הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

Summary

המאמר מסביר כיצד להסיר באופן כירורגי עיניים מזחלי דגי זברה חיים כצעד ראשון לקראת חקירת האופן שבו קלט רשתית משפיע על צמיחת והתפתחות של טקטום אופטי. בנוסף, המאמר מספק מידע על הרדמה של זחלים, קיבוע וכריתת מוח, ולאחר מכן אימונוהיסטוכימיה והדמיה קונפוקלית.

Abstract

דגי זברה מפגינים יכולות צמיחה והתחדשות יוצאות דופן לאורך כל החיים. לדוגמה, נישות מיוחדות של תאי גזע שהוקמו במהלך העובריות תומכות בצמיחה מתמשכת של מערכת הראייה כולה, הן בעין והן במוח. צמיחה מתואמת בין הרשתית לבין טקטום אופטי מבטיחה מיפוי רטינוטופי מדויק כאשר נוירונים חדשים מתווספים לעיניים ולמוח. כדי לענות על השאלה אם אקסונים של הרשתית מספקים מידע חיוני לוויסות התנהגויות של גזע טקטלי ותאי אב כגון הישרדות, התפשטות ו/או התמיינות, יש צורך להיות מסוגלים להשוות אונות טקטליות מופנמות ומנוכרות בתוך אותה חיה ובין בעלי חיים.

הסרה כירורגית של עין אחת מדגי זברה זחליים חיים ולאחר מכן תצפית על טקטום אופטי משיגה מטרה זו. הסרטון הנלווה מדגים כיצד להרדים זחלים, לחדד באופן אלקטרוליטי מחטי טונגסטן ולהשתמש בהם כדי להסיר עין אחת. לאחר מכן הוא מראה כיצד לנתח מוחות מזחלי דגי זברה קבועים. לבסוף, הסרטון מספק סקירה כללית של הפרוטוקול לאימונוהיסטוכימיה והדגמה כיצד להרכיב עוברים מוכתמים באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה לצורך מיקרוסקופיה.

Introduction

מטרת שיטה זו היא לחקור כיצד קלט רשתית משפיע על הגדילה וההתפתחות של טקטום אופטי, מרכז העיבוד החזותי במוח דגי הזברה. על ידי הסרת עין אחת ולאחר מכן השוואת שני הצדדים של טקטום אופטי, ניתן לצפות ולנרמל שינויים טקטליים בתוך אותה דגימה, מה שמאפשר השוואה בין דגימות מרובות. גישות מולקולריות מודרניות בשילוב עם טכניקה זו יניבו תובנות על המנגנונים העומדים בבסיס הצמיחה וההתפתחות של מערכת הראייה, כמו גם על ניוון והתחדשות אקסונאלית.

מערכות חושיות - חזותיות, שמיעתיות וסומטוסנסוריות - אוספות מידע מאיברים חיצוניים ומעבירות את המידע הזה למערכת העצבים המרכזית, ויוצרות "מפות" של העולם החיצוני על פני המוח האמצעי ^1,2. ראייה היא השיטה החושית הדומיננטית עבור כמעט כל בעלי החוליות, כולל דגים רבים. הרשתית, הרקמה העצבית בעין, אוספת מידע עם מעגל עצבי המורכב בעיקר מפוטורצפטורים, תאים דו קוטביים ותאי גנגליון רשתית (RGCs), נוירוני ההקרנה של הרשתית. ל-RGCs יש אקסונים ארוכים שמוצאים את דרכם על פני השטח הפנימיים של הרשתית אל ראש עצב הראייה, שם הם מתפתלים ונעים יחד דרך המוח, ובסופו של דבר מסתיימים במרכז העיבוד החזותי במוח האמצע הגבי. מבנה זה נקרא טקטום אופטי בדגים ובבעלי חוליות אחרים שאינם יונקים והוא הומולוגי לקוליקולוס העליון ביונקים³.

