Rimozione dell'occhio nelle larve di zebrafish viventi per esaminare la crescita dipendente dall'innervazione e lo sviluppo del sistema visivo

Riepilogo

L'articolo spiega come rimuovere chirurgicamente gli occhi dalle larve viventi di zebrafish come primo passo verso lo studio di come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico. Inoltre, l'articolo fornisce informazioni sull'anestesia larvale, la fissazione e la dissezione cerebrale, seguite da immunoistochimica e imaging confocale.

Abstract

I pesci zebra mostrano una notevole crescita per tutta la vita e capacità rigenerative. Ad esempio, nicchie di cellule staminali specializzate stabilite durante l'embriogenesi supportano la crescita continua dell'intero sistema visivo, sia nell'occhio che nel cervello. La crescita coordinata tra la retina e il tectum ottico garantisce un'accurata mappatura retinotopica quando vengono aggiunti nuovi neuroni negli occhi e nel cervello. Per capire se gli assoni retinici forniscono informazioni cruciali per la regolazione dei comportamenti delle cellule staminali e progenitrici del tectale come la sopravvivenza, la proliferazione e / o la differenziazione, è necessario essere in grado di confrontare i lobi tettoli innervati e denervati all'interno dello stesso animale e tra gli animali.

La rimozione chirurgica di un occhio dal pesce zebra larvale vivente seguita dall'osservazione del tectum ottico raggiunge questo obiettivo. Il video di accompagnamento dimostra come anestetizzare le larve, affilare elettroliticamente gli aghi di tungsteno e usarli per rimuovere un occhio. Successivamente mostra come sezionare il cervello dalle larve fisse di zebrafish. Infine, il video fornisce una panoramica del protocollo per l'immunoistochimica e una dimostrazione di come montare embrioni colorati in agarosio a basso punto di fusione per la microscopia.

Introduzione

L'obiettivo di questo metodo è quello di indagare come l'input retinico influenza la crescita e lo sviluppo del tectum ottico, il centro di elaborazione visiva nel cervello del pesce zebra. Rimuovendo un occhio e quindi confrontando i due lati del tectum ottico, è possibile osservare e normalizzare i cambiamenti tectali all'interno dello stesso campione, consentendo il confronto tra più campioni. I moderni approcci molecolari combinati con questa tecnica forniranno informazioni sui meccanismi alla base della crescita e dello sviluppo del sistema visivo, nonché della degenerazione e rigenerazione assonale.

I sistemi sensoriali - visivi, uditivi e somatosensoriali - raccolgono informazioni dagli organi esterni e trasmettono tali informazioni al sistema nervoso centrale, generando "mappe" del mondo esterno attraverso il mesencefalo ^1,2. La visione è la modalità sensoriale dominante per quasi tutti i vertebrati, compresi molti pesci. La retina, il tessuto neurale dell'occhio, raccoglie informazioni con un circuito neuronale costituito principalmente da fotorecettori, cellule bipolari e cellule gangliari retiniche (RGC), i neuroni di proiezione della retina. Gli RGC hanno lunghi assoni che trovano la loro strada attraverso la superficie interna della retina fino alla testa del nervo ottico, dove si fascicolano e viaggiano insieme attraverso il cervello, terminando infine nel centro di elaborazione visiva nel mesencefalo dorsale. Questa struttura è chiamata tectum ottico nei pesci e in altri vertebrati non mammiferi ed è omologa al collicolo superiore nei mammiferi³.

Il tectum ottico è una struttura multistrato bilateralmente simmetrica nel mesencefalo dorsale. Nel pesce zebra e nella maggior parte degli altri pesci, ogni lobo del tectum ottico riceve input visivi esclusivamente dall'occhio controlaterale, in modo tale che il nervo ottico sinistro termina nel lobo tectale destro e il nervo ottico destro termina nel lobo tectale sinistro⁴ (Figura 1). Come la sua controparte mammifera, il collicolo superiore, il tectum ottico integra le informazioni visive con altri input sensoriali, tra cui l'audizione e la somatosensazione, controllando i cambiamenti nell'attenzione visiva e nei movimenti oculari come le saccadi ^1,5,6. Tuttavia, a differenza del collicolo superiore dei mammiferi, il tectum ottico genera continuamente nuovi neuroni e glia da una nicchia di cellule staminali specializzate vicino ai bordi mediali e caudali dei lobi tettoli chiamati zona di proliferazione tectale⁷. Il mantenimento dei progenitori proliferativi nel tectum ottico e in altre regioni del sistema nervoso centrale contribuisce, in parte, alla notevole capacità rigenerativa documentata nel pesce zebra⁸.

