De novo Identificação de quadros de leitura abertos traduzidos ativamente com dados de perfil ribossomo

Resumo

Traduzindo ribossomos decodificam três nucleotídeos por codon em peptídeos. Seu movimento ao longo do mRNA, capturado pelo perfil ribossomo, produz as pegadas exibindo periodicidade trigêmea característica. Este protocolo descreve como usar o RiboCode para decifrar esse recurso proeminente de dados de criação de perfil ribossomos para identificar quadros de leitura abertos traduzidos ativamente no nível de transcriptome inteiro.

Resumo

A identificação de quadros de leitura aberto (ORFs), especialmente aqueles que codificam pequenos peptídeos e sendo ativamente traduzidos em contextos fisiológicos específicos, é fundamental para anotações abrangentes de translatomes dependentes do contexto. O perfil ribossomo, uma técnica para detectar os locais de ligação e densidades de tradução de ribossomos no RNA, oferece uma avenida para descobrir rapidamente onde a tradução está ocorrendo na escala de todo o genoma. No entanto, não é uma tarefa trivial na bioinformática identificar de forma eficiente e abrangente os ORFs de tradução para o perfil ribossomo. Descrito aqui é um pacote fácil de usar, chamado RiboCode, projetado para procurar traduzir ativamente ORFs de qualquer tamanho a partir de sinais distorcidos e ambíguos em dados de perfil ribossomos. Tomando nosso conjunto de dados publicado anteriormente como exemplo, este artigo fornece instruções passo a passo para todo o pipeline RiboCode, desde o pré-processamento dos dados brutos até a interpretação dos arquivos finais de resultado de saída. Além disso, para avaliar as taxas de tradução dos ORFs anotados, procedimentos de visualização e quantificação de densidades ribossósas em cada ORF também são descritos em detalhes. Em resumo, o presente artigo é uma instrução útil e oportuna para os campos de pesquisa relacionados à tradução, pequenos ORFs e peptídeos.

Introdução

Recentemente, um corpo crescente de estudos revelou a produção generalizada de peptídeos traduzidos de ORFs de genes codificadores e os genes anteriormente anotados como não codificação, como RNAs de não codificação longa (lncRNAs)1,2,3,4,5,6,7,8. Esses ORFs traduzidos são regulados ou induzidos por células a responder a mudanças ambientais, estresse e diferenciação celular1,8,9,10,11,12,13. Os produtos de tradução de alguns ORFs têm sido demonstrados para desempenhar importantes papéis regulatórios em diversos processos biológicos no desenvolvimento e fisiologia. Por exemplo, Chng et ^al.14 descobriram um hormônio peptídeo chamado Elabela (Ela, também conhecido como Apela/Ende/Toddler), que é fundamental para o desenvolvimento cardiovascular. Pauli et al. sugeriram que Ela também age como um mitogênio que promove a migração celular no embrião de peixes ^iniciais15. Magny et al. relataram dois micropeptídeos de menos de 30 aminoácidos regulando o transporte de cálcio e afetando a contração muscular regular no coração de ^Drosophila10.

Ainda não está claro quantos peptídeos desse tipo são codificados pelo genoma e se são biologicamente relevantes. Portanto, a identificação sistemática desses ORFs potencialmente codificadores é altamente desejável. No entanto, determinar diretamente os produtos desses ORFs (ou seja, proteína ou peptídeo) utilizando abordagens tradicionais como conservação evolutiva16,17 e espectrometria de ^massa18,19 é desafiador porque a eficiência de detecção de ambas as abordagens depende do comprimento, abundância e composição de aminoácidos das proteínas ou peptídeos produzidos. O advento do perfil ribossomo, uma técnica para identificar a ocupação ribossômica em mRNAs na resolução nucleotídea, forneceu uma maneira precisa de avaliar o potencial de codificação de diferentes transcrições3,20,21, independentemente de seu comprimento e composição. Um recurso importante e frequentemente utilizado para identificar ORFs ativamente traduzindo usando perfil ribossomo é a periodicidade de três nucleotídeos (3-nt) das pegadas do ribossomo no mRNA desde o códon inicial até o códon stop. No entanto, os dados de perfil ribossomo geralmente têm vários problemas, incluindo leituras de sequenciamento baixo e esparso ao longo de ORFs, alto ruído de sequenciamento e contaminações de RNA ribossômicos (rRNA). Assim, os sinais distorcidos e ambíguos gerados por tais dados enfraquecem os padrões de periodicidade de 3-nt das pegadas de ribossomos no mRNA, o que, em última análise, dificulta a identificação dos ORFs traduzidos de alta confiança.