טקטום אופטי הוא מבנה רב שכבתי סימטרי דו-צדדי במוח האמצע הגבי. בדגי זברה וברוב הדגים האחרים, כל אונה של טקטום אופטי מקבלת קלט חזותי אך ורק מהעין הקונטרולטרלית, כך שעצב הראייה השמאלי מסתיים באונה הטקטלית הימנית ועצב הראייה הימני מסתיים באונה הטקטלית השמאלית⁴ (איור 1). בדומה למקבילו היונקים, הקוליקולוס המעולה, טקטום אופטי משלב מידע חזותי עם קלטים חושיים אחרים, כולל אודישן וסומטוסנסציה, שליטה בשינויים בקשב החזותי ובתנועות עיניים כגון סקאדות ^1,5,6. עם זאת, שלא כמו הקוליקולוס העליון של היונקים, הטקטום האופטי מייצר ברציפות נוירונים וגליה חדשים מגומחת תאי גזע מיוחדת ליד הקצוות המדיאליים והקאודלים של האונות הטקטליות הנקראות אזור ההתרבות^{הטקטלית 7}. תחזוקה של אבות מתרבים בטקטום האופטי ובאזורים אחרים במערכת העצבים המרכזית תורמת, בין השאר, ליכולת ההתחדשות המדהימה המתועדת בדגי זברה⁸.

עבודות קודמות שבחנו את מוחותיהם של דגים עיוורים או חדי עין גילו כי גודל טקטום אופטי עומד ביחס ישר לכמות העצבנות ברשתית שהוא מקבל ^9,10,11. בדגי מערות בוגרים, שעיניהם מתנוונות באמבריוגנזה מוקדמת, טקטום הראייה קטן באופן ניכר מזה של דגי פני השטח הקרובים, בעלי הראייה הקרובה⁹. ניתן לחסום את ניוון העיניים של דגי המערות על ידי החלפת העדשה האנדוגנית בעדשה של דג פני השטח במהלך העובר. כאשר דגי מערות חדי עין אלה גדלים לבגרות, האונה הטקטלית העצבנית מכילה כ-10% יותר תאים מאשר האונה הטקטלית שאינה מוחננת⁹. באופן דומה, בדגי קטל זחלים שעברו טיפולים כימיים כדי ליצור עיניים בגדלים שונים בתוך אותו אדם, הצד של הטקטום עם יותר עצבנות היה גדול יותר והכיל יותר נוירונים¹⁰. עדויות מניסויים בריסוק עצבי ראייה בדגי זהב בוגרים מצביעות על כך שהתרבות העצבנות מקדמת התפשטות, כאשר התפשטות תאי הכרק פוחתת כאשר העצבנות שובשה¹¹.

כדי לאשר ולהרחיב את המחקרים הקלאסיים האלה, כמה דיווחים עדכניים מספקים נתונים המצביעים על כך שהתפשטות בתגובה להפנמה מווסתת, לפחות בחלקה, על ידי מסלול BDNF-TrkB^12,13. שאלות פתוחות רבות לגבי גדילה והתפתחות של טקטום אופטי נותרו בעינן, כולל כיצד מערכת חושית מתפתחת מתמודדת עם פציעה וניוון אקסון, אילו אותות תאיים ומולקולריים מאפשרים לקלט רשתית לווסת את צמיחת הטקטום האופטי, מתי מנגנונים אלה הופכים לפעילים, והאם התפשטות והתמיינות הקשורות לעירוי העצבנות מאפשרות לרשתית ולרקמת היעד שלה לתאם את קצבי הגדילה ולהבטיח מיפוי רטינוטופי מדויק. בנוסף, ישנן שאלות הרבה יותר גדולות על התפתחות תלוית פעילות שניתן לטפל בהן על ידי חקירת מערכת הראייה של דגי הזברה עם גישות כירורגיות כמו זו המתוארת להלן.

כדי לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים שבאמצעותם פעילות עצבית, במיוחד מתוך קלט חזותי, משנה את הישרדות התאים ואת התפשטותם, הגישה המתוארת משווה באופן ישיר בין אונות טקטליות עצבוניות ומנוכרות (איור 1) בתוך זחלי דגי זברה בודדים. שיטה זו מאפשרת תיעוד של התנוונות אקסון RGC בטקטום האופטי ואישור לכך שמספר התאים המיטוטיים מתואם עם העצבנות.