Lavori precedenti che esaminano il cervello di pesci ciechi o con un occhio solo hanno rivelato che la dimensione del tectum ottico è direttamente proporzionale alla quantità di innervazione retinica che riceve ^9,10,11. Nei pesci delle caverne adulti, i cui occhi degenerano nell'embriogenesi precoce, il tectum ottico è notevolmente più piccolo di quello dei pesci di superficie strettamente imparentati e vedenti⁹. La degenerazione dell'occhio di pesce delle caverne può essere bloccata sostituendo la lente endogena con una lente da un pesce di superficie durante l'embriogenesi. Quando questi pesci delle caverne con un occhio solo vengono allevati fino all'età adulta, il lobo tectale innervato contiene circa il 10% in più di cellule rispetto al lobo tectale non innervato⁹. Allo stesso modo, nei killifish larvali che sono stati incubati con trattamenti chimici per generare occhi di dimensioni diverse all'interno dello stesso individuo, il lato del tectum con più innervazione era più grande e conteneva più neuroni¹⁰. Le prove degli esperimenti di schiacciamento del nervo ottico nel pesce rosso adulto indicano che l'innervazione promuove la proliferazione, con la proliferazione delle cellule tettoniche che diminuisce quando l'innervazione è stata interrotta¹¹.

Confermando ed estendendo questi studi classici, diversi rapporti recenti forniscono dati che suggeriscono che la proliferazione in risposta all'innervazione è modulata, almeno in parte, dalla via BDNF-TrkB^12,13. Rimangono molte domande aperte sulla crescita e lo sviluppo del tectum ottico, incluso il modo in cui un sistema sensoriale in via di sviluppo affronta la degenerazione di lesioni e assoni, quali segnali cellulari e molecolari consentono l'input retinico per regolare la crescita del tectum ottico, quando questi meccanismi diventano attivi e se la proliferazione e la differenziazione legate all'innervazione consentono alla retina e al suo tessuto bersaglio di coordinare i tassi di crescita e garantire un'accurata mappatura retinotopica. Inoltre, ci sono domande molto più grandi sullo sviluppo dipendente dall'attività che possono essere affrontate interrogando il sistema visivo del pesce zebra con approcci chirurgici come quello descritto di seguito.

Per studiare i meccanismi cellulari e molecolari con cui l'attività neurale, in particolare dall'input visivo, altera la sopravvivenza e la proliferazione cellulare, l'approccio descritto confronta direttamente i lobi tettoli innervati e denervati (Figura 1) all'interno delle singole larve di zebrafish. Questo metodo consente la documentazione della degenerazione dell'assone RGC nel tectum ottico e la conferma che il numero di cellule mitotiche è correlato all'innervazione.

Figura 1: Schizzi di larve di zebrafish prima e dopo la rimozione unilaterale dell'occhio. (A) Disegno di 5 larve dpf viste al microscopio di dissezione. Ogni larva è incorporata in agarosio a basso punto di fusione e orientata lateralmente prima che un ago di tungsteno con una punta affilata e uncinata venga utilizzato per estrarre l'occhio rivolto verso l'alto (occhio sinistro in questo esempio). (B) Disegno della vista dorsale di una larva di 9 dpf risultante dall'intervento chirurgico raffigurato in A. Solo tre assoni RGC altamente schematizzati dall'occhio destro sono mostrati defascicolare e connettersi con i neuroni nel lobo tectale sinistro. Abbreviazioni: dpf = giorni dopo la fecondazione; dps = giorni dopo l'intervento; RGC = cellule gangliari retiniche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

I metodi in questo documento sono stati condotti in conformità con le linee guida e l'approvazione dei comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali del Reed College e dell'University College di Londra. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sui ceppi di zebrafish utilizzati in questo studio.