Um pacote chamado "RiboCode" adaptou uma estratégia modificada de integração de classificação assinada por Wilcoxon e P-value para examinar se o ORF tem fragmentos proteis ribossomos (RPFs) mais in-frame do que ^rpfs22 off-frame. Demonstrou-se ser altamente eficiente, sensível e preciso para a anotação de novo do translatome em dados simulados e reais de perfil ribossomo. Aqui, descrevemos como usar esta ferramenta para detectar os ORFs de tradução potencial dos conjuntos de dados de sequenciamento de perfil ribossorosos crus gerados pelo estudo ^anterior23. Esses conjuntos de dados foram usados para explorar a função da subunidade EIF3 (EIF3E) em tradução comparando os perfis de ocupação ribossosome das células MCF-10A transfeminadas com controle (si-Ctrl) e EIF3E (si-eIF3e) RNAs de pequena interferência (siRNAs). Ao aplicar o RiboCode a esses conjuntos de dados de exemplo, detectamos 5.633 novos ORFs potencialmente codificando pequenos peptídeos ou proteínas. Esses ORFs foram categorizados em vários tipos com base em suas localizações em relação às regiões de codificação, incluindo ORFs upstream (uORFs), ORFs a jusante (dORFs), ORFs sobrepostos, ORFs de novos genes de codificação de proteínas (novos PCGs) e ORFs de novos genes de codificação não-proteína (novos NonPCGs). As densidades de leitura de RPF em uORFs foram significativamente aumentadas em células deficientes de EIF3E em comparação com células de controle, o que pode ser pelo menos parcialmente causado pelo enriquecimento de ribossomos ativamente traduzindo. O acúmulo localizado de ribossomos na região entre o ^25º e o ^75º codon de células deficientes do EIF3E indicaram um bloqueio do alongamento da tradução no estágio inicial. Este protocolo também mostra como visualizar a densidade de RPF da região desejada para examinar os padrões de periodicidade de 3 nt de pegadas ribossósas em ORFs identificados. Essas análises demonstram o poderoso papel do RiboCode na identificação de ORFs traduzindo e estudando a regulação da tradução.

Protocolo

1. Configuração do ambiente e instalação do RiboCode

1. Abra uma janela de terminal Linux e crie um ambiente conda:
   conda criar -n RiboCode python=3.8
2. Mude para o ambiente criado e instale o RiboCode e as dependências:
   conda ativar RiboCode
   conda instalar -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt bowtie star samtools

2. Preparação de dados

1. Pegue arquivos de referência de genoma.
   1. Para a sequência de referência, acesse o site do Ensemble em https://www.ensembl.org/index.html, clique no menu superior Download e no menu esquerdo FTP Download. Na tabela apresentada, clique em FASTA na coluna DNA (FASTA) e na linha onde Espécies é Humana. Na página aberta, copie o link da Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz, depois baixe e descompacte-o no terminal:
      wget -c \
      http://ftp.ensembl.org/pub/release-104/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
      gzip -d Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
   2. Para anotação de referência, clique com o botão direito do mouse gtF na coluna Gene define na última página da Web aberta. Copie o link da Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf.gz e baixe-o usando:
      wget -c \
      http://ftp.ensembl.org/pub/release-104/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.104.gtf.gz
      gzip -d Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf.gz
      NOTA: Recomenda-se obter o arquivo GTF do site do Ensemble, pois ele contém anotações de genoma organizadas em uma hierarquia de três níveis, ou seja, cada gene contém transcrições que contêm exons e traduções opcionais (por exemplo, sequências de codificação [CDS], site de início de tradução, site final de tradução). Quando as anotações de um gene ou transcrição estão faltando, por exemplo, um arquivo GTF obtido do UCSC ou NCBI, use GTFupdate para gerar um GTF atualizado com anotações completas de hierarquia pai-filho: GTFupdate original.gtf > atualizado.gtf. Para o arquivo de anotação no formato .gff, use o kit de ferramentas ^AGAT24 ou qualquer outra ferramenta para converter para o formato .gtf.
2. Obtenha sequências de rRNA.
   1. Abra o navegador de genomas UCSC em https://genome.ucsc.edu e clique em Ferramentas | Navegador de tabela na lista suspensa.
   2. Na página aberta, especifique mamífero para clado, humano para genoma, Todas as Tabelas para grupo, rmask para mesa e genoma para região. Para filtrar, clique em Criar para ir a uma nova página e definir repClass, assim como corresponder rRNA.
   3. Clique em Enviar e, em seguida, defina o formato de saída para sequência e nome de arquivo de saída como hg38_rRNA.fa. Finalmente, clique em Obter saída | Obtenha sequência para recuperar a sequência de rRNA.
3. Obtenha conjuntos de dados de perfil ribossosome do Sequence Read Archive (SRA).
   1. Baixe as amostras de réplica do grupo de tratamento si-eIF3e e renomeie-as:
      fastq-dump SRR9047190 SRR9047191 SRR9047192
      mv SRR9047190.fastq si-eIF3e-1.fastq
      mv SRR9047191.fastq si-eIF3e-2.fastq
      mv SRR9047192.fastq si-eIF3e-3.fastq
   2. Baixe as amostras de réplica do grupo de controle e renomeie-as:
      fastq-dump SRR9047193 SRR9047194 SRR9047195
      mv SRR9047193.fastq si-Ctrl-1.fastq
      mv SRR9047194.fastq si-Ctrl-2.fastq
      mv SRR9047195.fastq si-Ctrl-3.fastq
      NOTA: Os IDs de adesão da SRA para estes conjuntos de dados de exemplo foram obtidos no site Geo (Gene Expression Omnibus) ²⁵ , procurando por GSE131074.