איור 1: רישומים של זחלי דגי זברה לפני ואחרי הסרת עיניים חד-צדדית. (A) ציור של 5 זחלי dpf כפי שנצפו תחת מיקרוסקופ מנתח. כל זחל משובץ באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ומכוון לרוחב לפני שמחט טונגסטן עם קצה חד ומחובר משמשת כדי להוציא את העין הפונה כלפי מעלה (עין שמאל בדוגמה זו). (B) ציור הנוף הגבי של זחל 9 dpf כתוצאה מהניתוח המתואר ב-A. רק שלושה אקסוני RGC שעברו מיפוי גבוה מעין ימין נראים מתייבשים ומתחברים לנוירונים באונה הטקטלית השמאלית. קיצורים: dpf = ימים לאחר ההפריה; dps = ימים לאחר הניתוח; RGC = תאי גנגליון רשתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

השיטות במאמר זה נערכו בהתאם להנחיות ולאישור הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של ריד קולג' ויוניברסיטי קולג' בלונדון. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על זני דגי זברה ששימשו במחקר זה.

1. הכינו חומרים וכלים

1. הכינו פתרונות.
   1. הפוך את העובר לבינוני (E3¹⁴) על ידי דילול מלאי של פי 60 (300 mM NaCl, 10.2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-דיהידרט, ו-20 mM MgCl_{2-הקסהידרט} במים שעברו דה-יוניזציה, אוטוקלאבים ומאוחסנים בטמפרטורת החדר). הוסיפו 160 מ"ל של 60x E3 עד 10 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
   2. צרו אגרוז נקודת התכה נמוכה של 1% (LMP) ב-E3. ממיסים 1 גרם של אגרוז LMP לתוך 100 מ"ל של E3 על ידי רתיחה במיקרוגל במשך 1-2 דקות בהספק גבוה. Aliquot מותך אגרוז לתוך צינורות microfuge 1.7 מ"ל, ומאוחסנים ב 4 °C (66 °F). מרתיחים באמבטיית מים ומחזיקים בלוק חום של 40 מעלות צלזיוס כאשר הם מוכנים לשימוש להטמעה.
   3. הפוך את תמיסת הצלצולים המהונדסים של מארק (MMR¹⁵) על ידי דילול מלאי של פי 10 (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO₄, 20 mM CaCl 2-dihydrate, 50 mM HEPES, pH מותאם ל-7.5 עם NaOH של 10 M, ולאחר מכן מאוחסן באופן אוטומטי ומאוחסן בטמפרטורת החדר). הוסיפו 10 מ"ל של 10x MMR ל-90 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה.
2. יוצקים צלחות Sylgard על פי הוראות היצרן, ומאפשרים להם להגדיר ולייבש במשך מספר ימים¹⁶.
3. מחדדים באופן אלקטרוליטי מחטי טונגסטן (פרוטוקול שונה ^מ-17).
   1. ראשית, הכינו תמיסת KOH של 10% (w/v) על ידי הוספת 200 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה לצנצנת זכוכית בעלת פה רחב עם מכסה בורג עליון. יש לערבב באיטיות פנימה 20 גרם של כדורי KOH.
      הערה: פתרון קאוסטי זה הוא אקסותרמי מאוד. לבשו כפפות והגנת עיניים, וערבבו את התמיסה במכסה המנוע.
   2. חותכים חוט טונגסטן באורך 2-3 ס"מ ומכניסים אותו למחזיק המחט.
   3. חבר את חוטי הקתודה והאנודה לאספקת החשמל. חברו את מהדק התנינים בקצה חוט הקתודה למהדק נייר מיושר חלקית והכניסו את מהדק הנייר לתמיסת KOH, והצמידו אותו לצד הצנצנת.
   4. לאחר מכן, חבר את קליפ התנין של חוט האנודה לצווארו של מחזיק המחט. הפעילו את החשמל (ל-~20 וולט) וטבלו את חוט הטונגסטן בתמיסת KOH, ומשכו את החוט מהתמיסה בזווית כדי לחדד את החוט באופן אלקטרוליטי לקצה דק.
      הערה: בועות יגיעו מהדק הנייר ככל שהתגובה תתקדם.
   5. בדוק את קצה המחט מתחת למיקרוסקופ הניתוח כדי לוודא שהיא חדה מספיק.
   6. שטפו את המחט במים שעברו דה-יוניזציה כדי להסיר את כל שאריות ה-KOH. הכינו מספר מחטים מראש ושמרו עליהן עד לניתוחי הזחלים ולניתוחים.
4. הכינו שקופיות קאמריות להדמיית דגימות של דגי זברה עם מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף.
   1. השג שקופיות מיקרוסקופ זכוכית ושרף אפוקסי בשני חלקים (ראה טבלת החומרים). מערבבים את האפוקסי על פי ההוראות שעל האריזה, וצובעים טבעות או מלבנים עבים על שקופיות הזכוכית. אפשרו למגלשות לרפא ולייבש במכסה המנוע למשך 24 שעות לפחות לפני השימוש.