1. Preparare materiali e strumenti

1. Crea soluzioni.
   1. Creare un mezzo embrionale (E3¹⁴) diluendo un calcio 60x (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-diidrato e 20 mM MgCl_2-esaidrato in acqua deionizzata, autoclavata e conservata a temperatura ambiente). Aggiungere 160 mL di 60x E3 a 10 L di acqua deionizzata. Conservare a temperatura ambiente.
   2. Produrre agarosio a basso punto di fusione (LMP) all'1% in E3. Sciogliere 1 g di agarosio LMP in 100 ml di E3 facendo bollire nel microonde per 1-2 minuti ad alta potenza. Aliquotare l'agarosio fuso in tubi di microfuga da 1,7 mL e conservare a 4 °C. Far bollire a bagnomaria e tenere in un blocco di calore a 40 °C quando è pronto per l'uso per l'incorporamento.
   3. Produrre marc's Modified Ringers (MMR¹⁵) soluzione isotonica diluendo un calcio 10x (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO₄, 20 mM CaCl 2-diidrato, 50 mM HEPES, pH regolato a 7,5 con 10 M NaOH, quindi autoclavato e conservato a temperatura ambiente). Aggiungere 10 ml di 10x MMR a 90 ml di acqua deionizzata.
2. Versare le piastre Sylgard secondo le istruzioni del produttore, consentendo loro di fissare e asciugare per diversi giorni¹⁶.
3. Affilare elettroliticamente gli aghi di tungsteno (protocollo modificato da ¹⁷).
   1. In primo luogo, preparare una soluzione koh al 10% (p/v) aggiungendo 200 ml di acqua deionizzata a un barattolo di vetro a bocca larga con coperchio a vite. Mescolare lentamente 20 g di pellet KOH.
      NOTA: Questa soluzione caustica è altamente esotermica. Indossare guanti e protezione per gli occhi e mescolare la soluzione nel cappuccio.
   2. Tagliare una lunghezza di 2-3 cm di filo di tungsteno e inserirlo nel supporto dell'ago.
   3. Collegare i fili del catodo e dell'anodo all'alimentatore. Attaccare la clip a coccodrillo all'estremità del filo catodico a una graffetta parzialmente raddrizzata e inserire la graffetta nella soluzione KOH, attaccandola al lato del barattolo.
   4. Quindi, attaccare la clip alligatore del filo anodico al collo del supporto dell'ago. Accendere l'alimentazione (a ~ 20 V) e immergere il filo di tungsteno nella soluzione KOH, estraendo il filo dalla soluzione ad angolo per affilare elettroliticamente il filo in una punta fine.
      NOTA: le bolle usciranno dalla graffetta mentre la reazione procede.
   5. Controllare la punta dell'ago sotto il microscopio di dissezione per assicurarsi che sia abbastanza affilata.
   6. Risciacquare l'ago con acqua deionizzata per rimuovere tutti i residui di KOH. Fare diversi aghi in anticipo e tenerli fino agli interventi chirurgici larvali e alle dissezioni.
4. Crea vetrini camerati per l'imaging di campioni di zebrafish con un microscopio confocale verticale.
   1. Ottenere vetrini per microscopio in vetro e resina epossidica in due parti (vedere la Tabella dei materiali). Mescolare la resina epossidica secondo le istruzioni sulla confezione e dipingere anelli o rettangoli spessi sui vetrini. Lasciare asciugare le diapositive e asciugare nel cappuccio per almeno 24 ore prima dell'uso.

2. Raccolta e allevamento di embrioni

1. Accoppia pesci maschi e femmine adulti dei genotipi desiderati in scatole di riproduzione nel tardo pomeriggio / prima serata. La mattina dopo, dopo aver deposto le uova, raccogliere le uova appena fecondate con un colino a rete e trasferirle in E3 in piastre di Petri da 100 mm.
2. Incubare gli embrioni a ~27,5 °C con un ciclo di 14 ore di luce/10 ore di buio fino al giorno dell'intervento. Cambia E3 ogni giorno o secondo necessità.
3. Nutrire le larve usando un contagocce pieno di rotiferi raccolti una volta al giorno, a partire da 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) o un giorno dopo l'intervento chirurgico. Dopo che le larve hanno diverse ore per mangiare, cambiare l'E3 per rimuovere eventuali rotiferi rimanenti e prodotti di scarto.
   NOTA: Non nutrire le larve il giorno dell'intervento.