3. Corte de adaptadores e remova a contaminação do rRNA

1. (Opcional) Remova os adaptadores dos dados de sequenciamento. Pule esta etapa se as sequências do adaptador já tiverem sido aparadas, como neste caso. Caso contrário, use o cutadapt para cortar os adaptadores das leituras.
   para i em si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
   fazer
   cutadapt -m 15 --match-read-curingas -a CTGTAGGCACCATCAAT \
   -o ${i}_trimmed.fastq ${i}.fastq
   terminado
   NOTA: A sequência do adaptador após -um parâmetro variará dependendo da preparação da biblioteca cDNA. As leituras mais curtas que 15 (dadas por -m) são descartadas porque os fragmentos protegidos por ribossomo são geralmente mais longos do que este tamanho.
2. Remova a contaminação do rRNA usando as seguintes etapas:
   1. Sequências de referência do índice rRNA:
      bowtie-build -f hg38_rRNA.fa hg38_rRNA
   2. Alinhe as leituras à referência rRNA para excluir as leituras originárias do rRNA:
      para i em si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
      fazer
      bowtie -n 0 -y -a --norc --best --strata -S -p 4 -l 15 \
      --un=./${i}_noncontam.fastq hg38_rRNA -q ${i}.fastq ${i}.aln
      terminado
      -p especifica o número de threads para executar paralelamente as tarefas. Considerando o tamanho relativamente pequeno das leituras da RPF, outros argumentos (por exemplo, -n, -y, -a, -norc, -best, --strates e -l) devem ser especificados para garantir que os alinhamentos relatados sejam os melhores. Para mais detalhes, consulte o site da ^Bowtie26.

4. Alinhe as leituras limpas ao genoma

1. Crie um índice de genoma.
   STAR_hg38_genome Mkdir
   STAR --runThreadN 8 --runMode genomaGenerate --genomaDir ./STAR_hg38_genome --genomaFastaFiles Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa --sjdbGTFfile Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf
2. Alinhe as leituras limpas (sem contaminação por rRNA) à referência criada.
   para i em si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
   fazer
   STAR --runThreadN 8 --outFilterType Normal --outWigType wiggle --outWigStrand Stranded --outWigNorm RPM --outFilterMismatchNmax 1 --outFilterMultimapNmax 1 --genomaDir STAR_hg38_genome --readFilesIn ${i}_noncontam.fastq --outFileNamePrefix ${i}. -outSAMtype BAM ClassificadoPorCoordene --quantMode TranscriptomeSAM GeneCounts --outSAMattributes All
   terminado
   NOTA: Um nucleotídeo não-estaplatado é frequentemente adicionado ao final de 5' de cada leitura pela transcriptase ²⁷ reversa, que será eficientemente aparada pelo STAR à medida que executa o recorte suave por padrão. Os parâmetros para STAR são descritos no manual ^STAR28.
3. Arquivos de alinhamento de classificação e índice.
   para i em si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
   fazer
   samtools tipo -T ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.classificado \
   -o ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.sorted.bam \
   ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.bam
   índice samtools ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.sorted.bam
   índice samtools ${i}. Aligned.sortedByCoord.out.bam
   terminado