2. איסוף וגידול עוברים

1. זוג דגים זכרים ונקבות בוגרים של הגנוטיפים הרצויים בקופסאות רבייה בשעות אחר הצהריים המאוחרות / בשעות הערב המוקדמות. למחרת בבוקר, לאחר שהם משריצים, אוספים ביציות מופרות חדשות עם מסננת רשת ומעבירים אותן ל-E3 בכלי פטרי 100 מ"מ.
2. הדגירה של העוברים בטמפרטורה של כ-27.5 מעלות צלזיוס עם מחזור חשוך של 14 שעות/10 שעות עד ליום הניתוח. החלף את E3 מדי יום או לפי הצורך.
3. האכילו את הזחלים באמצעות טפטפת מלאה ברוטיפרים שנקטפו פעם ביום, החל מ-5 ימים לאחר ההפריה (dpf) או יום אחד לאחר הניתוח. לאחר שלזחלים יש מספר שעות לאכול, החליפו את ה-E3 כדי להסיר את כל הרוטיפרים ומוצרי הפסולת שנותרו.
   הערה: אין להאכיל זחלים ביום הניתוח.

3. הכינו זחלים לניתוח

1. ביום הניתוח, השתמשו בפיפטת פסטר מזכוכית רחבה כדי להעביר 10-15 זחלים לצלחת פטרי 35 מ"מ במילוי E3 טרי.
2. מרדימים את הזחלים על ידי הוספת 3-5 טיפות של 0.4% w/v תמיסת טריקאין (0.4 גרם טריקאין מומס ב-210 mM Tris, pH 9; התמיסה הסופית מותאמת ל-pH של 7.4 במידת הצורך¹⁸) למנה לקבלת ריכוז סופי של ~0.0015% w/v Tricaine. חפשו חוסר תגובה למגע כדי לקבוע אם הזחלים מורדמים כראוי. אם הם עדיין מגיבים למגע לאחר ~ 3 דקות, הוסף 2-3 טיפות נוספות של 0.4% w / v תמיסת טריקאין והערכה מחדש.
   הערה: בשלב זה של ההתפתחות, ניתן לעקוב אחר זרימת הדם וקצב הלב בנוסף לתנועתיות תחת מיקרוסקופ הניתוח.
3. שתקו את זחלי דגי הזברה המורדמים על ידי הטבעתם באגרוז LMP 1% המומס ב-E3.
   1. ראשית, הניחו את המכסה של צלחת פטרי 35 מ"מ עם הפנים כלפי מעלה מתחת למיקרוסקופ הניתוח. לאחר מכן, קחו זחל אחד למעלה לתוך פיפטת פסטר צרה מזכוכית עם כמות קטנה בלבד של E3.
   2. לאחר מכן, שאפו ~ 200 μL של נמס, חם (~ 40 מעלות צלזיוס) 1% LMP אגרוז לתוך הפיפטה עם הזחל. לבסוף, התיזו את הזחל והאגרוז על מכסה צלחת פטרי ההפוך.
   3. השתמש במחט טונגסטן עמומה כדי לתמרן במהירות אך בעדינות את הזחל כך שיהיה רוחבי, כאשר עין אחת פונה כלפי מעלה. המתן עד שהאגרוז ישקע (~ 5 דקות).
      הערה: אם האגרוז מתקשה בזמן שהזחל אינו לרוחב, שחררו אותו מהאגרוז (כמתואר בשלב 5) והחזירו אותו למנה עם E3 וטריקאין.