3. Preparare le larve per la chirurgia

1. Il giorno dell'intervento, utilizzare una pipetta Pasteur di vetro a foro largo per trasferire 10-15 larve in una capsula di Petri da 35 mm riempita con E3 fresco.
2. Anestetizzare le larve aggiungendo 3-5 gocce di soluzione di Tricaina allo 0,4% p/v (0,4 g di Tricaina disciolta in 210 mM Tris, pH 9; soluzione finale regolata ad un pH di 7,4 se necessario¹⁸) al piatto per una concentrazione finale di ~0,0015% p/v Tricaina. Cerca la mancanza di risposta al tatto per determinare se le larve sono adeguatamente anestetizzate. Se sono ancora reattivi al tocco dopo ~ 3 minuti, aggiungere altre 2-3 gocce di 0,4% p / v di soluzione di tricaina e rivalutare.
   NOTA: In questa fase dello sviluppo, è possibile monitorare il flusso sanguigno e la frequenza cardiaca oltre alla motilità al microscopio sezionante.
3. Immobilizzare le larve di zebrafish anestetizzate incorporandole in agarosio LMP all'1% disciolto in E3.
   1. Per prima cosa, posizionare il coperchio di una capsula di Petri da 35 mm rivolto verso l'alto sotto il microscopio di dissezione. Quindi, prendi una larva in una pipetta Pasteur di vetro a foro stretto con solo una piccola quantità di E3.
   2. Quindi, aspirare ~ 200 μL di agarosio LMP fuso, caldo (~ 40 ° C) 1% nella pipetta con la larva. Infine, spruzzare la larva e l'agarosio sul coperchio capovolto della capsula di Petri.
   3. Usa un ago di tungsteno opaco per manovrare rapidamente ma delicatamente la larva in modo che sia laterale, con un occhio rivolto verso l'alto. Attendere che l'agarosio si imposti (~ 5 min).
      NOTA: Se l'agarosio si indurisce mentre la larva non è laterale, liberarla dall'agarosio (come descritto nel passaggio 5) e riportarla nel piatto con E3 e tricaina.

4. Rimozione degli occhi

1. Una volta che l'agarosio è impostato e la larva è posizionata lateralmente, utilizzare la punta di un ago di tungsteno molto fine e affilato elettroliticamente per perforare la pelle intorno all'occhio, seguendo il bordo dell'orbita dell'occhio.
2. Quindi, far scorrere il bordo dell'ago (non la punta) sotto l'occhio dal lato temporale-ventrale dell'occhio. Utilizzare una pressione controllata per rilasciare l'occhio dalla presa.
3. Utilizzare pinze chirurgiche molto fini per rimuovere l'occhio pizzicando il nervo ottico e spingendo l'occhio da mediale a laterale. In alternativa, continua semplicemente a premere l'occhio dorsalmente e anteriormente con il lato dell'ago, alla fine tagliando attraverso il nervo ottico e rilasciando l'occhio.
   NOTA: Se i tessuti diversi dall'occhio vengono accidentalmente pugnalati durante l'intervento chirurgico, uccidere rapidamente e umanamente la larva con una rapida decapitazione.

5. Cura postoperatoria fino all'endpoint sperimentale

1. Dopo aver superato con successo la rimozione degli occhi, coprire l'agarosio con la soluzione MMR.
2. Libera ogni larva dall'agarosio spazzolando delicatamente un ago di tungsteno intorno alla testa e poi intorno al corpo mentre stabilizza il coperchio della capsula di Petri con una pinza.
3. Trasferire le larve con un occhio solo in una capsula di Petri da 35 mm che contiene MMR integrata con una diluizione 1:100 di un cocktail di penicillina / streptomicina. Incubare gli embrioni a ~27,5 °C con un ciclo di 14 ore di luce/10 ore di buio.
   NOTA: Questa soluzione isotonica di MMR integrata con antibiotici inizialmente aiuta la guarigione e la sopravvivenza larvale. Ogni piatto può contenere fino a 15 larve di recupero.
4. Il giorno dopo, riporta le larve all'E3. A partire dal pomeriggio successivo all'intervento chirurgico, nutrire le larve (~ 6 dpf e oltre) usando un contagocce pieno di rotiferi raccolti una volta al giorno. Dopo che le larve hanno avuto diverse ore per mangiare, cambiare l'E3 per rimuovere eventuali rotiferi rimanenti e prodotti di scarto.

6. Fissaggio delle larve

1. Una volta che le larve hanno raggiunto lo stadio di sviluppo desiderato per l'analisi, anestetizzatele con una dose letale di tricaina (~ 0,4% concentrazione finale) fino a quando i loro cuori si sono fermati.
2. Pipetta fino a 30 larve per tubo di microfuga da 1,5 ml. Rimuovere l'eccesso di E3 e quindi aggiungere 0,5-1 mL di soluzione fissativa (4% paraformaldeide (PFA) e 4% saccarosio in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)) per fissare il tessuto. Incubare le larve durante la notte a 4 °C.
3. Lavare le larve con PBS il giorno successivo rimuovendo il fissativo e risciacquando le larve 3-4 volte con PBS. Conservare le larve a 4 °C per un massimo di 7 giorni prima della dissezione.

