Elabela (אלה, הידוע גם בשם Apela / Ende / פעוט), אשר קריטי להתפתחות הלב וכלי הדם. פאולי ואח ' הציע כי אלה פועלת גם כמיטוגן המקדם נדידת תאים בעובר הדגים המוקדם15. Magny et al. דיווח על שני micropeptides של פחות מ 30 חומצות אמינו ויסות הובלת סידן ומשפיע על התכווצות שרירים רגילה בלב Drosophila10.

עדיין לא ברור כמה פפטידים כאלה מקודדים על ידי הגנום והאם הם רלוונטיים ביולוגית. לכן, זיהוי שיטתי של ORFs אלה קידוד פוטנציאלי רצוי מאוד. עם זאת, קביעה ישירה של המוצרים של ORFs אלה (כלומר, חלבון או פפטיד) באמצעות גישות מסורתיות כגון שימור אבולוציוני16,17 וספקטרומטריית מסה18,19 היא מאתגרת מכיוון שיעילות הזיהוי של שתי הגישות תלויה באורך, בשפע ובהרכב חומצות האמינו של החלבונים או הפפטידים המיוצרים. הופעתו של פרופיל ריבוזום, טכניקה לזיהוי התפוסה ריבוזום על mRNAs ברזולוציה נוקלאוטיד, סיפקה דרך מדויקת להעריך את פוטנציאל הקידוד של תמלילים שונים3,20,21, ללא קשר לאורכם ולהרכבם. תכונה חשובה ומשמשת לעתים קרובות לזיהוי תרגום פעיל של ORFs באמצעות פרופיל ריבוזום היא תקופת שלושת הנוקלאוטידים (3-nt) של עקבות הריבוזום על mRNA מהקודון ההתחלה ועד קודון העצירה. עם זאת, נתוני פרופיל ריבוזום לעתים קרובות יש מספר בעיות, כולל קריאות רצף נמוכות ודלילות לאורך ORFs, רעש רצף גבוה, וזיהומי RNA ריבוזומי (rRNA). לפיכך, האותות המעוותים והדו-משמעיים הנוצרים על ידי נתונים כאלה מחלישים את דפוסי התקופתיות של 3-nt של עקבות הריבוזומים על mRNA, מה שבסופו של דבר מקשה על זיהוי ה- ORFs המתורגמים בביטחון גבוה.

חבילה בשם "RiboCode" התאימה מבחן כיתה חתום וילקוקסון שונה ואסטרטגיית אינטגרציה P-ערך כדי לבחון אם ORF יש באופן משמעותי יותר בתוך מסגרת שברים מוגנים ריבוזום (RPFs) מאשר מחוץ למסגרת RPFs22. הוא הוכח כיעיל ביותר, רגיש ומדויק לביאור דה נובו של התרגום בנתוני פרופיל ריבוזום מדומים ואמיתיים. כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בכלי זה כדי לזהות את ORFs התרגום הפוטנציאלי מתוך ערכות נתונים רצף פרופיל ריבוזום גלם שנוצר על ידי המחקר הקודם23. ערכות נתונים אלה שימשו כדי לחקור את הפונקציה של יחידת המשנה EIF3 "E" (EIF3E) בתרגום על ידי השוואת פרופילי תפוסת הריבוזום של תאי MCF-10A שהודבקו בבקרה (si-Ctrl) ו- EIF3E (si-eIF3e) RNAs קטנים מפריעים (siRNAs). על ידי החלת RiboCode על ערכות נתונים לדוגמה אלה, זיהינו 5,633 ORFs רומן פוטנציאל קידוד פפטידים קטנים או חלבונים. ORFs אלה סווגו לסוגים שונים בהתבסס על מיקומם ביחס לאזורי הקידוד, כולל ORFs במעלה הזרם (uORFs), ORFs במורד הזרם (dORFs), ORFs חופפים, ORFs מגנים חדשניים לקידוד חלבונים (PCGs חדשניים), ו- ORFs מ קידוד nonprotein חדשני (גנים חדשניים NonPCGs). צפיפות הקריאה של RPF על UORFs גדלה באופן משמעותי בתאים לקויי EIF3E בהשוואה לתאי בקרה, אשר עשויים להיגרם לפחות באופן חלקי על ידי העשרה של ריבוזומים תרגום פעיל. הצטברות ריבוזום מקומית באזור מן הקודון ה - 25 עד ה - 75 של תאים לקוי EIF3E הצביע על חסימה של התארכות התרגום בשלב המוקדם. פרוטוקול זה גם מראה כיצד לדמיין את צפיפות ה- RPF של האזור הרצוי לבחינת דפוסי המחזור של 3 nt של עקבות ריבוזום על ORFs מזוהים. ניתוחים אלה מדגימים את התפקיד החזק של RiboCode בזיהוי תרגום ORFs וללמוד את הרגולציה של תרגום.