4. הסרת עיניים

1. לאחר שהאגרוז מוגדר, והזחל ממוקם לרוחב, השתמש בקצה של מחט טונגסטן עדינה מאוד, מחודדת אלקטרוליטית, כדי לחדור את העור סביב העין, בעקבות קצה מסלול העין.
2. לאחר מכן, החליקו את קצה המחט (לא את הקצה) מתחת לעין מהצד הטמפורלי-גחוני של העין. השתמש בלחץ מבוקר כדי לשחרר את העין מהשקע.
3. השתמש במלקחיים כירורגיים עדינים מאוד כדי להסיר את העין על ידי צביטה של עצב הראייה ודחיפת העין ממדיאלית לרוחבית. לחלופין, פשוט המשיכו ללחוץ על העין בצורה הגבית והקדמית עם צד המחט, ובסופו של דבר חותכים דרך עצב הראייה ומשחררים את העין.
   הערה: אם רקמות שאינן העין נדקרו בטעות במהלך הניתוח, הרגו במהירות ובאופן אנושי את הזחל על ידי עריפה מהירה.

5. טיפול לאחר הניתוח עד לנקודת הסיום הניסויית

1. לאחר הסרת עיניים מוצלחת, לכסות את האגרוז עם תמיסת MMR.
2. שחררו כל זחל מהאגרוז על ידי הברשה עדינה של מחט טונגסטן סביב ראשם ולאחר מכן סביב גופם תוך ייצוב מכסה צלחת פטרי עם מלקחיים.
3. העבירו את הזחלים בעלי העין האחת לצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה MMR בתוספת דילול של 1:100 של קוקטייל פניצילין/סטרפטומיצין. דגירה של העוברים בטמפרטורה של כ-27.5 מעלות צלזיוס עם מחזור חשוך של 14 שעות/10 שעות.
   הערה: תמיסה איזוטונית זו של MMR בתוספת אנטיביוטיקה מסייעת בתחילה לריפוי הזחל ולהישרדותם. כל מנה יכולה להכיל עד 15 זחלים מחלימים.
4. למחרת, החזירו את הזחלים ל-E3. החל משעות אחר הצהריים שלאחר הניתוח, האכילו זחלים (כ-6 dpf ומעלה) באמצעות טפטפת מלאה ברוטיפרים שנקטפו פעם ביום. לאחר שלזחלים היו מספר שעות לאכול, החליפו את ה-E3 כדי להסיר את כל הרוטיפרים ומוצרי הפסולת שנותרו.

6. תיקון זחלים

1. לאחר שהזחלים הגיעו לשלב ההתפתחותי הרצוי לניתוח, הרדימו אותם במינון קטלני של טריקאין (כ-0.4% ריכוז סופי) עד שהלב שלהם ייפסק.
2. פיפטה עד 30 זחלים לכל צינור מיקרופוג 1.5 מ"ל. הסר עודף E3 ולאחר מכן הוסף 0.5-1 מ"ל של תמיסה מקבעת (4% paraformaldehyde (PFA) ו-4% סוכרוז במי מלח עם מאגר פוספט (PBS)) כדי לתקן את הרקמה. דגירה של הזחלים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
3. שטפו את הזחלים עם PBS למחרת על ידי הסרת המקבע ושטיפת הזחלים 3-4 פעמים עם PBS. אחסנו את הזחלים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 7 ימים לפני הכריתה.

7. ניתוח זחלים כדי לחשוף מוחות (מותאמים ^מ-15)