5. Seleção de tamanho de RPFs e identificação de seus locais P

1. Prepare as anotações da transcrição.
   prepare_transcripts -g Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf \
   - Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa -o RiboCode_annot
   NOTA: Este comando coleta informações necessárias das transcrições de mRNA do arquivo GTF e extrai as sequências para todas as transcrições de mRNA do arquivo FASTA (cada transcrição é montada mesclando as exons de acordo com as estruturas definidas no arquivo GTF).
2. Selecione RPFs de comprimentos específicos e identifique suas posições no local P.
   para i em si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
   fazer
   metaplots -a RiboCode_annot -r ${i}. Aligned.toTranscriptome.out.bam \
   -o ${i} -f0_percent 0.35 -pv1 0.001 -pv2 0.001
   terminado
   NOTA: Este comando plota os perfis agregados da extremidade de 5' das leituras alinhadas de cada comprimento em torno de codons de início (ou stop) anotados de tradução. O p-site dependente de comprimento de leitura pode ser determinado manualmente examinando os gráficos de distribuição (por exemplo, Figura 1B) de distâncias de deslocamento entre as extremidades de 5' das leituras principais e o códon inicial. O RiboCode também gera um arquivo de configuração para cada amostra, no qual as posições do site P de leituras exibindo padrões significativos de periodicidade de 3 nt são automaticamente determinadas. Os parâmetros -f0_percent, -pv1 e -pv2 definem os cortes de limite de proporção e valor p para a seleção das leituras RPF enriquecidas no quadro de leitura. Neste exemplo, os nucleotídeos +12, +13 e +13 do final de 5' das leituras de 29, 30 e 31 nt são definidos manualmente em cada arquivo de configuração.
3. Edite os arquivos de configuração para cada amostra e mescle-os
   NOTA: Para gerar um conjunto de orfs exclusivo e garantir cobertura suficiente de leituras para realizar análises subsequentes, as leituras selecionadas de todas as amostras na etapa anterior são mescladas. As leituras de comprimentos específicos definidos em merged_config.txt arquivo (Arquivo Suplementar 1) e suas informações do site P são usadas para avaliar o potencial de tradução dos ORFs na próxima etapa.

6. De novo anotar orfs traduzindo

1. Executar RiboCode.
   RiboCode -a RiboCode_annot -c merged_config.txt -l sim -g \
   -o RiboCode_ORFs_result -s ATG -m 5 -A CTG,GTG,TTG
   Onde os parâmetros importantes deste comando são os seguintes:
   -c, arquivo de configuração contendo o caminho dos arquivos de entrada e as informações das leituras selecionadas e seus sites P.
   -l, para transcrições com códons de início múltiplos a montante dos códons de parada, se os ORFs mais longos (a região do codon de início mais distal para parar o codon) são usados para avaliar seu potencial de tradução. Se definido como não, os códons iniciais serão automaticamente determinados.
   -s, o codon(s) de início canônico usado para identificação de ORFs.
   -A, (opcionalmente) os códons de início nãocanônicos (por exemplo, CTG, GTG e TTG para humanos) utilizados para identificação orf, que podem diferir em mitocôndrias ou núcleo de outras ^espécies29.
   -m, o comprimento mínimo (ou seja, aminoácidos) de ORFs.
   -o, o prefixo do nome do arquivo de saída contendo os detalhes dos ORFs previstos (Arquivo Suplementar 2).
   -g e -b, saída os ORFs previstos para o formato gtf ou cama , respectivamente.

7. (Opcional) quantificação e estatísticas do ORF

1. Contagem RPF lê em cada ORF.
   para i em si-Ctrl-1 si-Ctrl-2 si-Ctrl-3 si-eIF3e-1 si-eIF3e-2 si-eIF3e-3
   fazer
   ORFcount -g RiboCode_ORFs_result_collapsed.gtf \
   -r ${i}. Aligned.sortedByCoord.out.bam -f 15 -l 5 -m 25 -M 35 \
   -o ${i}_ORF.conta -s sim -c intersecção-estrita
   terminado
   NOTA: Para excluir os potenciais ribossomos acumulados em torno do início e das extremidades dos ORFs, o número de leituras alocadas nos primeiros 15 (especificados por -f) e nos últimos 5 códons (específicos por -l) não são contados. Opcionalmente, os comprimentos dos RPFs contados são restritos à faixa de 25 a 35 nt (tamanhos comuns de RPFs).
2. Calcule as estatísticas básicas dos ORFs detectados usando o RiboCode:
   Rscript RiboCode_utils. R
   NOTA: RiboCode_utils. R (Arquivo Suplementar 3) fornece uma série de estatísticas para a saída do RiboCode, por exemplo, contando o número de ORFs identificados, visualizando a distribuição dos comprimentos orf e calculando as densidades de RPF normalizadas (ou seja, RPKM, leituras por quilobase por milhão de leituras mapeadas).

