הקמה ואפיון של מודלים של קסנוגרפט שמקורם במטופל של קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס וקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מבסס ומאפיין מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל (PDX) של קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס (ATC) וקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC), כאשר מודלים של PDX הופכים במהירות לסטנדרט בתחום האונקולוגיה התרגומית.

Abstract

מודלים של קסנוגרפט הנגזר מהמטופל (PDX) משמרים נאמנה את המאפיינים ההיסטולוגיים והגנטיים של הגידול הראשוני ושומרים על ההטרוגניות שלו. תוצאות פרמקודינמיות המבוססות על מודלים של PDX נמצאות בקורלציה גבוהה עם פרקטיקה קלינית. קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס (ATC) היא תת-הסוג הממאיר ביותר של סרטן בלוטת התריס, עם פולשניות חזקה, פרוגנוזה גרועה וטיפול מוגבל. למרות ששיעור ההיארעות של ATC מהווה רק 2%-5% ממקרי סרטן בלוטת התריס, שיעור התמותה שלו גבוה עד 15%-50%. קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC) היא אחת הממאירויות הנפוצות ביותר בראש ובצוואר, עם מעל 600,000 מקרים חדשים ברחבי העולם מדי שנה. כאן, פרוטוקולים מפורטים מוצגים כדי לקבוע מודלים PDX של ATC ו- HNSCC. בעבודה זו נותחו גורמי המפתח המשפיעים על שיעור ההצלחה של בניית המודל, והושוו המאפיינים ההיסטופתולוגיים בין מודל PDX לבין הגידול הראשוני. יתר על כן, הרלוונטיות הקלינית של המודל אומתה על ידי הערכת היעילות הטיפולית in vivo של תרופות מייצגות בשימוש קליני במודלים PDX שנבנו בהצלחה.

Introduction

מודל PDX הוא מודל חייתי שבו רקמת גידול אנושית מושתלת בעכברים מדוכאי חיסון וגדלה בסביבה שמספקים העכברים¹. מודלים מסורתיים של קו תאי גידול סובלים ממספר חסרונות, כגון חוסר הטרוגניות, חוסר היכולת לשמור על המיקרו-סביבה של הגידול, הפגיעות לשינויים גנטיים במהלך מעברים חוזרים במבחנה, והיישום הקליני הלקוי ^2,3. החסרונות העיקריים של מודלים מהונדסים גנטית של בעלי חיים הם אובדן פוטנציאלי של התכונות הגנומיות של גידולים אנושיים, הכנסת מוטציות חדשות ולא ידועות, והקושי לזהות את מידת ההומולוגיה בין גידולי עכברים לגידולים אנושיים⁴. בנוסף, הכנת מודלים של בעלי חיים מהונדסים גנטית היא יקרה, גוזלת זמן ויחסית לא יעילה⁴.

למודל PDX יתרונות רבים על פני מודלים אחרים של גידולים מבחינת שיקוף הטרוגניות הגידול. מנקודת המבט של היסטופתולוגיה, למרות שמקבילו העכבר מחליף את הסטרומה האנושית לאורך זמן, מודל PDX משמר היטב את המבנה המורפולוגי של הגידול הראשוני. בנוסף, מודל PDX משמר את הזהות המטבולית של הגידול הראשוני למשך ארבעה דורות לפחות ומשקף טוב יותר את יחסי הגומלין המורכבים בין תאי הגידול לבין המיקרו-סביבה שלהם, מה שהופך אותו לייחודי בהדמיית גידול, גרורות, אנגיוגנזה ודיכוי חיסוני של רקמת גידול אנושית ^5,6,7. ברמה התאית והמולקולרית, מודל PDX משקף במדויק את ההטרוגניות הבין-גידולית והתוך-גידולית של גידולים אנושיים, כמו גם את המאפיינים הפנוטיפיים והמולקולריים של הסרטן המקורי, כולל דפוסי ביטוי גנים, מצב מוטציה, מספר העתק, מתילציה של DNA ופרוטאומיקה ^8,9. מודלים של PDX עם מעברים שונים הם בעלי אותה רגישות לטיפול תרופתי, מה שמצביע על כך שביטוי הגנים של מודלים PDX יציב מאוד^10,11. מחקרים הראו מתאם מצוין בין התגובה של מודל PDX לתרופה לבין התגובה הקלינית של חולים לתרופה^{זו 12,13}. לכן, מודל PDX התגלה כמודל מחקר פרה-קליני ותרגומי רב עוצמה, במיוחד עבור סינון תרופות וחיזוי פרוגנוזה קלינית.