Protocol

1. הגדרת סביבה והתקנת RiboCode

  1. פתח חלון מסוף לינוקס וצור סביבת קונדה:
    conda create -n RiboCode python=3.8
  2. עבור לסביבה שנוצרה והתקן את RiboCode ואת יחסי התלות:
    קונדה להפעיל RiboCode
    conda install -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt עניבת פרפר כוכב samtools

2. הכנת נתונים

  1. קבל קבצי התייחסות לגנום.
    1. לקבלת רצף העיון, עבור אל אתר האינטרנט של אנסמבל https://www.ensembl.org/index.html, לחץ על התפריט העליון הורד והורדת FTP בתפריט הימני. בטבלה המוצגת, לחץ על FASTA בעמודה DNA (FASTA) ובשורה שבה מינים הם בני אדם. בדף הפתוח, העתק את הקישור של Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz, ולאחר מכן להוריד ולפתוח אותו במסוף:
      wget -c \
      http://ftp.ensembl.org/pub/release-104/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
      gzip -d Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly. פא.gz
    2. לקבלת ביאור לעיון, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על GTF בעמודה ערכת הגנים בדף האינטרנט שנפתח לאחרונה. העתק את הקישור של Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf.gz והורד אותו באמצעות:
      wget -c \
      http://ftp.ensembl.org/pub/release-104/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.104.gtf.gz
      gzip -d Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf.gz
      הערה: מומלץ לקבל את קובץ ה- GTF מאתר האינטרנט של האנסמבל מכיוון שהוא מכיל ביאורי גנום המאורגנים בהיררכיה תלת-שכבתית, כלומר, כל גן מכיל תמלילים המכילים אקסונים ותרגומים אופציונליים (לדוגמה, רצפי קידוד [CDS], אתר התחלת התרגום, אתר סיום התרגום). כאשר ביאורים של גן או תעתיק חסרים, לדוגמה, קובץ GTF המתקבל מ- UCSC או NCBI, השתמש ב - GTFupdate כדי ליצור GTF מעודכן עם ביאורי הירארכיית אב-צאצא מלאים: GTFupdate original.gtf > מעודכן.gtf. עבור קובץ הביאור בתבנית .gff, השתמש בערכת הכלים AGAT24 או בכל כלי אחר כדי להמיר לתבנית .gtf.
  2. קבל רצפי rRNA.
    1. פתח את דפדפן הגנום של UCSC https://genome.ucsc.edu ולחץ על כלים | דפדפן טבלה ברשימה הנפתחת.
    2. בדף הפתוח, ציין יונק עבור clade, אדם עבור גנום, כל הטבלאות לקבוצה, rmask עבור שולחן, וגנום עבור אזור. עבור סינון, לחץ על צור כדי לעבור לדף חדש ולהגדיר repClass כפי שהוא תואם rRNA.
    3. לחץ על שלח ולאחר מכן הגדר את תבנית הפלט לרצף ולשם קובץ פלט כ- hg38_rRNA.fa. לבסוף, לחץ על קבל פלט | קבל רצף כדי לאחזר את רצף rRNA.
  3. קבל ערכות נתונים ליצירת פרופיל ריבוזום מארכיון קריאת רצף (SRA).
    1. הורד את דגימות לשכפל של si-eIF3e קבוצת טיפול ולשנות את שמם:
      fastq-dump SRR9047190 SRR9047191 SRR9047192
      mv SRR9047190.fastq si-eIF3e-1.fastq
      mv SRR9047191.fastq si-eIF3e-2.fastq
      mv SRR9047192.fastq si-eIF3e-3.fastq
    2. הורד את הדוגמאות המשוכפלות של קבוצת הבקרה ושנה את שמן:
      fastq-dump SRR9047193 SRR9047194 SRR9047195
      mv SRR9047193.fastq si-Ctrl-1.fastq
      mv SRR9047194.fastq si-Ctrl-2.fastq
      mv SRR9047195.fastq si-Ctrl-3.fastq
      הערה: מזהי הגישה של SRA עבור ערכות נתונים לדוגמה אלה התקבלו מאתר האינטרנט של Gene Expression Omnibus (GEO)25 על-ידי חיפוש GSE131074.