7. Sezionare le larve per rivelare il cervello (adattato da ¹⁵)

1. Sospendere le larve fisse in goccioline PBS su una piastra Sylgard sotto un microscopio sezionante. Fissarli lateralmente posizionando due perni di tungsteno (tipicamente vecchi aghi di tungsteno che sono inferiori a 2 cm) attraverso la notocorda, con un perno appena posteriore all'area pigmentata che copre la regione aorta-gonade-mesonefros (AGM) e un altro in linea con la fine dell'estensione del tuorlo.
   NOTA: Posizionare i perni di tungsteno nel minor numero possibile di tentativi perché il tessuto diventerà più friabile ad ogni puntura.
2. Utilizzare un ago di tungsteno molto affilato e una pinza affilata per esporre il cervello rimuovendo, in questo ordine, l'occhio (i), l'orecchio, la mascella, il tratto digestivo e la pelle cranica dorsale.
   1. In primo luogo, rimuovere l'occhio utilizzando una tecnica simile alla rimozione chirurgica dell'occhio nel passaggio 4. Quindi, sgancia la larva e capovolgila sul lato opposto, in modo che l'altro occhio sia accessibile e ripetuto. In alternativa, infilare l'ago attraverso la mascella dall'altra parte e rimuovere l'occhio senza staccare.
      NOTA: gli occhi possono essere raccolti a questo punto se si desidera l'analisi di questo tessuto (simile a ¹⁹).
   2. Quindi, utilizzare l'ago di tungsteno per graffiare dal lato temporale a quello ventrale dell'orecchio. Nella stessa azione/movimento, portare l'ago posteriore alla mascella e tirare delicatamente anteriormente fino a rimuovere l'orecchio e la mascella.
   3. Usa una pinza per estrarre gli organi ventrali e l'eventuale tuorlo rimanente.
   4. Infine, fare un'incisione superficiale nella pelle cranica dorsale vicino alla giunzione tra il cervello posteriore e il midollo spinale. Sollevare la pelle con la pinza e tirarla anteriormente e intorno al telencefalo. Se questo si rivela troppo difficile, iniziare dall'incisione iniziale nel cervello posteriore e tirare la pelle prima lateralmente e poi ventralmente e anteriormente, facendo molta attenzione a non graffiare i bordi laterali del tectum.
      NOTA: Poiché il mesencefalo è oggetto di studio, il cervello posteriore può essere tagliato; tuttavia, un'incisione profonda può provocare la decapitazione.
   5. Rimuovere qualsiasi tessuto rimanente con una pinza. Staccare la larva e trasferirla a PBS in un tubo di microfuga da 1,5 ml.
      NOTA: lasciare la coda attaccata al cervello per una migliore visibilità quando si eseguono protocolli fullmount.

8. Disidratazione e conservazione del cervello

1. Rimuovere PBS dal cervello e aggiungere 1 ml di PBS contenente lo 0,1% di TritonX-100 (PBST). Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
2. Rimuovere il PBST e sostituirlo con una soluzione 50:50 metanolo:PBST. Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
3. Lavare il cervello con metanolo al 100% (MeOH) due volte per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente.
4. Conservare il cervello in MeOH al 100% a -20 °C per almeno 16 ore prima di eseguire l'immunoistochimica o altre procedure integrali.
   NOTA: I cervelli possono essere conservati in MeOH per un massimo di 2 anni a -20 °C.

9. Immunoistochimica

NOTA: i protocolli stabiliti per molte utili tecniche di montaggio intero in zebrafish possono essere trovati su ZFIN²⁰. Questo manoscritto fornisce esempi che confrontano le larve con un occhio solo e con due occhi che sono state immunocolorate con anticorpi che riconoscono la proteina fluorescente rossa (RFP), che è espressa negli assoni del nervo ottico nella linea Tg[atoh7:RFP] (Figura 2), o l'istone fosforilato H3 (PH3), che evidenzia le cellule mitotiche (Figura 3). Un protocollo immunoistochimico standard per embrioni e larve interi è riassunto di seguito.