1. תלו את הזחלים הקבועים בטיפות PBS על צלחת סילגארד תחת מיקרוסקופ מנתח. אבטחו אותם לרוחב על ידי הצבת שני סיכות טונגסטן (בדרך כלל מחטי טונגסטן ישנות שגודלן פחות מ-2 ס"מ) דרך הנוטוקורד, כאשר סיכה אחת רק אחורית לאזור הפיגמנטי המכסה את אזור אבי העורקים-גונד-מזונפרוס (AGM) וסיכה נוספת בקו אחד בקו אחד עם סוף הרחבת החלמון.
   הערה: מקם את סיכות הטונגסטן בכמה שפחות ניסיונות מכיוון שהרקמה תהפוך לפריכה יותר עם כל נקב.
2. השתמשו במחט טונגסטן חדה מאוד ובמלקחיים חדי מחט כדי לחשוף את המוח על ידי הסרת העיניים, בסדר זה, העיניים, האוזן, הלסת, מערכת העיכול ועור הגולגולת הגבי.
   1. ראשית, הסר את העין בטכניקה הדומה להסרת העין הניתוחית בשלב 4. לאחר מכן, פתחו את ההצמדה של הזחל והפכו אותו לצד הנגדי, כך שהעין השנייה תהיה נגישה ותחזור על הפעולה. לחלופין, תקעו את המחט דרך הלסת לצד השני והסירו את העין מבלי להתיר את הסיכה.
      הערה: ניתן לאסוף עיניים בשלב זה אם רוצים ניתוח של רקמה זו (בדומה ^ל-19).
   2. לאחר מכן, השתמש במחט הטונגסטן כדי לגרד מהצד הטמפורלי לצד הגחוני של האוזן. באותה פעולה/תנועה, הביאו את המחט האחורית ללסת ומשכו בעדינות קדמית עד להסרת האוזן והלסת.
   3. השתמש במלקחיים כדי למשוך את איברי הגחון ואת כל החלמון שנותר החוצה.
   4. לבסוף, בצע חתך רדוד בעור הגולגולת הגבי ליד הצומת בין המוח האחורי לחוט השדרה. הרימו את העור עם המלקחיים ומשכו אותו קדימה וסביב הטלנספלון. אם זה מתגלה כקשה מדי, התחילו בחתך הראשוני בחלק האחורי ומשכו את העור תחילה לרוחב ולאחר מכן בגחון ובחזית, תוך הקפדה רבה שלא לגרד את הקצוות הצדדיים של הטקטום.
      הערה: מכיוון שהמוח האמצעי הוא מושא המחקר, ניתן לחתוך את המוח האחורי; עם זאת, חתך עמוק עלול לגרום לעריפה.
   5. הסר את כל הרקמה שנותרה עם מלקחיים. שחררו את הזחל והעבירו ל-PBS בצינור מיקרופוג' של 1.5 מ"ל.
      הערה: השאר את הזנב מחובר למוח כדי לקבל נראות טובה יותר בעת ביצוע פרוטוקולים שלמים.

8. התייבשות המוח ואחסון

1. הסר PBS מהמוח והוסף 1 מ"ל של PBS המכיל 0.1% TritonX-100 (PBST). דגירה למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. הסר את ה- PBST והחלף אותו בפתרון 50:50 מתנול:PBST. דגירה למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
3. לשטוף את המוח עם 100% מתנול (MeOH) פעמיים במשך 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
4. אחסן את המוחות ב-100% MeOH בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות לפחות לפני ביצוע אימונוהיסטוכימיה או הליכים אחרים שלמים.
   הערה: ניתן לאחסן מוחות ב- MeOH למשך עד שנתיים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

9. אימונוהיסטוכימיה

הערה: פרוטוקולים מבוססים עבור טכניקות שימושיות רבות של Wholemount בדגי זברה ניתן למצוא ב- ZFIN²⁰. כתב היד הזה מספק דוגמאות להשוואה בין זחלים חדי עין וזחלים בעלי שתי עיניים שהיו נגועים בנוגדנים שמזהים את החלבון הפלואורסצנטי האדום (RFP), המבוטא באקסונים של עצב הראייה בקו Tg[atoh7:RFP] (איור 2), או בהיסטון H3 (PH3) שעבר זרחון, המדגיש תאים מיטוטיים (איור 3). פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי לעוברים וזחלים שלמים מסוכם להלן.