3. לקצץ מתאמים ולהסיר זיהום rRNA

  1. (אופציונלי) הסר מתאמים מנתוני הרצף. דלג על שלב זה אם רצפי המתאמים כבר נחתכו, כמו במקרה זה. אחרת, השתמש ב - cutadapt כדי לחתוך את המתאמים מקריאות.
    for i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
    לעשות
    cutadapt -m 15 --match-read-תווים כלליים -a CTGTAGGCACCATCAAT \
    -o ${i}_trimmed.fastq ${i}.fastq
    לעשות
    הערה: רצף המתאם לאחר -פרמטר ישתנה בהתאם להכנת ספריית cDNA. קריאות קצרות מ- 15 (ניתנות על-ידי -m) נמחקות מכיוון שהקטעים המוגנים באמצעות ריבוזום בדרך כלל ארוכים יותר מגודל זה.
  2. הסר זיהום rRNA באמצעות השלבים הבאים:
    1. רצפי הפניות rRNA אינדקס:
      עניבת פרפר-build -f hg38_rRNA.fa hg38_rRNA
    2. יישר את הקריאות להפניה ל- rRNA כדי לשלול את הקריאות שמקורן ב- rRNA:
      for i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
      לעשות
      עניבת פרפר -n 0 -y -a -a --norc --best --layerta -S -p 4 -l 15 \
      --un=./${i}_noncontam.fastq hg38_rRNA -q ${i}.fastq ${i}.aln
      לעשות
      -p מציין את מספר הליכי המשנה להפעלת הפעילויות במקביל. בהתחשב בגודל הקטן יחסית של קריאות RPF, יש לציין ארגומנטים אחרים (לדוגמה, -n, -y, -a, -norc, --best, --layerta ו- -l) כדי להבטיח שהיישורים המדווחים הם הטובים ביותר. לפרטים נוספים, עיינו באתר האינטרנט של Bowtie26.

4. יישר את הקריאות הנקיות לגנום

  1. צור אינדקס גנום.
    mkdir STAR_hg38_genome
    STAR --runThreadN 8 --runMode genomeGenerate --genomeDir ./STAR_hg38_genome --genomeFastaFiles Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf
  2. ישר את הקריאות הנקיות (ללא זיהום rRNA) להפניה שנוצרה.
    for i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
    לעשות
    STAR --runThreadN 8 --outFilterType Normal --outWigType להתנועע --outWigStrand Stranded --outWigNorm RPM --outFilterMismatchNmax 1 --outFilterMultimapNmax 1 --genomeDir STAR_hg38_genome --readFilesIn ${i}_noncontam.fastq --outFileNamePrefix ${i}. --outSAMtype BAM SortedByCoordinate --quantMode TranscriptomeSAM GeneCounts --outSAMattributes All
    לעשות
    הערה: נוקלאוטיד לא מנוטרל מתווסף לעתים קרובות לסוף 5' של כל קריאה על ידי התמלול ההפוך27, אשר ייחתך ביעילות על ידי STAR כפי שהוא מבצע גזירה רכה כברירת מחדל. הפרמטרים עבור STAR מתוארים במדריך STAR28.
  3. מיון ויישור אינדקס של קבצים.
    for i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
    לעשות
    samtools sort -T ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.sorted \
    -o ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.sorted.bam \
    ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.bam
    samtools index ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.sorted.bam
    samtools index ${i}. Aligned.sortedByCoord.out.bam
    לעשות