1. In primo luogo, reidratare il cervello larvale con una serie graduata di lavaggi MeOH:PBST a temperatura ambiente incubando i campioni in 50:50 MeOH:PBST per 5 min, poi in 30:70 MeOH:PBST per 5 min, e terminando con 3 lavaggi di PBST.
2. Per permeabilizzare il cervello, incubarli in PBST integrato con proteinasi K (PK) ad una concentrazione finale di 20 μg/ml PK per 30 min a 37 °C. Conservare aliquote di 10 mg/mL di PK a -20 °C e scongelarle prima dell'uso.
3. Rimuovere la soluzione di PK e lavare via qualsiasi enzima rimanente risciacquando il cervello con PBST 3 volte nell'arco di 15 minuti.
4. Rifiggere i cervelli permeabilizzati incubandoli in PFA al 4% per 20 minuti a 25 °C (o temperatura ambiente). Quindi, rimuovere il PFA e lavare via qualsiasi fissativo rimanente risciacquando il cervello 3 volte in 15 minuti con PBST.
5. Sostituire il risciacquo PBST finale con tampone immunobloccante (IB) appena fatto (10% siero di capra normale e 1% DMSO in PBST) e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
6. Diluire gli anticorpi primari nel tampone IB alla concentrazione appropriata (ad esempio, 1:500 per RFP e 1:300 per gli anticorpi PH3).
7. Rimuovere il tampone IB dal cervello e sostituirlo con la diluizione anticorpale primaria. Incubare durante la notte a 4 °C su uno shaker orbitale con un leggero dondolo. Assicurarsi che i tubi siano saldamente appoggiati sui lati.
8. La mattina successiva, rimuovere la soluzione anticorpale primaria con una micropipetta, risciacquare un paio di volte in PBST e quindi lavare il cervello in PBST a temperatura ambiente per 4 x 30 minuti.
   NOTA: le diluizioni anticorpali primarie possono essere riutilizzate una volta entro ~7 giorni se conservate a 4 °C.
9. Risciacquare il cervello nel tampone IB mentre si diluiscono gli anticorpi secondari nel tampone IB alla concentrazione appropriata (ad esempio, 1:500 per Alexa-fluor 568 anti-coniglio).
10. Rimuovere il tampone IB e sostituirlo con la diluizione anticorpale secondaria. Incubare durante la notte a 4 °C su uno shaker orbitale con un leggero dondolio dei tubi appoggiati sui lati.
11. La mattina successiva, rimuovere la soluzione anticorpale secondaria, risciacquare con PBST e quindi lavare il cervello in PBST a temperatura ambiente per 4 x 30 minuti.
12. Controcolorazione con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) o ToPro3 (1:5.000 in PBST a 4 °C durante la notte).
13. La mattina successiva, trasferire il cervello larvale in PBS e procedere alle fasi di montaggio e imaging elencate di seguito.