8. (Opcional) Visualização dos ORFs previstos

1. Obtenha as posições relativas do início e pare os códons para o ORF desejado (por exemplo, ENSG00000100902_35292349_35292552_67) em sua transcrição de RiboCode_ORFs_result_collapsed.txt (arquivo suplementar 3). Em seguida, plote a densidade de leituras de RPF no ORF:
   plot_orf_density -a RiboCode_annot -c merged_config.txt -t ENST000000622405 \
   -s 33 -e 236 --start-codon ATG -o ENSG00000100902_35292349_35292552_67
   Onde -s e -e especificar a posição de início e parada de tradução de plotagem orf. --start-codon define o códon inicial do ORF, que aparecerá no título da figura. -o define o prefixo do nome do arquivo de saída.

9. (Opcional) Análise metagênica usando RiboMiner

NOTA: Realize a análise metagene para avaliar a influência do knockdown EIF3E na tradução de ORFs anotados identificados, seguindo as etapas abaixo:

1. Gerar anotações de transcrições para RiboMiner, que extrai a transcrição mais longa para cada gene com base no arquivo de anotação gerado pelo RiboCode (etapa 5.1).
   OutputTranscriptInfo -c RiboCode_annot/transcripts_cds.txt \
   -G Homo_sapiens. GRCh38.104.gtf -f RiboCode_annot/transcripts_sequence.fa \
   -o mais longo.transcripts.info.txt -O all.transcripts.info.txt
2. Prepare o arquivo de configuração para RiboMiner. Copie o arquivo de configuração gerado pelo comando metaplots do RiboCode (etapa 5.4) e renomeie-o como "RiboMiner_config.txt". Em seguida, modifique-o de acordo com o formato mostrado no arquivo suplementar 4.
3. Metagene analisa usando RiboMiner
   1. Use MetageneAnalysis para gerar um perfil agregado e mediano das densidades dos RPFs através das transcrições.
      MetageneAnalysis -f RiboMiner_config.txt -c mais longo.transcripts.info.txt \
      -o MA_normed -U codon -M RPKM -u 100 -d 400 -l 100 -n 10 -m 1 -e 5 --norm yeah \
      -y 100 --tipo UTR
      Onde estão os parâmetros importantes: -tipo, analisando regiões de CDS ou UTR ; --norma, se normalizou a densidade de leitura; -y, o número de códons usados para cada transcrição; -U, plot RPF densidade tanto no nível de don ou nt ; -u e -d, definir a faixa de análise de regiões relativas ao códon ou parar o códon; -l, o comprimento mínimo (ou seja, o número de códons) do CDS; -M, o modo de filtragem de transcrições, conta ou RPKM; -n contagens mínimas ou RPKM em CDS para análise. -m contagem mínima ou RPKM de CDS na região normalizada; -e, o número de códons excluídos da região normalizada.
   2. Gere um conjunto de arquivos pdf para comparar as ocupações ribossósmes em mRNA em células de controle e células deficientes eIF3.
      PlotMetageneAnalysis -i MA_normed_dataframe.txt -o MA_normed \
      -g si-Ctrl,si-eIF3e -r si-Ctrl-1,si-Ctrl-2,si-Ctrl-3__si-eIF3e-1,si-eIF3e-2,si-eIF3e-3 -u 100 -d 400 --modo média
      NOTA: PlotMetageneAnalysis gera o conjunto de arquivos pdf. Detalhes sobre o uso de MetageneAnalysis e PlotMetageneAnalysis estão disponíveis no site da RiboMiner30.

Resultados

Os conjuntos de dados de perfil ribossosome foram depositados no banco de dados GEO sob o número de adesão GSE131074. Todos os arquivos e códigos usados neste protocolo estão disponíveis nos arquivos suplementares 1-4. Aplicando o RiboCode a um conjunto de conjuntos de dados de perfil ribossosome ^publicado23, identificamos os novos ORFs traduzidos ativamente em células MCF-10A tratadas com controle e siRNAs EIF3E. Para selecionar as...

Discussão

O perfil ribossomo oferece uma oportunidade sem precedentes para estudar a ação dos ribossomos nas células em uma escala de genoma. Decifrar precisamente as informações transportadas pelos dados de criação de perfil ribossomos poderia fornecer informações sobre quais regiões de genes ou transcrições estão traduzindo ativamente. Este protocolo passo a passo fornece orientações sobre como usar o RiboCode para analisar os dados de perfil ribossomo em detalhes, incluindo instalação de pacotes, preparação d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A computer/server running Linux	Any	-	-
Anaconda or Miniconda	Anaconda	-	Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
R	R Foundation	-	https://www.r-project.org/
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