5. בחירת גודל של RPFs וזיהוי של אתרי P שלהם

  1. הכן את ביאורי התמליל.
    prepare_transcripts -g Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf \
    Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa -o RiboCode_annot
    הערה: פקודה זו אוספת מידע נדרש של תמלילי mRNA מקובץ GTF ומחלצת את הרצפים עבור כל תמלילי ה- mRNA מקובץ FASTA (כל תעתיק מורכב על ידי מיזוג האקסונים בהתאם למבנים המוגדרים בקובץ GTF).
  2. בחר קובצי RPF באורכים ספציפיים וזיהה את מיקומי אתר ה- P שלהם.
    for i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
    לעשות
    metaplots -a RiboCode_annot -r ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.bam \
    -o ${i} -f0_percent 0.35 -pv1 0.001 -pv2 0.001
    לעשות
    הערה: פקודה זו מתווה את הפרופילים המצטברים של סוף 5' של הקריאות המיושרות של כל אורך סביב קודונים של התחלה (או עצירה) של תרגום מובא. ניתן לקבוע ידנית את אתר P התלוי באורך הקריאה על-ידי בחינת חלקות ההפצה (לדוגמה, איור 1B) של מרחקי היסט בין קצות 5' של הקריאות העיקריות לבין קודון ההתחלה. RiboCode גם יוצר קובץ תצורה עבור כל מדגם, שבו מיקומי אתר P של קריאות המציגות דפוסי מחזור משמעותיים של 3-nt נקבעים באופן אוטומטי. הפרמטרים -f0_percent, -pv1 ו- -pv2 מגדירים את סף הפרופורציות ואת הקיצוצים של ערך p לבחירת קריאות RPF מועשרות במסגרת הקריאה. בדוגמה זו, הנוקלאוטידים +12, +13 ו - +13 מסוף 5' של הקריאות 29, 30 ו - 31 nt מוגדרים באופן ידני בכל קובץ תצורה.
  3. עריכת קבצי התצורה עבור כל דוגמה ומיזוגם
    הערה: כדי ליצור ערכת קונצנזוס של ORFs ייחודיים ולהבטיח כיסוי מספיק של קריאות כדי לבצע ניתוח עוקב, הקריאות שנבחרו של כל הדגימות בשלב הקודם ממוזגות. הקריאות באורכים ספציפיים המוגדרים בקובץ merged_config.txt (קובץ משלים 1) ופרטי אתר ה- P שלהם משמשים להערכת פוטנציאל התרגום של ORFs בשלב הבא.

6. דה נובו ביאור תרגום ORFs

  1. תריץ את ריבו-קוד.
    RiboCode -a RiboCode_annot -c merged_config.txt -l yes -g \
    -o RiboCode_ORFs_result -s ATG -m 5 -A CTG,GTG,TTG
    כאשר הפרמטרים החשובים של פקודה זו הם כדלקמן:
    -c, קובץ תצורה המכיל את הנתיב של קבצי קלט ואת המידע של קריאות נבחרות ואתרי P שלהם.
    -l, עבור תמלילים שיש להם קודוני התחלה מרובים במעלה הזרם של קודוני העצירה, בין אם ORFs הארוך ביותר (האזור מקודון ההתחלה הדיסטלי ביותר לעצור קודון) משמשים להערכת פוטנציאל התרגום שלהם. אם מוגדר לא, הקודונים ההתחלתיים ייקבעו באופן אוטומטי.
    -s, קודוני ההתחלה הקנוניים המשמשים לזיהוי ORFs.
    -A, (אופציונלית) קודוני ההתחלה הלא קנוניים (למשל, CTG, GTG ו- TTG עבור אדם) המשמשים לזיהוי ORF, אשר עשויים להיות שונים במיטוכונדריה או בגרעין של מינים אחרים29.
    -m, האורך המינימלי (כלומר, חומצות אמינו) של ORFs.
    -o, הקידומת של שם קובץ פלט המכילה את הפרטים של ORFs חזוי (קובץ משלים 2).
    -g ו - -b, פלט ORFs החזוי לפורמט GTF או מיטה , בהתאמה.