סרטן בלוטת התריס הוא גידול ממאיר שכיח של המערכת האנדוקרינית והוא ממאירות אנושית שהראתה עלייה מהירה בהיארעות בשנים האחרונות¹⁴. קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס (ATC) היא סרטן בלוטת התריס הממאיר ביותר, עם הישרדות חולה חציונית של 4.8 חודשים בלבד¹⁵. למרות שרק מיעוט מחולי סרטן בלוטת התריס מאובחנים עם ATC מדי שנה בסין, שיעור התמותה קרוב ל -^{100% 16,17,18}. ATC בדרך כלל גדל במהירות ופולש לרקמות הסמוכות של הצוואר כמו גם לבלוטות הלימפה הצוואריות, וכמחצית מהחולים סובלים מגרורות מרוחקות^19,20. קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC) היא הסרטן השישי בשכיחותו בעולם ואחד הגורמים המובילים למוות מסרטן, עם הערכה של 600,000 אנשים הסובלים מ- HNSCC מדי שנה^21,22,23. HNSCC כולל מספר רב של גידולים, כולל אלה באף, בסינוסים, בפה, בשקדים, בלוע ובגרון²⁴. ATC ו- HNSCC הן שתיים מהממאירויות העיקריות בראש ובצוואר. על מנת להקל על פיתוחם של חומרים טיפוליים חדשניים וטיפולים מותאמים אישית, יש צורך לפתח מודלים פרה-קליניים חזקים ומתקדמים לבעלי חיים, כגון מודלים PDX של ATC ו-HNSCC.

מאמר זה מציג שיטות מפורטות לביסוס מודל PDX תת-עורי של ATC ו-HNSCC, מנתח את גורמי המפתח המשפיעים על קצב לקיחת הגידול בבניית המודל, ומשווה את המאפיינים ההיסטופתולוגיים בין מודל PDX לבין הגידול הראשוני. בינתיים, בעבודה זו, בדיקות פרמקודינמיות in vivo בוצעו באמצעות מודלים PDX שנבנו בהצלחה על מנת לאמת את הרלוונטיות הקלינית שלהם.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים של האגודה להערכה והסמכה לטיפול בחיות מעבדה שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברים מדוכאי חיסון NOD-SCID בגילאי 4-6 שבועות (משני המינים) ובנקבות עכברים עירומים בגילאי 4-6 שבועות. בעלי החיים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). ועדת האתיקה של בית החולים במערב סין אישרה את המחקר עם נבדקים אנושיים (פרוטוקול מספר 2020353). כל מטופל נתן הסכמה מדעת בכתב.

1. הכנה ניסיונית

1. סדרו להבים חד פעמיים, מספריים ופינצטה מעוקרים ומכשירים אחרים הדרושים להשתלת גידול, הניחו אותם על שולחן העבודה הנקי במיוחד והקרינו אותם מראש באור אולטרה סגול.
2. הכינו תמיסת מלח סטרילית וכלי פטרי לשימוש במהלך הבדיקה.

2. רכישה והובלה של רקמת גידול טרייה

1. יש לקחת דגימות גידול טריות (בדרך כלל גדולות מ-5 מ"מ x 5 מ"מ) מחדר הניתוח, ולהניחן בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל או 50 מ"ל המכיל תמיסת HTK סטרילית (ראה טבלת חומרים) או מלוחים. תייגו את צינורות הצנטריפוגות.
   הערה: דגימות גידול טריות התקבלו על ידי הסרה כירורגית או ניקוב מחולים עם ATC או HNSCC.
2. הכניסו את צינורות הצנטריפוגות לקופסת קרח שהוכנה מראש.
   הערה: במהלך תקופה זו, על מפעיל ההשתלה להכין את הפריטים הדרושים להשתלה (ראה טבלת חומרים).
3. יש לוודא שהזמן בין איסוף הדגימות להעברתן למעבדה לבניית PDX אינו עולה על שעתיים. במהלך ההובלה, הקיפו את הצינורות המכילים את הרקמות בתערובת מי קרח או חבילות קרח כדי לשמר את פעילות הרקמות.