10. Montaggio e imaging

1. Fissare una diapositiva camerata nel coperchio di una capsula di Petri da 100 mm con grasso sottovuoto.
2. Trasferire le larve immunocolorate e lavorate su una piastra di pozzo o un vetrino di depressione per visualizzarle con un microscopio di dissezione.
3. Montare le larve sul vetrino camerato in colonne di agarosio LMP all'1%.
   1. Usando una pipetta Pasteur di vetro, metti una larva sul vetrino camerato, depositando il minor PBS possibile. Con la stessa pipetta, coprire la larva con agarosio LMP fuso all'1% (~ 40 °C).
   2. Con un ago o una pinza di tungsteno smussata, disegnare l'agarosio in una colonna e quindi posizionare la larva nel modo più simmetrico possibile, con la superficie dorsale visibile.
   3. Ripeti questa procedura per le larve rimanenti.
   4. Una volta che l'agarosio si è gelificato, coprirlo con alcune gocce di PBS e poi posizionarlo sul palco del microscopio confocale.
4. Allineare la lente dell'obiettivo con il campione, mettere a fuoco il microscopio utilizzando la luce trasmessa e illuminare il campione con i laser appropriati.
   NOTA: in questo esempio, le lunghezze d'onda di 405 nm e 568 nm sono state utilizzate rispettivamente per eccitare DAPI e RFP.
5. Regolare il guadagno, l'offset e la potenza del laser spostando le barre di scorrimento a un livello appropriato rispetto al segnale e al rilevatore utilizzato. Controllare gli istogrammi per ciascun canale e fare clic sul pulsante Indicatore di stato di saturazione sopra l'immagine per misurare il livello di esposizione, assicurandosi che nessuno dei pixel sia saturo e che il rapporto segnale-rumore sia elevato. Per un esempio di parametri di imaging confocale ottimali per la risoluzione cellulare e subcellulare all'interno del pesce zebra, vedere ²¹.
6. Impostare i limiti superiore e inferiore della pila di piani z utilizzando la rotellina di scorrimento del mouse per trovare la parte superiore e inferiore del campione. Fare clic sui limiti superiore e inferiore per l'acquisizione delle immagini, quindi attivare l'acquisizione z-stack facendo clic sul pulsante Esegui ora .
   NOTA: A seconda di quanto simmetricamente è montato il cervello, la profondità z totale per un cervello larvale di zebrafish da 9 dpf sarà ~ 150-200 μm.
7. Elabora e colora le immagini tenendo presente l'accessibilità daltonica (ad esempio, usa blu e arancione o magenta e verde per le immagini a due colori). Imposta le tabelle di ricerca nel software utilizzato per acquisire le immagini o il software di elaborazione delle immagini come Photoshop da Adobe.
8. In Photoshop, fotomicrografie raw a colori salvate come TIFF (Tagged Image File Format) a 8 bit (i) convertendo la modalità immagine in RGB e (ii) accedendo all'opzione Curve sotto image | Regola i menu e poi (iii) fa scorrere le emissioni di luce colorata appropriate a 0 o 255 livelli per ottenere il colore desiderato. Ad esempio, per ottenere un segnale verde, selezionare il canale rosso e far scorrere la sua uscita su 0; quindi, seleziona il canale blu e fai scorrere anche il suo output su 0 . Allo stesso modo, per ottenere un segnale magenta, selezionare il canale Verde e far scorrere la sua uscita su 0; lascia i canali rosso e blu così come sono.
   NOTA: Passaggi simili possono essere eseguiti nel programma gratuito Gnu Image Manipulation Program (GIMP).
9. Quantificare manualmente il numero di celle che visualizzano un marcatore specifico utilizzando il plug-in del contatore di celle in ImageJ²², disponibile in Analizza nel menu Plugin. Esempi di come utilizzare ImageJ per il conteggio delle celle possono essere trovati in molti tutorial, tra cui ²³.
10. Generare rappresentazioni grafiche dei dati in software statistici come RStudio (vedere dati supplementari per . Rmd).

Risultati

Per confermare se la rimozione dell'occhio fosse completa e valutare come cambia il tectum ottico, sono stati eseguiti interventi chirurgici nel ceppo Tg[atoh7:RFP], che etichetta tutti gli RGC con una RFP mirata alla membrana e, quindi, tutti gli assoni che proiettano dalla retina e formano il nervo ottico²⁴. Sebbene l'uso di questo ceppo non sia assolutamente necessario, consente l'osservazione e la visualizzazione semplici dei termini del nervo ottico nel neuropil del tectum ottico. Sa...