1. ראשית, לייבש מחדש את מוחות הזחלים עם סדרה מדורגת של שטיפות MeOH:PBST בטמפרטורת החדר על ידי דגירה של הדגימות בשעה 50:50 MeOH:PBST למשך 5 דקות, ולאחר מכן בשעה 30:70 MeOH:PBST למשך 5 דקות, ולסיים עם 3 שטיפות של PBST.
2. כדי לחלחל למוח, דגירו אותם ב-PBST בתוספת פרוטאינאז K (PK) בריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל PK למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. יש לאחסן אליקוטים של 10 מ"ג/מ"ל PK בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ולהפשיר אותם לפני השימוש.
3. הסירו את תמיסת ה-PK ושטפו את כל האנזימים שנותרו על ידי שטיפת המוחות ב-PBST 3 פעמים במשך 15 דקות.
4. שחזרו את המוחות החודרים על ידי דגירה שלהם ב-4% PFA למשך 20 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס (או טמפרטורת החדר). לאחר מכן, הסר PFA ושטף את כל הקיבוע שנותר על ידי שטיפת המוח 3 פעמים מעל 15 דקות עם PBST.
5. החליפו את שטיפת ה-PBST הסופית במאגר חיסוני (IB) טרי (10% סרום עיזים תקין ו-1% DMSO ב-PBST) והדגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות.
6. דילול נוגדנים ראשוניים למאגר IB בריכוז המתאים (למשל, 1:500 ל-RFP ו-1:300 לנוגדני PH3).
7. מוציאים את מאגר ה-IB מהמוח ומחליפים אותו בדילול הנוגדנים העיקרי. דגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי עם נדנדה עדינה. ודא שהצינורות מונחים בבטחה על צדם.
8. למחרת בבוקר, להסיר את תמיסת הנוגדן העיקרית עם micropipette, לשטוף כמה פעמים PBST, ולאחר מכן לשטוף את המוח ב PBST בטמפרטורת החדר במשך 4 x 30 דקות.
   הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בדילול נוגדנים ראשוני פעם אחת תוך כ-7 ימים אם הם מאוחסנים בטמפרטורה של 4 °C (7 °F).
9. שטפו את המוחות במאגר IB תוך דילול נוגדנים משניים למאגר IB בריכוז המתאים (למשל, 1:500 עבור אלקסה-פלואור 568 אנטי-ארנב).
10. הסר את מאגר ה- IB והחלף אותו בדילול הנוגדן המשני. דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי עם נדנדה עדינה של הצינורות המונחים על צדם.
11. למחרת בבוקר, הסר את תמיסת הנוגדן המשנית, שטפו עם PBST ולאחר מכן שטפו מוחות ב- PBST בטמפרטורת החדר במשך 4 x 30 דקות.
12. כתם נגדי עם 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) או ToPro3 (1:5,000 ב-PBST ב-4 מעלות צלזיוס בלילה).
13. למחרת בבוקר, העבירו את מוחות הזחלים ל-PBS והמשיכו לשלבי ההרכבה וההדמיה המפורטים להלן.