3. השתלת גידול

1. ברגע שרקמות הגידול מגיעות למעבדה, רשמו וספרו אותן מחדש.
   הערה: במחקר הנוכחי, המידע על המטופל נשמר בסודיות מוחלטת. שאר שלבי ההליך בוצעו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). בעת הכניסה למעבדה מומלץ ללבוש עשן מעל בגדי העבודה או בגדי מגן, כובע ומסכה. הטיפול ברקמת הגידול מתבצע בארון בטיחות ביולוגית.
2. יש לחטא את צינורות הצנטריפוגות המכילות את רקמות הגידול ב-75% אלכוהול, ולהניח אותן על שולחן הניתוחים. מעבירים את רקמות הגידול לצלחות פטרי 6 ס"מ מלאות במי מלח באמצעות מלקחיים אופתלמיים מעוקרים. לאחר מכן, לחתוך אותם לחתיכות קטנות של כ 2 מ"מ x 2 מ"מ ו 3 מ"מ x 3 מ"מ באמצעות להב.
3. מעבירים את חתיכות רקמות הגידול לצלחת פטרי בקוטר 6 ס"מ המכילה את כמות המלח המתאימה, עוטפים את הצלחת בסרט האיטום, מניחים אותה בקופסת קרח ונושאים אותה לחדר בעלי חיים ספציפי נטול פתוגן (SPF) יחד עם המכשירים הדרושים (זוג מספריים, מלקחיים ומחטי חיסון).
4. הכינו את בעל החיים לפי השלבים הבאים.
   1. הסר את השיער בבית החזה הצדדי הימני של עכברים מדוכאי חיסון NOD-SCID בני 4-6 שבועות, וחטא את העור עם 75% אלכוהול. יש להרדים את העכברים על ידי הזרקה תוך צפקית של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו-10 מ"ג/ק"ג קסילזין (ראו טבלת חומרים), ולמרוח את עיניהם במשחה וטרינרית למניעת יובש. יש לוודא את עומק ההרדמה באמצעות איבוד רפלקס הדוושה.
   2. בצע חתך 2 מ"מ עם מספריים דרך העור באמצע בית החזה הצדדי הימני של עכברים.
5. קחו חתיכת גידול מצלחת הפטרי, והכניסו אותה למחט טרוקאר בגודל 2.4 מ"מ x 2.0 מ"מ (ראו טבלת חומרים) בעזרת מלקחיים.
6. החזיקו את העכבר, הדקו את העור באתר הניקוב, השתמשו בטרוקאר המכיל את חתיכות הגידול כדי להחדיר את הגידול דרך חתך העור הראשוני בקוטר 2 מ"מ, עברו לחלק האחורי של הכתף ודחפו את ליבת הטרוקאר.
7. ודא כי חתיכת הגידול נדחף החוצה ונשאר בסינוס המעבר שנוצר על ידי נקב הטרוקאר, ולאחר מכן למשוך את הטרוקאר.
8. אם הגידול נע עם המחט כאשר הוא נסוג, השתמש בטרוקאר כדי לאפס אותו ולתפור את החתך.
   הערה: במחקר זה, כל עכבר חוסן בגפיים הקדמיות והאחוריות הגב. אחד עד שלושה עכברים חוסנו לכל דגימת גידול מכל חולה בהתבסס על גודל הגידול.

4. שימור רקמת גידול, קיבוע והקפאת חלבונים

הערה: שאר רקמות הגידול שימשו לשימור זרעים, קיבוע והקפאת DNA/RNA/חלבון, בהתאמה.

1. הסר את המלח מפני השטח של הגידול עם גזה סטרילית לפני הצבתו בצינור ההקפאה כדי להבטיח שמשטח הגידול אינו רטוב מדי.
2. שים ארבע עד שש חתיכות של רקמת גידול בגודל 2 מ"מ x 2 מ"מ בצינור שימור קריוגני של תאים בנפח 2 מ"ל, הוסף 1 מ"ל של תמיסת שימור קריוגנית המורכבת מ-90% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) לתוך הצינור, הכנס את הצינור לקופסת קירור הדרגתית, הקפיא אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולבסוף, העבירו אותו לחנקן נוזלי.
3. מניחים את גושי רקמת הגידול בגודל 3 מ"מ x 3 מ"מ בפורמלין חוצץ 10% לקיבוע רקמות לבדיקה פתולוגית.
4. הכנס את בלוק הרקמה בגודל 3 מ"מ x 3 מ"מ לתוך צינור שימור קריוגני של תאים בנפח 2 מ"ל, הקפיא אותו במהירות בחנקן נוזלי ולאחר מכן העבר למקרר של -80 מעלות צלזיוס לצורך מיצוי DNA/RNA וחלבונים.
5. לאסוף את המידע הקליני של החולים, כגון היסטוריית העישון, גודל הגידול, התמיינות, תת-סוג פתולוגי, דרגת סרטן, שלב סרטן, גרורות מרוחקות, מוצא, היסטוריה רפואית, אימונוהיסטוכימיה, זיהום בנגיף הפפילומה האנושי (HPV) בחולי HNSCC ותרופות טיפוליות.