7. (אופציונלי) כימות וסטטיסטיקה של ORF

  1. ספירת קריאות RPF בכל ORF.
    for i in si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
    לעשות
    ORFcount -g RiboCode_ORFs_result_collapsed.gtf \
    -r ${i}. Aligned.sortedByCoord.out.bam -f 15 -l 5 -m 25 -M 35 \
    -o ${i}_ORF.counts -s yes -c junction-strict
    לעשות
    הערה: כדי לא לכלול את הריבוזומים המצטברים הפוטנציאליים סביב ההתחלה והקצוות של ORFs, מספר הקריאות שהוקצו ב- 15 הראשונים (שצוינו על-ידי -f) ובחמשת הקודונים האחרונים (ספציפיים על-ידי -l) אינם נספרים. באופן אופציונלי, האורכים של RPFs שנספרו מוגבלים לטווח שבין 25 ל - 35 nt (גדלים נפוצים של RPFs).
  2. חשב סטטיסטיקה בסיסית של ORFs שזוהו באמצעות RiboCode:
    Rscript RiboCode_utils. R
    הערה: RiboCode_utils. R (קובץ משלים 3) מספק סדרה של סטטיסטיקות עבור פלט RiboCode, למשל, ספירת מספר ORFs מזוהה, הצגת ההתפלגות של אורכי ORF וחישוב צפיפות RPF מנורמלת (כלומר, RPKM, קורא לכל קילו בסיס למיליון קריאות ממופות).

8. (אופציונלי) תצוגה חזותית של ORFs החזוי

  1. להשיג את העמדות היחסיות של ההתחלה ולעצור קודונים עבור ORF הרצוי (למשל, ENSG00000100902_35292349_35292552_67) על התמליל שלה מ RiboCode_ORFs_result_collapsed.txt (קובץ משלים 3). לאחר מכן, התווה את הצפיפות של קריאות RPF ב- ORF:
    plot_orf_density -a RiboCode_annot -c merged_config.txt -t ENST00000622405 \
    -s 33 -e 236 --start-codon ATG -o ENSG00000100902_35292349_35292552_67
    כאשר -s ו - -e מציינים את מיקום ההתחלה והעצירה של התרגום של התוויית ORF. --start-codon מגדיר את קודון ההתחלה של ORF, שיופיע בכותרת הדמות. -o מגדיר את הקידומת של שם קובץ הפלט.

9. (אופציונלי) ניתוח Metagene באמצעות RiboMiner

הערה: בצע את ניתוח metagene כדי להעריך את ההשפעה של נוקאאוט EIF3E על התרגום של ORFs מוטבע זוהה, בעקבות השלבים הבאים:

  1. צור תעתיקים של ביאורים עבור RiboMiner, אשר מחלץ את התמליל הארוך ביותר עבור כל גן בהתבסס על קובץ הביאור שנוצר על ידי RiboCode (שלב 5.1).
    OutputTranscriptInfo -c RiboCode_annot/transcripts_cds.txt \
    ג'י Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf -f RiboCode_annot/transcripts_sequence.fa \
    -o longest.transcripts.info.txt -O all.transcripts.info.txt
  2. הכן את קובץ התצורה עבור RiboMiner. העתק את קובץ התצורה שנוצר על-ידי הפקודה metaplots של RiboCode (שלב 5.4) ושנה את שמו ל-"RiboMiner_config.txt". לאחר מכן, שנה אותו בהתאם לתבנית המוצגת בקובץ משלים 4.
  3. מטאג'ן מנתחת באמצעות ריבומינר
    1. השתמש ב- MetageneAnalysis כדי ליצור פרופיל מצטבר וממוצע של צפיפות RPFs על פני תעתיקים.
      MetageneAnalysis -f RiboMiner_config.txt -c longest.transcripts.info.txt \
      -o MA_normed -U codon -M RPKM -u 100 -d 400 -l 100 -n 10 -m 1 -e 5 --norm yes \
      -y 100 --type UTR
      היכן נמצאים הפרמטרים החשובים: --type, ניתוח אזורי CDS או UTR ; -נורמה, אם נרמל את צפיפות הקריאה; -y, מספר הקודונים המשמשים לכל תעתיק; -U, צפיפות RPF להתוות או ברמת קודון או nt ; -u ו - -d, להגדיר את הטווח של ניתוח אזורים יחסית כדי להתחיל קודון או לעצור קודון; -l, האורך המינימלי (כלומר, מספר הקודונים) של CDS; -M, המצב לסינון תעתיקים, ספירות או RPKM; -n ספירות מינימליות או RPKM בתקליטורים לניתוח. -m ספירות מינימליות או RPKM של CDS באזור מנורמל; -e, מספר הקודונים שלא נכללו באזור המנורמל.
    2. צור קבוצה של קובצי PDF להשוואת תפוסות הריבוזום ב- mRNA בתאי בקרה ובתאים לקויי eIF3.
      PlotMetageneAnalysis -i MA_normed_dataframe.txt -o MA_normed \
      -g si-Ctrl,si-eIF3e -r si-Ctrl-1,si-Ctrl-2,si-Ctrl-3__si-eIF3e-1,si-eIF3e-2,si-eIF3e-3 -u 100 -d 400 --mode mean
      הערה: PlotMetageneAnalysis יוצר את ערכת קבצי PDF. פרטים על השימוש של MetageneAnalysis ו PlotMetageneאנליזה זמינים באתר האינטרנט של RiboMiner30.

תוצאות

ערכות הנתונים לדוגמה של יצירת פרופיל ריבוזום הופקדו במסד הנתונים של GEO תחת מספר הגישה GSE131074. כל הקבצים והקודים המשמשים בפרוטוקול זה זמינים מקבצים משלימים 1-4. על ידי החלת RiboCode על קבוצה של ערכות נתונים פרופיל ריבוזום שפורסם23, זיהינו את הרומן ORFs בתרגום ...

Discussion

פרופיל ריבוזום מציע הזדמנות חסרת תקדים ללמוד את פעולת הריבוזומים בתאים בקנה מידה של גנום. פענוח מדויק של המידע הנישאים על ידי נתוני פרופיל הריבוזום יכול לספק תובנה אילו אזורים של גנים או תמלילים מתורגמים באופן פעיל. פרוטוקול שלב אחר שלב זה מספק הדרכה כיצד להשתמש ב- RiboCode כדי לנתח נתוני פרופ...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצים להכיר בתמיכת המשאבים החישוביים המסופקים על ידי פלטפורמת HPCC של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג. Z.X. מודה תודה על תוכנית התמיכה בכישרונות טופנוץ' הצעירה של אוניברסיטת שיאן ג'יאוטונג.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
A computer/server running LinuxAny--
Anaconda or MinicondaAnaconda-Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
RR Foundation-https://www.r-project.org/
RstudioRstudio-https://www.rstudio.com/