10. הרכבה והדמיה

1. הקפידו על מגלשה נעולה לתוך המכסה של צלחת פטרי 100 מ"מ עם שומן ואקום.
2. העבירו את הזחלים המוכתמים והמוחצבים לצלחת באר או לשקופית דיכאון כדי לצפות בהם באמצעות מיקרוסקופ מנתח.
3. הר את הזחלים על המגלשה הסגורה בעמודים של 1% אגרוז LMP.
   1. באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, שים זחל אחד על המגלשה התאית, והפקיד כמה שפחות PBS. עם אותה פיפטה, לכסות את הזחל עם אגרוז LMP מותך 1% (~ 40 מעלות צלזיוס).
   2. בעזרת מחט טונגסטן קהה או מלקחיים, משכו את האגרוז לתוך עמוד ואז מיקמו את הזחל בצורה סימטרית ככל האפשר, כאשר פני השטח הגביים נראים לעין.
   3. חזור על הליך זה עבור הזחלים הנותרים.
   4. לאחר שהאגרוז התקלקל, מכסים אותו בכמה טיפות של PBS ואז מניחים אותו על הבמה של המיקרוסקופ הקונפוקלי.
4. יישמו את העדשה האובייקטיבית עם הדגימה, מקד את המיקרוסקופ באמצעות אור משודר, והאיר את הדגימה בלייזרים המתאימים.
   הערה: בדוגמה זו, אורכי גל של 405 ננומטר ו-568 ננומטר שימשו כדי לעורר DAPI ו-RFP, בהתאמה.
5. התאם את כוח הרווח, ההסטה והלייזר על-ידי הזזת פסי המחוון לרמה מתאימה ביחס לאות ולגלאי המשומש. בדוק את ההיסטוגרמות עבור כל ערוץ ולחץ על לחצן מחוון מצב הרוויה מעל התמונה כדי לאמוד את רמת החשיפה, כדי לוודא שאף אחד מהפיקסלים אינו רווי ושיחס האות לרעש גבוה. לדוגמה לפרמטרים אופטימליים של הדמיה קונפוקלית עבור רזולוציה תאית ותת-תאית בתוך דגי זברה, ראו ²¹.
6. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של ערימת מישורי z על-ידי שימוש בגלגל הגלילה בעכבר כדי למצוא את החלק העליון והתחתון של הדגימה. לחץ על הגבול העליון והתחתון לרכישת תמונה ולאחר מכן הפעל את לכידת z-stack על-ידי לחיצה על לחצן הפעל כעת .
   הערה: בהתאם לאופן הסימטרי שבו המוח מותקן, עומק ה-z הכולל עבור מוח של דג זברה זחלי 9 dpf יהיה ~150-200 מיקרומטר.
7. לעבד ולצבוע את התמונות תוך מחשבה על נגישות עיוורי צבעים (לדוגמה, השתמש בכחול וכתום או במג'נטה וירוק לתמונות בשני צבעים). הגדר טבלאות בדיקת מידע בתוכנה המשמשת ללכידת התמונות או תוכנות עיבוד התמונה כגון Photoshop מבית Adobe.
8. ב- Photoshop, פוטומיקרוגרפיות גולמיות צבעוניות שנשמרו כפורמט קובץ תמונה מתויג של 8 סיביות (TIFF) על-ידי (i) המרת מצב התמונה ל- RGB ו- (ii) גישה לאפשרות עקומות תחת | התאמות תפריטים ולאחר מכן (iii) החלקת תפוקות האור הצבעוניות המתאימות ל-0 או 255 רמות כדי להשיג את הצבע הרצוי. לדוגמה, כדי להשיג אות ירוק, בחר את הערוץ האדום והחלק את הפלט שלו ל - 0; לאחר מכן, בחר את הערוץ הכחול והחלק את הפלט שלו גם ל - 0 . באופן דומה, כדי להשיג אות מג'נטה, בחר את הערוץ הירוק והחלק את הפלט שלו ל-0; להשאיר את הערוצים האדומים והכחולים כפי שהם.
   הערה: שלבים דומים ניתן לבצע בתוכנית מניפולציית התמונות החינמית של גנו (GIMP).
9. כימת באופן ידני את מספרי התאים המציגים סמן מסוים באמצעות תוסף מונה התאים ב- ImageJ²², הזמין תחת ניתוח בתפריט תוספים. דוגמאות לשימוש ב- ImageJ לספירת תאים ניתן למצוא בערכות לימוד רבות, כולל ²³.
10. יצירת ייצוגים גרפיים של נתונים בתוכנות סטטיסטיות כגון RStudio (ראה נתונים משלימים עבור . קובץ Rmd).

תוצאות

כדי לוודא אם הסרת העיניים הושלמה ולהעריך כיצד הטקטום האופטי משתנה, בוצעו ניתוחים בזן Tg[atoh7:RFP], המסמנת את כל ה-RGCs עם RFP ממוקד ממברנה, וכך גם את כל האקסונים המקרינים מהרשתית ויוצרים את עצב הראייה²⁴. למרות ששימוש בזן זה אינו הכרחי לחלוטין, הוא מאפשר תצפית והדמיה פשוטה של עצב הרא?...

Discussion

הטכניקות המתוארות במאמר זה ממחישות אחת מגישות רבות לחקר התפתחות מערכת הראייה של בעלי חוליות בדגי זברה. חוקרים אחרים פרסמו שיטות לנתח את הרשתית העוברית ולבצע ניתוחי ביטוי גנים¹⁹ או לדמיין פעילות עצבית בטקטום אופטי³⁰. מאמר זה מספק גישה לבחינת האופן שבו קלט רשתית דיפ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation
Fine forceps - Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
Rstudio			freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains			available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.