5. העברה, הקפאה והחייאה של גידולים מודל PDX

1. למדוד את אורך ורוחב הגידולים התת עוריים בעכברים באמצעות קליפרים ורנייר פעם בשבוע, ולחשב את נפח הגידול על פי הנוסחה: נפח הגידול = 0.5 × אורך × רוחב². צייר את עקומת הצמיחה של הגידול.
2. כאשר הגידול PDX מגיע ל-2,000 מ"מ³, מעבירים אותו לדור הבא של עכברים, ומבצעים השתלה חוזרת של הגידול. בצע את הכנת המכשירים לאחר שלב 4.
3. הרדימו את העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם לאחר הרדמה עם 80 מ"ג / ק"ג קטמין.
4. יש לחטא את העור עם 75% אלכוהול. לאחר מכן, לחתוך את העור סביב הגידול באמצעות מספריים, ולאחר מכן להסיר את הגידול עם מלקחיים, ומניחים אותו בצלחת פטרי.
5. בצע את הליך השתלת הגידול לאחר שלב 3.
6. בצע שימור והקפאה של גידולים מודל PDX לאחר שלב 4.
7. עבור החייאה של רקמת הגידול, בצע את העיקרון של הקפאה איטית התמוססות מהירה. לאחר הוצאת cryovials מחנקן נוזלי, במהירות לשים אותם באמבט מים ב 37 ° C להתמוססות מהירה.
8. נערו בעדינות את הקריובלים באמבט המים כדי להאיץ את תהליך ההפשרה.
9. מפשירים, מעבירים את חתיכות הגידול לתמיסת מלח רגילה מוכנה לשטיפה, ואז מחסנים את הדור הבא של העכברים. עבור הניתוח הספציפי, אנא עיין בהליך השתלת הרקמה בשלב 3.

6. קביעת היעילות הטיפולית של לנווטיניב וציספלטין במודל ATC PDX

הערה: מודל ATC PDX שימש לבדיקת ההשפעה הטיפולית של מעכב טירוזין קינאז לנווטיניב והתרופה הכימותרפית ציספלטין^25,26,27.

1. בחר את רקמת הגידול מדור P5 של דגם ATC PDX (THY-017), חתוך ל-2-4 מ"מ 3 חתיכות רקמה, וחסן תת עורית (שלב³ ) לגב הימני של עשר נקבות עכברים עירומות בנות 4-6 שבועות.
2. בחר 15 עכברים עם נפח הגידול בין 50-150 מ"מ³, ולחלק אותם לשלוש קבוצות.
3. יש לתת לנווטיניב (10 מ"ג/ק"ג) תוך גסטרית לקבוצה אחת פעם ביום במשך 15 יום, לתת ציספלטין (3 מ"ג/ק"ג) תוך צפקית לקבוצה אחת כל 3 ימים ובסך הכל שש מנות, ולתת את קבוצת הביקורת עם אותו נפח של מי מלח רגילים.
4. למדוד את משקל הגוף ואת נפח הגידול של העכברים פעמיים בשבוע.
5. בתום הבדיקה מרדימים את העכברים (שלב 5.3), ושוקלים את הגידולים.

תוצאות

בסך הכל הושתלו 18 דגימות של סרטן בלוטת התריס, וחמישה מודלים PDX של סרטן בלוטת התריס נבנו בהצלחה (שיעור נטילת גידול של 27.8%), כולל ארבעה מקרים של סרטן בלוטת התריס לא ממוין ומקרה אחד של סרטן בלוטת התריס אנפלסטי. נבדק הקשר בין שיעור ההצלחה של בניית המודל לבין גיל, מין, קוטר הגידול, דרגת הגידול והבידו...

Discussion

מחקר זה ביסס בהצלחה את המודלים התת-עוריים PDX של ATC ו-HNSCC. ישנם היבטים רבים שיש לשים לב אליהם במהלך תהליך בניית מודל PDX. כאשר רקמת הגידול מופרדת מהמטופל, יש להכניס אותה לקופסת הקרח ולשלוח אותה למעבדה לחיסון בהקדם האפשרי. לאחר שהגידול מגיע למעבדה, על המפעיל לשים לב לשמירה על שדה סטרילי ולתרגל הל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.4 mm x 2.0 mm trocar	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-9065
Balb/c nude mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	401
Biosafety cabinet	Suzhou Antai	BSC-1300IIA2
Blade	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-0823
Centrifuge tube	Corning	430791/430829
Cryopreservation tube	Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd	/
Custodiol HTK-Solution	Custodiol	2103417
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	SIGMA-ALORICH	D5879-500mL
Electronic balance	METTLER	ME104
Electronic digital caliper	Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd	0-220
fetal bovine serum(FBS)	VivaCell	C04001-500
IBM SPSS Statistics 26	IBM
Ketamine	Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd	100761663
Lenvatinib	ApexBio	A2174
NOD-SCID immunodeficient mice	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	406
Pen-Strep Solution	Biological Industries	03-03101BCS
Petri dish	WHB	WHB-60/WHB-100
Saline	Sichuan Kelun	W220051705
Scissor	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-0110
Tweezer	Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd	18-1241
Vet ointment	Pfizer Inc.	P10015353
Xylazine	Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd	070031777