Discussione

Le tecniche descritte in questo articolo illustrano uno dei tanti approcci per lo studio dello sviluppo del sistema visivo dei vertebrati nel pesce zebra. Altri ricercatori hanno pubblicato metodi per sezionare la retina embrionale ed eseguire analisi di espressione genica¹⁹ o visualizzare l'attività neuronale nel tectum ottico³⁰. Questo documento fornisce un approccio per esplorare come l'input retinico differenziale può influenzare i comportamenti cellulari nel tectum o...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and supplies:
Breeding boxes	Aquaneering	ZHCT100
Dow Corning high vacuum grease	Sigma or equivalent supplier	Z273554
Erlenmeyer flasks (125 mL)			For making Marc's Modified Ringers (MMR) with antibiotics for post-surgery incubation
Fine forceps - Dumont #5	Fine Science Tools (FST)	11252-20
Glass Pasteur pipettes	DWK Lifescience	63A53 & 63A53WT	For pipetting embryos and larvae
Glass slides for microscopy	VWR or equivalent supplier	48311-703	Standard glass microscope slides can be ordered from many different laboratory suppliers.
Glassware including graduated bottles and graduated cylinders			For making and storing solutions
2-part epoxy resin	ACE Hardware or other equivalent supplier of Gorilla Glue or equivalent	0.85 oz syringe	https://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	VWR or equivalent supplier	22234-046
Nickel plated pin holder (17 cm length)	Fine Science Tools (FST)	26018-17	To hold tungsten wire while sharpening and performing surgeries/dissections.
Nylon mesh tea strainer or equivalent	Ali Express or equivalent		For harvesting zebrafish eggs after spawning; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
Paper clip			For Tungsten needle sharpening device.
Petri dishes 100 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	50-190-0267
Petri dishes 35 mm	Fischer Scientific or equivalent supplier	08-757-100A
Pipette pump	SP Bel-Art or equivalent	F37898-0000
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma	909122	For Tungsten needle sharpening device. Make a 10% w/v solution of KOH in the hood by adding pellets to deionized water.
Power supply (variable voltage)			For Tungsten needle sharpening device. Any power supply with variable voltage will work (even one used for gel electrophoresis).
Sylgard 184 Elastomer kit	Dow Corning	3097358
Tungsten wire (0.125 mm diameter)	World Precision Instruments (WPI)	TGW0515	Sharpen to remove eye and dissect larvae.
Variable temperature heat block	The Lab Depot or equivalent supplier	BSH1001 or BSH1002	Set to 40-42 °C ahead of experiments.
Wide-mouth glass jar with lid (e.g., clean jam or salsa jar)			For Tungsten needle sharpening device.
Wires with alligator clip leads			For Tungsten needle sharpening device.
Microscopes:
Dissecting microscope			Any type will work but having adjustable transmitted light on a mirrored base is preferred.
Laser scanning confocal microscope			High NA, 20-25x water dipping objective lens is recommended. Microscope control and image capture software (Elements) is used here but any confocal microscope will work.
Reagents for surgeries and dissections:
Calcium chloride dihydrate	Sigma	C7902	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
HEPES	Sigma	H7006	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Low melting point agarose	Invitrogen	16520-050	Make 1% in embryo medium (E3) or Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	1374248	For embryo medium (E3).
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	For Marc's Modified Ringers (MMR).
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210	Dilute 8% (w/v) stock with 2x concentrated PBS (diluted from 10x PBS stock).
Penicillin/Streptomycin	Sigma	P4333-20ML	Dilute 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Phosphate buffered saline (PBS) tablets	Diagnostic BioSystems	DMR E404-01	Make 10x stock in deionized water, autoclave and store at room temperature. Dilute to 1x working concentration.
Potassium chloride	Sigma	P3911	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium chloride	Sigma	S9888	For Marc's Modified Ringers (MMR) and embryo medium (E3).
Sodium hydroxide	Sigma	S5881	Make 10 M and use to adjust pH of MMR to 7.4.
Sucrose	Sigma	S9378
Tricaine-S	Pentair	100G #TRS1	Recipe: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagents for immunohistochemistry:
Alexafluor 568 tagged Secondary antibody to detect rabbit IgG	Invitrogen	A-11011	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
DAPI or ToPro3	Invitrogen	1306 or T3605	Make up 1 mg/mL solutions in DMSO; 1:5,000 dilution for counterstaining.
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	A component of immunoblock buffer.
Methanol (MeOH)	Sigma	34860	Mixing MeOH with aqueous solutions like PBST is exothermic. Make the MeOH/PBST solutions at least several hours ahead of time or cool them on ice before using.
Normal goat serum	ThermoFisher Scientific	50-062Z	A component of immunoblock buffer. Can be aliquoted in 1-10 mL volumes and stored at -20 °C.
Primary antibody to detect phosphohistone H3	Millipore	06-570	Use at 1:300 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Primary antibody to detect Red Fluorescent Protein (RFP; detects dsRed derivatives)	MBL International	PM005	Use at 1:500 dilution for wholemount immunohistochemistry.
Proteinase K (PK)	Sigma	P2308-10MG	Make up 10 mg/mL stock solutions in PBS and use at 10 µg/mL.
Triton X-100	Sigma	T8787	Useful to make a 20% (v/v) stock solution in PBS.
Software for data analysis
ImageJ (Fiji)			freeware for image analysis; https://imagej.net/software/fiji/
Rstudio			freeware for statistical analysis and data visualization; https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
Adobe Photoshop or GIMP			Proprietary image processing software (Adobe Photoshop and Illustrator) are often used to compose figures). A freeware alternative is Gnu Image Manipulation Program (GIMP; https://www.gimp.org/)
Zebrafish strains			available from the  Zebrafish International Resource Centers in the US (https://zebrafish.org/home/guide.php) or in Europe (https://www.ezrc.kit.edu/). Specialized transgenic strains that have not yet been deposited in either resource center can be requested from individual labs after publication.