References

  1. Eisenberg, A. R., et al. Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast. Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).
  2. Spealman, P., et al. Conserved non-AUG uORFs revealed by a novel regression analysis of ribosome profiling data. Genome Research. 28 (2), 214-222 (2018).
  3. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  4. Bazzini, A. A., et al. Identification of small ORFs in vertebrates using ribosome footprinting and evolutionary conservation. The EMBO Journal. 33 (9), 981-993 (2014).
  5. Ingolia, N. T., et al. Ribosome profiling reveals pervasive translation outside of annotated protein-coding genes. Cell Reports. 8 (5), 1365-1379 (2014).
  6. Chew, G. L., Pauli, A., Schier, A. F. Conservation of uORF repressiveness and sequence features in mouse, human and zebrafish. Nature Communications. 7, 11663 (2016).
  7. Zhang, H., et al. Determinants of genome-wide distribution and evolution of uORFs in eukaryotes. Nature Communications. 12 (1), 1076 (2021).
  8. Guenther, U. P., et al. The helicase Ded1p controls use of near-cognate translation initiation codons in 5' UTRs. Nature. 559 (7712), 130-134 (2018).
  9. Goldsmith, J., et al. Ribosome profiling reveals a functional role for autophagy in mRNA translational control. Communications Biology. 3 (1), 388 (2020).
  10. Magny, E. G., et al. Conserved regulation of cardiac calcium uptake by peptides encoded in small open reading frames. Science. 341 (6150), 1116-1120 (2013).
  11. Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Molecular Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
  12. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17394-17399 (2012).
  13. Andreev, D. E., et al. Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes. Genome Biology. 16, 90 (2015).
  14. Chng, S. C., Ho, L., Tian, J., Reversade, B. ELABELA: a hormone essential for heart development signals via the apelin receptor. Developmental Cell. 27 (6), 672-680 (2013).
  15. Pauli, A., et al. Toddler: an embryonic signal that promotes cell movement via Apelin receptors. Science. 343 (6172), 1248636 (2014).
  16. Stark, A., et al. Discovery of functional elements in 12 Drosophila genomes using evolutionary signatures. Nature. 450 (7167), 219-232 (2007).
  17. Lin, M. F., Jungreis, I., Kellis, M. PhyloCSF: a comparative genomics method to distinguish protein coding and non-coding regions. Bioinformatics. 27 (13), 275-282 (2011).
  18. Slavoff, S. A., et al. Peptidomic discovery of short open reading frame-encoded peptides in human cells. Nature Chemical Biology. 9 (1), 59-64 (2013).
  19. Schwaid, A. G., et al. Chemoproteomic discovery of cysteine-containing human short open reading frames. Journal of the American Chemical Society. 135 (45), 16750-16753 (2013).
  20. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. Genome-wide annotation and quantitation of translation by ribosome profiling. Current Protocols in Molecular Biology. , 1-19 (2013).
  21. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  22. Xiao, Z., et al. De novo annotation and characterization of the translatome with ribosome profiling data. Nucleic Acids Research. 46 (10), 61 (2018).
  23. Lin, Y., et al. eIF3 Associates with 80S Ribosomes to Promote Translation Elongation, Mitochondrial Homeostasis, and Muscle Health. Molecular Cell. 79 (4), 575-587 (2020).
  24. . AGAT: Another Gff Analysis Toolkit to handle annotations in any GTF/GFF format Available from: https://agat.readthedocs.io/en/latest/gff_to_gtf.html (2020)
  25. . Gene Expression Omnibus Available from: https://www.ncbi.nim.nih.gov/geo (2002)
  26. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  27. . STAR manual Available from: https://github.com/alexdobin/STAR/blob/master/doc/STARmanual.pdf (2022)
  28. . The genetic codes Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Utils/wprintgc.cgi (2019)
  29. . RiboMiner Available from: https://github.com/xryanglab/RiboMiner (2020)
  30. Ingolia, N. T., Hussmann, J. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling: global views of translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032698 (2018).
  31. Lee, S., et al. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  32. Gao, X., et al. Quantitative profiling of initiating ribosomes in vivo. Nature Methods. 12 (2), 147-153 (2015).
  33. Spealman, P., Naik, A., McManus, J. uORF-seqr: A Machine Learning-Based approach to the identification of upstream open reading frames in yeast. Methods in Molecular Biol. 2252, 313-329 (2021).
  34. . RiboCode Available from: https://github.com/xryanglab/RiboCode (2018)
  35. Sharma, P., Wu, J., Nilges, B. S., Leidel, S. A. Humans and other commonly used model organisms are resistant to cycloheximide-mediated biases in ribosome profiling experiments. Nature Communications. 12 (1), 5094 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

180mRNAuORFdORF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved